XpertMTB/RIF在結(jié)核病診斷及利福平耐藥中的應(yīng)用

劉　婷，溫貴華，陳　伊，郭夏娜，鄧君麗

(深圳市寶安區(qū)慢性病防治院檢驗科，廣東深圳 518102)

·論著·

XpertMTB/RIF在結(jié)核病診斷及利福平耐藥中的應(yīng)用

劉婷，溫貴華，陳伊，郭夏娜，鄧君麗

(深圳市寶安區(qū)慢性病防治院檢驗科，廣東深圳 518102)

摘要:目的評價XpertMTB/RIF技術(shù)在診斷結(jié)核病及利福平耐藥中的臨床應(yīng)用價值。方法選取196例初診患者痰標本，分別進行抗酸染色涂片鏡檢、羅氏固體培養(yǎng)、比例法藥敏試驗和XpertMTB/RIF檢測，對XpertMTB/RIF檢測痰標本中結(jié)核分枝桿菌(MTB)和利福平耐藥性的敏感度和特異度，以及與金標準的一致性進行分析。結(jié)果以羅氏培養(yǎng)結(jié)果為金標準，XpertMTB/RIF方法檢測MTB的敏感度為94.62%(123/130)、特異度為87.88%(58/66)，kappa=0.828；以比例法藥敏試驗結(jié)果相比，XpertMTB/RIF方法檢測利福平耐藥的敏感度73.33%(11/15)，特異度為96.30%(104/108)，kappa=0.696。結(jié)論XpertMTB/RIF在結(jié)核病診斷和利福平耐藥檢測中敏感度和特異度較高，與傳統(tǒng)方法有很好的一致性，且更高效,快捷,安全,更符合成本-效益，值得推廣。

關(guān)鍵詞:XpertMTB/RIF；結(jié)核分枝桿菌；利福平

近年來，雖然對結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)研究已經(jīng)有了很大的進展，但是就成功控制結(jié)核病來說還是差強人意。在2013年，全球仍有新增近900 000的結(jié)核病患者和480 000的多重耐藥結(jié)核病(MDR-TB)患者。結(jié)核分枝桿菌感染已經(jīng)成為全球第二位引起死亡的獨立感染因素，僅次于HIV感染[1-2]。目前，在全球范圍內(nèi)有大約18%的MDR-TB和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)未被檢測出[3]，具備應(yīng)用現(xiàn)代技術(shù)的高效實驗室診斷系統(tǒng)是早期、快速、準確檢測TB的首要條件。一種新的結(jié)核分枝桿菌(MTB)分子檢測方法——XpertMTB/RIF試驗，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，該試驗為全自動半巢式實時熒光核酸擴增(PCR)技術(shù)，可在2 h之內(nèi)同時檢測MTB和利福平耐藥[4]。本研究通過用該方法對來本院就診196例結(jié)核病疑似患者的痰標本進行檢測,研究該技術(shù)診斷MTB及利福平耐藥的敏感度和特異度,并與傳統(tǒng)方法做比較，以評價其在結(jié)核病診治中的臨床應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1一般資料2014年12月至2015年2月來本院初診肺結(jié)核疑似患者200例，收集患者痰標本分別進行涂片染色鏡檢、痰TB培養(yǎng)、比例法藥敏試驗及XpertMTB/RIF檢測。其中有4例XpertMTB/RIF檢測結(jié)果報告為錯誤或無法判讀，最終有效例數(shù)為196例，其中涂陽134例，涂陰62例。

1.2研究方法抗酸染色涂片檢測，改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)，中性羅氏培養(yǎng)基比例法藥敏操作及結(jié)果判定。其操作均按《結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程》進行。XpertMTB/RIF核酸擴增檢測：按試劑說明書完成標本的前處理后加入檢測反應(yīng)盒，上機進行自動化檢測，1.5 h后反應(yīng)結(jié)束，可直接觀察測試結(jié)果。XpertMTB/RIF 檢測試劑盒購自美國Cepheid公司，抗酸染色液和羅氏固體培養(yǎng)基均購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0對XpertMTB/RIF檢測和檢測金標準進行一致性檢驗，kappa統(tǒng)計量的可接受范圍:kappa<0,一致性程度極差;0≤kappa≤0.2,一致性程度微弱;0.2

2結(jié)果

2.1XpertMTB/RIF對痰標本MTB的檢測使用XpertMTB/RIF對200例痰標本進行檢測，其中有4例XpertMTB/RIF檢測結(jié)果報告為錯誤或無法判讀。最終有效例數(shù)為196例.其中涂陽134例，涂陰62例。結(jié)果顯示，以羅氏固體培養(yǎng)結(jié)果為金標準，XpertMTB/RIF檢測涂陽患者MTB的敏感度為96.61%(114/118)、特異度為62.50%(10/16)；檢測涂陰患者MTB的敏感度為75.00%(9/12)、特異度為96.00%(48/50)；全部患者檢測的敏感度為94.62%(123/130)、特異度為87.88%(58/66)。對XpertMTB/RIF和固體培養(yǎng)進行kappa檢驗，kappa=0.828，兩者具有很好的一致性。對兩者McNemar檢驗，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　　XpertMTB/RIF檢測MTB效能分析(n)

2.2XpertMTB/RIF檢測痰標本中MTB對利福平的耐藥性分析XpertMTB/RIF結(jié)果顯示中同步給出了123例陽性標本的利福平的耐藥情況，其中涂陽114例，涂陰9例。與金標準結(jié)果相比較，XpertMTB/RIF方法檢測涂陽患者利福平耐藥的 敏 感 度 為 66.67%(8/12)、特 異 度 為98.04%(100/102)；檢測涂陰患者利福平耐藥的敏感度和特異度分別為100%(3/3)、66.67%(4/6)；全部患者檢測的敏感度為73.33%(11/15)、特異度為96.30%(104/108)。對兩者進行kappa一致性比較，kappa=0.696，兩者具有良好一致性。McNemar檢驗，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　　XpertMTB/RIF檢測MTB培養(yǎng)陽性標本對

表3　　XpertMTB/RIF對痰標本MTB分級與固體

2.3XpertMTB/RIF對痰標本的分級與固體培養(yǎng)分級的一致性分析XpertMTB/RIF對MTB的檢測結(jié)果由檢測系統(tǒng)直接給出，MTB 檢出高：CT值小于16；MTB 檢出中等：CT值在16～<22；MTB 檢出低：CT 值在22～28；MTB 檢出極低：CT值大于28；MTB未檢出：CT值大于38。分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果由人工肉眼判讀：++++，菌落布滿全斜面；+++，菌落布滿斜面達3/4；++，菌落布滿斜面達2/4；+，菌落布滿斜面達1/4；陰性，無菌落生長。具體分級情況見表3。對XpertMTB/RIF痰標本的分級與固體培養(yǎng)分級進行一致性檢驗，kappa=0.607，兩者具有良好的一致性。

3討論

由于MTB 耐多藥菌株的出現(xiàn)，且合并感染HIV，結(jié)核病的交叉感染及人口流動的增加等因素，使得結(jié)核病的防控難度越來越大。2009年全球結(jié)核病患者患病率只有63%[5]，2011年痰涂片陽性患者只占登記患者的56%。全球2013年新增有近900 000例的結(jié)核病患者和480 000例的MTD-TB患者。診斷延遲或漏診的情況在結(jié)核病合并感染HIV患者中極其常見并進一步加劇[6]，使大部分患者在治療前就已經(jīng)成為傳染源[7],進一步導(dǎo)致了再次耐藥的發(fā)生和新發(fā)病例數(shù)的逐年遞增[8]。如果能對結(jié)核病及其耐藥性做到早診斷，便有助于臨床早治療且盡早控制耐藥MTB的傳播。XpertMTB/RIF系統(tǒng)是一項將DNA提取、定量PCR擴增、MTB 特異核酸和利福平耐藥基因熒光檢測集于一身的全自動分子診斷方法。

本研究以羅氏固體培養(yǎng)法和比例法藥敏試驗為金標準，將XpertMTB/RIF與這兩種傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果進行比對，來評價其在檢測痰標本中的MTB及利福平耐藥中的應(yīng)用價值。與羅氏培養(yǎng)結(jié)果相比，XpertMTB/RIF檢測涂陽與涂陰患者MTB的敏感度分別為96.61%和75.00%，這與Boehme等[9]的研究結(jié)果相似。總體檢測MTB的敏感度為94.62%、特異度為87.88%，且XpertMTB/RIF與羅氏固體培養(yǎng)具有很好的一致性(kappa=0.828)，這與國內(nèi)學(xué)者張治國等[10]的試驗結(jié)果相似，他們的研究發(fā)現(xiàn) XpertMTB/RIF檢測MTB的敏感度和特異度分別為95.00%、89.60%，與Bowles等[11]相 關(guān) 報 道 相 比 較，特異度略低，可能是由于國外多以液體培養(yǎng)作為金標準，而本研究中金標準為羅氏固體培養(yǎng)。同時，本研究還對XpertMTB/RIF檢測MTB的分級情況與金標準固體培養(yǎng)的分級情況做了一致性分析，發(fā)現(xiàn)兩者一致性相對較差(kappa=0.607)。

本研究結(jié)果顯示，在檢測利福平耐藥方面，XpertMTB/RIF和金標準比例法藥敏試驗具有較好的一致性，雖然kappa系數(shù)小于0.750，這可能是由于樣本量不夠大的原因造成的，經(jīng)進一步對兩者行McNemar檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Boehme等[9]的試驗中XpertMTB/RIF對利福平耐藥的檢測敏感度為97.60%、敏感菌株檢測敏感度為98.10%。Blakemore 等[12]檢測利福平耐藥的敏感度和特異度均為100.0%。而在本研究中，XperMTB/RIF檢測MTB對利福平耐藥特異性為96.30%，敏感度僅為73.33%。這可能是因為納入本研究的研究對象均為結(jié)核病初治患者，因此樣本中最終對利福平耐藥的例數(shù)過少，在130例固體培養(yǎng)陽性的患者中，僅15例表現(xiàn)為利福平耐藥。

在臨床上，由于痰結(jié)核病涂片陰性的MTB患者確診需依靠MTB培養(yǎng)，而MTB培養(yǎng)時間長，且要求標本中含有活菌。而臨床上合格的標本又不易獲取，尤其是在復(fù)治患者。故MTB涂陰菌培養(yǎng)陽性的標本中，應(yīng)用XpertMTB/RIF 試驗，結(jié)核病的檢測敏感度仍能達到75.00%，其中檢測涂陰患者利福平耐藥的敏感度為100.00%。雖然檢測涂陰培陽的效能與金標準還是有一定距離，但仍提示XpertMTB/RIF試驗的臨床應(yīng)用價值高于結(jié)核病涂片；并且其同時檢測出了利福平耐藥，比傳統(tǒng)方法先做培養(yǎng)再進行藥敏試驗節(jié)省了最少30 d的時間，有利于臨床的早診斷、早治療。

XpertMTB/RIF 為單墨盒反應(yīng)裝置，將樣品準備所需的所有試劑都提前裝入可以密封的一次性反應(yīng)盒中，整個過程在封閉的腔室內(nèi)自動化完成，從加樣到出結(jié)果，2 h便可完成。與傳統(tǒng)固體培養(yǎng)及藥敏試驗相比，具備以下諸多優(yōu)點：(1)對實驗操作人員和周圍環(huán)境安全，減少氣溶膠的產(chǎn)生;如此便減少了操作過程中污染[13]；(2)其為全封閉全自動分子診斷方法，對操作人員的技術(shù)水平和實驗室硬件設(shè)備的要求不高，生物安全要求低，具備生物安全柜就可操作，且操作簡單，可在普通實驗室條件下進行，易在基層醫(yī)院推廣[14]；(3)從本研究及之前國內(nèi)外學(xué)者的研究中都可以看到，XpertMTB/RIF在檢測MTB效能及利福平耐藥方面都有很好的敏感度和特異度，且整個實驗在2 h之內(nèi)即可完成，遠遠低于培養(yǎng) (2個月)、培養(yǎng)藥敏(3個月) 的報告時間。為臨床及時診治爭取了大量的寶貴時間。特別是對于涂陰培陽同時又存在利福平耐藥的患者，之前，“涂陰”患者從接受檢測到開始治療一般需要58 d，應(yīng)用XpertMTB/RIF可縮短到4 d[15]。

因此，在2010年12月，世界衛(wèi)生組織(WHO)將XpertMTB/RIF譽為突破性結(jié)核病診斷方法面向全球推薦[16]，2013年5月，WHO推薦對結(jié)核病疑似患者率先使用XpertMTB/RIF方法檢驗，并建議XpertMTB/RIF可用于涂片陰性病例的進一步檢測[17]。之前有學(xué)者報道該技術(shù)檢測費用較昂貴，每例標本的檢測成本約10美元[18]。但我國學(xué)者研究表明傳統(tǒng)方法檢測每例結(jié)核病患者所需成本為172.57元，檢測每例耐藥結(jié)核病患者的平均成本為208.84元。而XpertMTB/RIF檢測每例結(jié)核病及利福平耐藥的成本僅為118.62元，比傳統(tǒng)方法更經(jīng)濟[19]。當然，該技術(shù)也存在弊端，即不能同時檢測異煙肼耐藥，而根據(jù)臨床資料發(fā)現(xiàn)，如果患者是異煙肼耐藥卻利福平敏感，用傳統(tǒng)的治療方案會降低治愈率，這將增加MDR-TB發(fā)生的概率[20]。

綜上所述，XpertMTB/RIF試驗在檢測MTB和利福平耐藥方面均與金標準表現(xiàn)出良好的一致性。且與傳統(tǒng)方法相比，具有檢測耗時短，生物安全級別高，成本低廉等優(yōu)點。適合在我國基層實驗室推廣。目前XpertMTB/RIF試驗在國內(nèi)尚處于試驗階段，還沒有普遍在臨床實驗室中得到推廣，且已發(fā)表的中文相關(guān)文獻較少。因此有待在國內(nèi)開展更多的此類研究，為其在國內(nèi)的臨床應(yīng)用提供更多的可靠數(shù)據(jù)。

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The application of XpertMTB/RIF in TB diagnosis and rifampicin resistance testing

LiuTing,WengGuihua,Chenyi,GuoXiana,DengJunli

(DepartmentofClinicalLaboratory,Bao′anHospitalofChronicDiseasesControlandPrevention,Shenzhen，Guangdong518102,China)

Abstract:ObjectiveTo evaluate the accuracy of XpertMTB/RIF assay in the diagnosis of tuberculosis and detection of rifampin resistance.MethodsAtotal of 196 initial diagnosis patients were recruited,sputum samples of these patients were tected by smear,solid culture,traditional proportion method drug susceptibility test and XpertMTB/RIF test.The sensitivity and specificity of XpertMTB/RIF method in detecting mycobacterium tuberculosis(MTB) and refampin resistance,and the consistency of this method comparted with the gold standard were andyzed.ResultsAccording to the solid culture result,the sensivivity and specificity of XpertMTB/RIF test in detecting tuberculosis were 94.62%(123/130) and 87.88%(58/66),kappa was 0.828;according to conventional drug susceptibility test result,the sensitivity and specificity in detecting rifampin resistance were 73.33%(11/15)and 96.30%(104/108)respectively,kappa was 0.696.ConclusionThe XpertMTB/RIF test has very high sensitivity and specificity,which also has a good consistency with the traditional method.It is a more efficient,rapid,safer and more cost-effective diagnosis tool for MTB and Rifampicin resistant.

Key words:XpertMTB/RIF;mycobacterium tuberculosis;rifampin

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.10.027

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)10-1368-03

(收稿日期：2015-11-04)

作者簡介：劉存芬，女，副主任技師，主要從事臨床生化檢驗方向的研究。