細菌雙雜交系統(tǒng)的改進

王俊陽，王為善，趙華，楊克遷 天津科技大學　生物工程學院，天津　300457 中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京　000

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細菌雙雜交系統(tǒng)的改進

王俊陽1，王為善2，趙華1，楊克遷2
1 天津科技大學生物工程學院，天津300457
2 中國科學院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點實驗室，北京100101

王俊陽, 王為善, 趙華, 等. 細菌雙雜交系統(tǒng)的改進. 生物工程學報, 2016, 32(2): 231–240.

Wang JY, Wang WS, Zhao H, et al. The modified bacterial two-hybrid system. Chin J Biotech, 2016, 32(2): 231–240.

摘 要:解析蛋白質之間的相互作用，對理解調控和代謝等生物學過程具有重要意義。其中基于互補腺苷酸環(huán)化酶功能的細菌雙雜交系統(tǒng)是一種研究蛋白質之間相互作用的有效手段。本文在利用該系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)存在假陽性高的缺陷。進一步報告基因活性分析表明產(chǎn)生假陽性的原因是不同克隆的生理狀態(tài)影響了LacZ的輸出，即lacZ啟動子除了受cAMP信號分子的控制，還受到其他調控蛋白的直接或間接的調控。為了降低生理因素對報告基因的影響，我們向該系統(tǒng)引入用多拷貝lacZ啟動子控制的gfp報告基因。這不僅通過增加lacZ啟動子的數(shù)量，弱化了生理因素的影響；還實現(xiàn)了第二個報告基因gfp與lacZ同時報告蛋白質之間的相互作用情況，提高了輸出的準確性。系統(tǒng)的實驗驗證表明，我們改進的細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏性確實得到大幅提高。

關鍵詞:細菌雙雜交系統(tǒng)，靈敏性，蛋白質相互作用，改進

Received: April 5, 2015; Accepted: May 21, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31400034, 31130001), the Ministry of Science and Technology of China (No. 2013CB734001).

國家自然科學基金 (Nos. 31400034, 31130001)，國家科技部基金 (No. 2013CB734001) 資助。

網(wǎng)絡出版時間：2015-06-08網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150608.1423.004.html

基于腺苷酸環(huán)化酶的細菌雙雜交系統(tǒng)利用了百日咳博代桿菌Bordetella pertussis中cya基因編碼的鈣調蛋白 (CaM) 依賴性腺苷酸環(huán)化酶激活區(qū)可以分成T18和T25兩個相對獨立的功能片段[1]的特點，當這兩種片段在大腸桿菌BTH101 (cya–) 中作為兩個獨立的實體表達時，它們不能彼此識別與作用，因此不能互補大腸桿菌BTH101的cya–缺陷型性狀，表現(xiàn)為β-半乳糖苷酶活性很低，生長在涂有X-gal的平板上的菌落呈白色。若這兩個功能區(qū)分別與一對可相互作用的蛋白質融合表達，它們可形成有功能的腺苷酸環(huán)化酶，互補大腸桿菌BTH101的cya–缺陷型，使菌株的β-半乳糖苷酶活性上升，生長在涂有X-gal的平板上的菌落顯藍色[2-3]。因此可以方便地應用該雙雜交系統(tǒng)，通過藍白斑篩選來高效地鑒定蛋白質間的相互作用[4-7]。

與酵母雙雜交系統(tǒng)[8]相比，細菌雙雜交系統(tǒng)具有一些優(yōu)點[3]：大腸桿菌比酵母菌生長繁殖快、轉化效率高、遺傳操作方便，可進行快速高通量的研究[2]；適用范圍廣，可用于研究膜蛋白的相互作用[9]等，細菌雙雜交系統(tǒng)被廣泛應用于功能基因組學的研究[10]。但是，在使用過程中我們發(fā)現(xiàn)，細菌雙雜交系統(tǒng)和酵母雙雜交系統(tǒng)都具有檢測靈敏度不高，從而導致假陽性和假陰性高發(fā)的缺陷。因此，提高細菌雙雜交系統(tǒng)的檢測靈敏度，有助于該方法更廣泛地應用于研究細菌的蛋白質間的相互作用。

鏈霉菌能夠產(chǎn)生豐富的次級代謝產(chǎn)物[11]，目前臨床上應用的抗生素約2/3由該屬產(chǎn)生，因此鏈霉菌被稱為藥物合成的天然工廠[12]。對鏈霉菌的基礎及應用研究目前已深入展開，相對于其他原核生物，鏈霉菌具有較大的基因組和較復雜的調控系統(tǒng) (約8 M基因組，編碼約8 000多個基因，以及多達12%的基因編碼調控蛋白)[13-18]。近期研究表明，調控蛋白之間的相互作用形成的異源二聚體在調控過程中發(fā)揮著重要作用[19]。因此，研究鏈霉菌體內(nèi)相互作用的蛋白顯得尤為重要。我們希望采用基于腺苷酸環(huán)化酶的細菌雙雜交技術來篩選鏈霉菌已知靶蛋白的調控蛋白，但是在研究過程中發(fā)現(xiàn)此方法的檢測靈敏度較低，假陽性高發(fā)。為了使細菌雙雜交系統(tǒng)能夠更精確地用于篩找相互作用的蛋白質，本文以探究該細菌雙雜交系統(tǒng)靈敏度低的原因為切入點，進而根據(jù)具體原因采取相應策略，改進了此細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏度，為研究鏈霉菌及其他細菌蛋白質之間的相互作用提供更好的方法支撐。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質粒

大腸桿菌Escherichia coli JM109，E. coliBTH101 (cya–)[3]菌株和質粒pIJ8660[20]為本實驗室保存；質粒pKT25linker、pUT18Clinker、pT25-zip和pT18-zip由法國國家科學研究院Emmanuelle Bouveret惠贈[3]；質粒pKT25-scbR、pTW1、pTW2、pTW1-1、pTW1-2、pTW1-3、pTW1-4、pTW1-5和pTW1-6為本實驗室構建。

1.1.2試劑和酶

本研究所用Phusion DNA聚合酶，KOD plus DNA聚合酶，2×Taq mix和Taq DNA 連接酶均購自Biolink；dNTPs購自TaKaRa公司；高純質粒小量快速提取試劑盒和膠回收試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司；引物在上海英駿生物技術有限公司合成。

1.1.3主要儀器

超低溫冰箱 (DW-86L626)，酶標儀(Synergy H4 Hybrid Reader)，臺式離心機(Sorvall legend RT+ centrifuge)，PCR儀 (DNA Engine Peltier Thermo Cycler)。

1.1.4引物

本研究所用引物見表1。

1.2方法

1.2.1質粒的構建

構建質粒pKT25-scbR：以天藍色鏈霉菌Streptomyces coelicolor基因組為模板，用表1中的引物pKT25-scbR-F/R擴增基因scbR片段，以質粒pT25zip為模板，用表1中pKT-F/R引物擴增pKT25骨架片段，擴增出的基因片段經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分析后，用膠回收試劑盒回收DNA片段，兩個片段Gibson組裝連接[21]。

構建質粒pTW1：分別以質粒pT25-zip和pT18-zip為模板，用表1中引物pTW1-18-F/R 和pTW1-F/R擴增基因片段T18，以及pTW1-25骨架，兩個片段Gibson組裝連接[21]。

構建質粒pTW2：以pIJ8660為模板，用表1中引物pTW2-gfp-F/R擴增gfp片段，以E. coli BTH101為模板用表1中引物pLac-F/R擴增LacZ啟動子序列，同時以pUT18Clinker為模板，用引物pTW2-F/R擴增pTW2骨架，3個擴增片段用Gibson法組裝成質粒[21]。

構建質粒pTW1-1：用表1中引物pTW1-1-18-F/R和pTW1-1-F/R，分別以質粒pT18-zip和pT25-zip為模板進行PCR反應，將產(chǎn)物用Gibson體系組裝[21]。

構建質粒pTW1-2：以pT18-zip為模板，pTW1-2-18-F/R為引物，PCR擴增出T18基因序列，以pT25-zip質粒為模板，用pTW1-2-F/R引物擴增pTW1-2質粒骨架，Gibson組裝構建質粒[21]。

構建質粒pTW1-3：以質粒pKT25-scbR為模板，用表1中引物pTW1-3ScbR-F/R進行PCR擴增，得ScbR基因片段，以質粒pTW1-2為模板，用表1中pTW1-3-F/R引物進行PCR，得到pTW2-3骨架片段，Gibson連接兩個片段[21]。

構建質粒pTW1-4；以天藍色鏈霉菌基因組為模板，分別以表1中pTW1-4bldM-F/R和pTW1-4whiI-F/R為引物擴增DNA片段bldM和whiI，以pT18-zip質粒為模板，引物用表1中的pTW1-4-18-F/R，擴增T18片段；以質粒pTW1-1為模板，以表1中的pTW1-4-F/R為引物，擴增pTW1-4的線性DNA序列，將4個DNA片段Gibson組裝[21]，構建質粒。

構建質粒pTW1-5：以天藍色鏈霉菌基因組為模板，以表1中pTW1-5bldm-F/R為引物擴增DNA片段bldM，以質粒pTW1-3為模板，用表1中引物pTW1-5-F/R，擴增pTW1-5線性片段，兩片段Gibson組裝構建環(huán)狀質粒[21]。

表1　本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

構建質粒pTW1-6：以天藍色鏈霉菌基因組為模板，以表1中pTW1-6whiI-F/R為引物擴增DNA片段whiI，以質粒pTW1-3為模板，用表1中引物pTW1-6-F/R，擴增pTW1-6線性片段，兩片段Gibson組裝構建環(huán)狀質粒[21]。上述質粒的具體構建方法參考文獻[22]。

1.2.2細菌雙雜交系統(tǒng)假陽性評價方法

將天藍色鏈霉菌中的重要調控蛋白ScbR的編碼基因與細菌雙雜交系統(tǒng)中的T25片段融合構建成質粒pKT25-ScbR，轉化質粒pKT25-ScbR與質粒pUT18Clinker入BTH101菌中 (實驗組同時作為陰性對照)，并設置陽性對照 (質粒pT25-zip和pT18-zip同時轉化入BTH101)、陰性對照1 (pKT25linker和pUT18Clinker質粒同時轉化入BTH101) 和陰性對照2 (質粒pT25-zip 和pUT18Clinker同時轉化入BTH101)，經(jīng)過轉化獲得外源質粒的菌被涂布于含有合適抗生素的LB平板上 (含0.5 mmol/L IPTG和40 μg/mL X-gal)，30 ℃培養(yǎng)48 h 后，觀察LB-X-gal平板上菌落的顯色反應。

1.2.3細菌雙雜交系統(tǒng)酶活檢測方法

β-半乳糖苷酶酶活測定方法參考Battesti等的方法[3]。

1.2.4細菌雙雜交系統(tǒng)的改進策略

將構建的質粒pTW1-2和pWT2同時轉入E. coli BTH101菌中，作為陰性對照1，陰性對照2為含有外源質粒pTW1-3和pWT2的E. coli BTH101菌，獲得質粒pTW1-1和pTW2的E. coli BTH101菌作為陽性對照組，通過和假陽性評價方法中一樣的操作步驟，觀察各個LB-X-gal平板上菌落的顯色情況，并分析β-半乳糖苷酶的活性，同時，從每個平板上挑取單菌落接入液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，再從每種培養(yǎng)液中取出200 μL (共取4次) 置于96微孔板中，用酶標儀 (激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為529 nm) 檢測蛋白GFP的熒光值[23]。

1.2.5改進的細菌雙雜交系統(tǒng)的驗證方法

用天藍色鏈霉菌蛋白BldM或WhiI的編碼基因分別與T18和T25融合構建質粒pTW1-5 或pTW1-6，把基因bldM和whiI共同插入pTW1質粒與T25和T18融合構建pTW1-4質粒，然后將質粒pTW1、pTW1-4、pTW1-5、pTW1-6分別與質粒pTW2共同轉化入E. coli BTH101(其中共同轉入質粒pTW2和pTW1-4的一組為陽性對照，其余組合為陰性對照)，按照與上步方法一樣的操作，觀察LB-X-gal平板上菌落的顯色情況，分析酶活，同時用酶標儀檢測報告基因gfp的熒光值。

2　結果與分析

2.1細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏度分析

在基于腺苷酸環(huán)化酶的細菌雙雜交系統(tǒng)中，質粒pKT25linker和pUT18Clinker分別含有腺苷酸環(huán)化酶激活區(qū)的T25和T18兩個相對獨立的功能片段；質粒pT25-zip和pT18-zip含有能相互作用的zip基序 (Leucine zipper motif)[24]，用于表達融合蛋白T25-zip和T18-zip。通過兩個zip之間的互作，可以重建腺苷酸環(huán)化酶的活性[3]。為了篩找能與天藍色鏈霉菌調控蛋白ScbR互作的調控蛋白，我們構建質粒pKT25-ScbR，希望通過該細菌雙雜交技術篩選與其相互作用的蛋白。

首先對該細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏性進行評鑒，結果表明，陽性對照E. coli BTH101 (pT25-zip+pT18-zip) 的菌落能夠在X-gal平板上顯藍色 (圖1A)，陰性對照E. coli BTH101(pKT25linker+pUT18Clinker) 的菌落在X-gal平板上沒有顯藍色 (圖1B)；然而隨著培養(yǎng)時間的延長，陰性對照1的克隆也會逐漸顯藍色 (結果未展示)。而另外兩組陰性對照E. coli BTH101 (pKT25-scbR+pUT18Clinker) 和E. coli BTH101 (pT25-zip+pUT18Clinker) 在X-gal平板上有部分克隆卻顯示為藍色 (圖1C和1D)，這些結果表明該細菌雙雜交系統(tǒng)的LacZ報告輸出不靈敏，單純的靠顯色反應分辨陽性克隆存在一定的假陽性。

圖1　藍白斑評價細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏性Fig. 1 The phenotype of different clones. (A) The phenotype of E. coli BTH101 (pT25-zip+pT18-zip). (B) The phenotype of E. coli BTH101 (pKT25linker+pUT18Clinker). (C) The phenotype of E. coli BTH101 (pKT25-scbR+ pUT18Clinker). (D) The phenotype of E. coli BTH101 (pT25-zip + pUT18Clinker). The transformants were spreaded on plates with 0.5 mmol/L IPTG and 40 μg/mL X-gal.

2.2LacZ酶活分析

為了分析該細菌雙雜交系統(tǒng)依靠藍白斑顯色反應鑒定陽性克隆不靈敏的原因，隨機挑取以上克隆，進一步對LacZ活性進行定量分析，結果表明陰性對照E. coli BTH101 (pKT25-scbR+ pUT18Clinker) 和陰性對照E. coli BTH101 (pT25-zip+pUT18Clinker) 不同的克隆之間有較大的酶活差異，而陽性對照E. coli BTH101 (pT25-zip+pT18-zip) 和陰性對照E. coli BTH101 (pKT25linker+pUT18Clinker) 的酶活相對比較穩(wěn)定 (圖2)。這表明該細菌雙雜交系統(tǒng)靈敏度低的原因確實是由于不同克隆間LacZ酶活有較大差異造成的。陽性克隆中，lacZ基因的表達響應的是腺苷酸環(huán)化酶產(chǎn)生的cAMP信號，而在假陽性克隆中，由于存在非特異性相互作用，存在cAMP和除cAMP信號之外的其他生理因素對lacZ表達的影響，如在該系統(tǒng)中，除了cAMP和激活蛋白CAP結合后激活了lacZ基因的啟動子[3]，lacZ啟動子還受到LacI等其他調控蛋白的直接或間接調控，所以不同克隆的生理狀態(tài)也可能會影響lacZ的表達。

圖2　細菌雙雜交系統(tǒng)LacZ輸出的靈敏性分析Fig. 2 The sensitivity of LacZ assay of bacterial two-hybrid system. The box-plot indicates the range of LacZ activities of random picked clones from selection plates. Box and Whisker plots provide a simple description of a distribution of values by depicting the 25 th and the 75 th percentile values as the bottom and top of a box, respectively. The median is depicted as a line across the box. The values are± sfrom three independent experiments.

2.3細菌雙雜交系統(tǒng)的改進

在該細菌雙雜交系統(tǒng)中，蛋白質之間相互作用產(chǎn)生的cAMP信號為控制LacZ輸出的主效信號，而其他的生理因素為非主效信號。因此為了提高該系統(tǒng)的靈敏度，應該降低本底cAMP信號 (非特異性相互作用產(chǎn)生cAMP信號) 和非主效的生理因素對該系統(tǒng)的影響。我們通過增加lacZ啟動子的數(shù)量來緩沖本底cAMP信號和非主效的生理因素的影響，同時，為了提高雙雜交系統(tǒng)的報告基因輸出的靈敏性，降低假陽性發(fā)生的概率，采用了第二個報告基因gfp。改進后的雙雜交系統(tǒng)，含有用lacZ啟動子控制的gfp報告基因的低拷貝質粒pWT2 (圖3A)，因此該系統(tǒng)兼具藍白斑高效篩選和GFP高效定量的雙重優(yōu)勢。

實驗結果表明，陰性對照E. coli BTH101 (pTW1-2+pWT2) 和E. coli BTH101 (pTW1-3+ pWT2) 的檢測結果都明顯低于陽性對照E. coli BTH101 (pTW1-1+pWT2) (圖3B和3C)。同時，GFP作為報告輸出的靈敏性明顯好于LacZ。這可能是因為gfp在游離質粒上擁有多個拷貝，測得的GFP結果為多個lacZ啟動子的綜合效應，顯著抵消了非特異信號和生理擾動；而lacZ只在基因組上存在一個拷貝，所以報告輸出的結果的相對差異略大于GFP?？傊瑹o論用LacZ活性分析還是GFP熒光強度分析，改進的細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏性確實得到了明顯的改善。

2.4改進的細菌雙雜交系統(tǒng)的驗證

Mark J. Buttner課題組最近報道天藍色鏈霉菌的BldM和WhiI蛋白之間存在相互作用[19]。為了驗證改進的雙雜交系統(tǒng)的靈敏性，分別將BldM或WhiI與T25融合構建質粒pTW1-5或pTW1-6 (圖3A)，以及把BldM、WhiI分別插入pTW1質粒，與T25和T18融合構建pTW1-4質粒 (圖3A)。然后測試雙雜交系統(tǒng)對它們的響應，結果如圖4所示，表明改進后的雙雜交系統(tǒng)測試的BldM和WhiI相互作用的結果與結果3中Zip相互作用的結果相似：無論GFP還是LacZ輸出的陽性結果都顯著高于各個陰性對照。因此，改進后的細菌雙雜交系統(tǒng)具有更靈敏的報告輸出，能夠明顯降低假陽性的發(fā)生。

圖3　改進的細菌雙雜交系統(tǒng)Fig. 3 The improved bacterial two-hybrid system. (A) The plasmids of the improved bacterial two-hybrid system. (B) The evaluation of the GFP output of the improved bacterial two-hybrid system. (C) The evaluation of the LacZ output the improved bacterial two-hybrid system. The values are± sfrom three independent experiments.

圖4　改進的細菌雙雜交系統(tǒng)的驗證Fig. 4 The verification assays of the GFP and LacZ output of the improved bacterial two-hybrid system. Green fluorescence and LacZ activity of different strains was measured after incubation in LB medium for 24 h. The values are± sfrom three independent experiments.

3　討論

蛋白質之間的相互作用具有重要的生物學意義，基于腺苷酸環(huán)化酶功能互補的細菌雙雜交系統(tǒng)在鑒定原核生物蛋白之間相互作用中具有無可比擬的優(yōu)勢[25]。但是也存在靈敏度不高等問題[26]。本工作中，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)靈敏度不高的原因是本底cAMP信號及其他內(nèi)源調控系統(tǒng)對lacZ啟動子的擾動造成的。針對這一發(fā)現(xiàn)，本工作創(chuàng)造性地采用了增加lacZ啟動子的拷貝數(shù)來緩沖這些內(nèi)源生理擾動的策略，并收到良好的效果；同時為了更精確地檢測細菌雙雜交系統(tǒng)的報告輸出，本工作采用了gfp和lacZ雙報告基因的策略，LacZ可以在平板上定性地高效篩選，GFP可以在液體培養(yǎng)中精確定量，同時檢測兩個不同的報告輸出將大大降低假陽性的發(fā)生。

測試改進的細菌雙雜交系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)，GFP輸出相對于LacZ輸出更為靈敏，這可能是由于gfp在質粒上，表現(xiàn)出多拷貝的累加效應，在一定程度上緩沖了本底cAMP信號和其他非主效生理因素的影響。另外，在利用改進的細菌雙雜交系統(tǒng)時，首先初步用藍白斑定性篩選，然后用GFP強度進行精確定量分析，將會收到更為理想的效果?？傊狙芯扛倪M的細菌雙雜交系統(tǒng)的靈敏性得到了顯著提高，有助于利用其更精確地研究原核生物蛋白質之間的相互作用。

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(本文責編郝麗芳)

The modified bacterial two-hybrid system

Junyang Wang1, Weishan Wang2, Hua Zhao1, and Keqian Yang2
1 Institute of Biological Engineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China
2 State Key Laboratory of Microbial Resource, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Abstract:Bacterial two-hybrid system is a newly developed method for studying protein-protein interactions. However, in our studies of the interaction of regulatory proteins in Streptomyces, it was found that the bacterial two-hybrid system is not sensitive enough by the blue-and-white selection on X-gal plate. To overcome this drawback, the reason of falsepositive clone was firstly determined, which was the disturbance of other direct or indirect regulation on lacZ promoter. Then the disturbance was diluted by introducing multicopy lacZ promoter, which drive another reporter gene gfp. By such design, the sensitivity of the modified bacterial two-hybrid system was significantly inproved and the two different reporters also help to decrease the rate of the false positive clones. Further the evaluation of the modified bacterial two-hybrid system indicated that the sensitivity was significantly improved.

Keywords:bacterial two-hybrid system, sensitivity, protein-protein interactions, improvement

Corresponding authors: Keqian Yang. Tel/Fax: +86-10-64807459; E-mail: yangkq@im.ac.cn Hua Zhao. Tel/Fax: +86-22-60601396; E-mail: zhaohua@tust.edu.cn