大麻二酚對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制

孫姣卓，王　雄，張　萍

大麻二酚對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用和機(jī)制

孫姣卓1，王雄2，張萍2

1.山西醫(yī)科大學(xué)(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

摘要：目的探討大麻二酚(CBD)對大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法將健康雄性的SD大鼠32只，隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、缺血再灌注組(I/R組)、大麻二酚組和大麻二酚腺苷A1阻斷劑(DPCPX)處理組，每組8只，結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)30 min，再灌注120 min，建立大鼠心肌缺血/再灌注模型。蘇木素伊紅染色法在光鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)改變，免疫組織化學(xué)法測定心肌組織中Bcl-2、Bax表達(dá)，黃嘌呤氧化酶法測定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性，硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)濃度。結(jié)果與I/R組相比，大麻二酚組蘇木素伊紅染色心肌組織損傷小，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)增多，Bax表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；血清SOD活性較高，MDA濃度較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)加腺苷A1阻斷劑(DPCPX)后大麻二酚保護(hù)心肌I/R損傷作用減弱。結(jié)論大麻二酚保護(hù)大鼠心肌I/R損傷，其可能作用機(jī)制是通過腺苷A1途徑抗凋亡、抗氧自由基等方面發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：心肌缺血再灌注損傷；大麻二酚；細(xì)胞凋亡；氧自由基

多發(fā)性硬化、舞蹈病、阿爾茨海默病、癲癇等仍是神經(jīng)內(nèi)科棘手的疾病。大麻二酚(CBD)目前在臨床已用于治療痙攣、多發(fā)性硬化、舞蹈病、疼痛、炎癥[1-4]，具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡作用[5]。不少研究認(rèn)為大麻二酚具有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用，對癲癇、阿爾茨海默病有一定治療前景[6-8]。所有這些藥理活性證明它具有保護(hù)組織潛在作用。又有研究認(rèn)為大麻二酚在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病同時可以保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。對于患有多發(fā)性硬化、舞蹈病同時存在心肌缺血再灌注損傷的病人，大麻二酚具有雙重優(yōu)勢。Walsh等[9]發(fā)現(xiàn)大麻二酚(50 μg/kg 靜脈注射)可減少大鼠缺血再灌注心肌梗死面積，減少損傷炎性介質(zhì)的釋放；Durst等[10]也證明長時間應(yīng)用大麻二酚可以減少缺血再灌注損傷。并有研究者發(fā)現(xiàn)大麻二酚可減少兔子缺血再灌注的心肌，左心室結(jié)構(gòu)大小，改善收縮壁的厚度，促進(jìn)心功能恢復(fù)等[11]。本實驗擬通過觀察大麻二酚對大鼠心肌缺血再灌注損傷時心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2、Bax)的表達(dá)及氧自由基釋放[超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)]作用，探討大麻二酚對心肌保護(hù)的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器大麻二酚(北京新奧源發(fā)有限公司，1 mg/mL，純度≥98.5%)，腺苷A1阻斷劑(DPCPX，Sigma公司 規(guī)格C101-25MG)，SOD、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；Bcl-2 Bax 免疫組化抗體(武漢博士德)；HX-200動物呼吸機(jī)(成都泰盟科技有限公司)；rm6240B型生理實驗系統(tǒng)(成都儀器廠)；Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)(美國Aperio公司)。

1.2動物分組和模型建立將32只雄性SD大鼠(230 g±30 g，北京提供)隨機(jī)分為4組，每組8只。假手術(shù)組：開胸只穿線不結(jié)扎血管，麻醉維持150 min；缺血再灌注(I/R)組：缺血30 min，再灌注120 min；大麻二酚組(CBD組)：缺血30 min，再灌注前10 min，股靜脈快速推注大麻二酚50 μg/kg[9]，之后再灌注120 min；大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組(CBD+DPCPX)：缺血30 min，冠狀動脈再通前15 min，股靜脈快速靜脈推注腺苷A1阻斷劑100 μg/kg[12]，前10 min股靜脈快速推注大麻二酚50 μg/kg，而后再灌注120 min。大鼠以20%烏拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉，仰位固定，針形電極插四肢皮下連續(xù)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電圖。設(shè)置微型動物呼吸機(jī)參數(shù)：呼吸頻率為60次/min，潮氣量8 mL～10 mL，吸呼比為1∶2。術(shù)區(qū)備皮消毒，沿大鼠頸部正中切開皮膚，鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露氣管，做倒“T”型切口，氣管插管，接微型動物呼吸機(jī)，觀察大鼠呼吸情況。于大鼠胸骨左緣第3～4肋間開胸，暴露心臟，剪開心包膜，大致定位冠脈左前降支走行(有時肉眼可見與其伴行的靜脈)，一般距左心耳下緣約2 mm處進(jìn)針穿線(6/0絲線)，肺動脈圓錐旁出針，進(jìn)針深度1 mm～1.5 mm，進(jìn)針寬度1.5 mm～2 mm，再讓線兩頭共同穿過一直徑約4 mm的自制乳膠套管，輕提絲線，并沿絲線輕輕下推套管，止血鉗夾閉套管造成心肌缺血，再灌注時松開止血鉗。以心電圖ST段明顯抬高或QRS波顯著增高、增寬，幾乎與T波融合，結(jié)扎線以下心肌顏色變暗、出現(xiàn)發(fā)紺為心肌缺血成功標(biāo)志。再灌注時ST段逐漸回落，心肌缺血區(qū)顏色逐漸轉(zhuǎn)為紅色、發(fā)紺消失。造模完成。將大鼠處死，取出心臟，用0.9%氯化鈉注射液沖洗后放置于10%的甲醛溶液中固定，以備心肌組織形態(tài)學(xué)觀察、免疫組化時用。血清與心肌組織標(biāo)本置于-20 ℃冰箱中保存，統(tǒng)一送檢。

1.3觀測指標(biāo)

1.3.1心肌HE病理組織學(xué)染色取缺血再灌注心肌組織常規(guī)脫水固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，蘇木素-伊紅染色，梯度乙醇脫水，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2Bcl-2、Bax免疫組化再灌注120 min后，快速摘取心臟，取缺血再灌注心肌組織，10%中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，切片，脫蠟至水，按試劑盒說明進(jìn)行Bcl-2、Bax，免疫組化染色，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水干燥，透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。在每張切片中隨機(jī)選取3個視野拍照。Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)測平均灰度值(與蛋白表達(dá)成反比)。

1.3.3血清SOD、MDA再灌注120 min后，腹主動脈采血，靜置15 min～20 min后離心(3 000 r/min)取上清液存于Peppercorn管至-20 ℃冰箱保存，按試劑盒測檢測MDA、SOD，721分光光度值測OD值。

2結(jié)果

2.1HE染色假手術(shù)組：心肌纖維排列整齊，無變性壞死與腫脹斷裂。I/R組：心肌纖維腫脹，排列紊亂，部分心肌纖維斷裂。與I/R組比較，大麻二酚組：心肌損傷有所減輕，心肌纖維輕度腫脹。與大麻二酚組比較，大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組：心肌損傷加重、心肌纖維腫脹。詳見圖1。

注：A1為假手術(shù)組；A2為I/R組；A3為大麻二酚組；A4為大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組。

圖1各組心肌組織HE染色(×400)

2.2Bcl-2、Bax免疫組化灰度值Bcl-2、Bax蛋白陽性反應(yīng)積聚于胞漿中，呈棕黃色(見圖2、圖3)。與假手術(shù)組比較，I/R組Bcl-2、Bax表達(dá)陽性細(xì)胞明顯升高(P<0.05)。與I/R組比較，大麻二酚組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞繼續(xù)升高，Bax表達(dá)陽性細(xì)胞減低(P<0.05)。與大麻二酚組比較，大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組Bcl-2表達(dá)陽性降低，Bax表達(dá)陽性細(xì)胞升高(P<0.05)。詳見表1。

表1　各組Bcl-2、Bax免疫組化灰度值比較(±s)

注：B1為假手術(shù)組；B2為I/R組；B3為大麻二酚組；B4為大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組

圖2各組大鼠心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(×400)

注：C1為假手術(shù)組；C2為I/R組；C3為大麻二酚組；C4大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組。

圖3各組大鼠心肌細(xì)胞Bax蛋白免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果(×400)

2.3血清SOD MDA吸光光度值與假手術(shù)比較，I/R組SOD水平降低，MDA水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與I/R組比較，大麻二酚組SOD水平升高，MDA水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與大麻二酚組比較，大麻二酚+腺苷A1阻斷劑組SOD水平較低，MDA水平較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2　各組血清SOD、MDA吸光光度值結(jié)果(±s)

3討論

缺血再灌注損傷過程中伴隨有心肌細(xì)胞凋亡、炎癥介質(zhì)滲出、氧自由基的大量釋放等[13]。細(xì)胞凋亡是一種有多種基因調(diào)控的細(xì)胞主動的死亡過程，其中Bcl-2基因家族是目前公認(rèn)的與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因，有研究表明當(dāng)細(xì)胞凋亡減弱時，Bcl-2表達(dá)增強(qiáng)；相反細(xì)胞凋亡增強(qiáng)時，Bcl-2表達(dá)減弱。Bax是Bcl-2家庭成員之一，其作用與Bcl-2相反，有對抗Bcl-2蛋白抗細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[14-15]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)大麻二酚組心肌細(xì)胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)較缺血再灌注組高，凋亡蛋白Bax表達(dá)較缺血再灌注組低，考慮大麻二酚通過升高抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，以及降低凋亡蛋白Bax表達(dá)來保護(hù)缺血再灌注損傷心肌，Stanley等[5]也有研究認(rèn)為大麻二酚具有抗凋亡、抗炎、抗氧化作用。

SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，當(dāng)機(jī)體內(nèi)氧自由基生成增加時，可導(dǎo)致體內(nèi)SOD消耗增加。MDA是氧自由基作用于不飽和脂肪酸所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[16]。因而，SOD活性的降低和MDA的增加，表明氧自由基的大量生長，亦間接反映細(xì)胞損傷程度。在心肌缺血再灌注損傷中有大量氧自由基產(chǎn)生。本實驗發(fā)現(xiàn)，大麻二酚組SOD活性較缺血再灌注組高，同時MDA濃度大麻二酚組較缺血再灌注組低，結(jié)果說明大麻二酚有清除氧自由基作用，可以通過升高體內(nèi)SOD活性，減低MDA活性來發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的作用。國外報道大麻二酚有抗氧化作用，但大麻二酚對SOD和MDA的作用報道甚少。

依據(jù)以上結(jié)果提示CBD可以抗缺血再灌注損傷，并且可能從抗凋亡、抗氧化發(fā)揮作用。CBD是競爭性平衡型核苷轉(zhuǎn)運體抑制劑，可以抑制細(xì)胞內(nèi)腺苷攝取，增加細(xì)胞外腺苷聚集，從而增加了內(nèi)生腺苷受體活性及腺苷信號途徑。大麻二酚通過增強(qiáng)腺苷信號傳導(dǎo)途徑激活腺苷A2受體具有抗炎作用[16-17]，并且Durst等[8]研究認(rèn)為大麻二酚可以通過增強(qiáng)腺苷途徑保護(hù)缺血再灌注損傷。

CBD可以增強(qiáng)腺苷信號，從而激活腺苷A1受體，我們假設(shè)CBD可以通過激活腺苷A1受體保護(hù)缺血再灌注損傷進(jìn)行試驗，加用腺苷A1阻斷劑，研究其抗凋亡、抗氧化機(jī)制。實驗結(jié)果提示加用DPCPX組較大麻二酚組Bcl-2表達(dá)減低，Bax表達(dá)升高，提示CBD+DPCPX組心肌細(xì)胞凋亡增多，推測DPCPX阻斷了腺苷A1的PKC途徑，使CBD對心肌保護(hù)作用減弱[18]；SOD活性較大麻二酚組低，MDA較高，可能DPCPX阻斷了腺苷A1清除氧自由基的能力[19]。推測大麻二酚可以保護(hù)缺血再灌注心肌的損傷，其機(jī)制可能分別是通過腺苷A1途徑中PKC途徑抗凋亡，清除氧自由基發(fā)揮抗氧化作用。此實驗結(jié)果與既往研究的大麻二酚通過激活腺苷途徑保護(hù)心肌缺血再灌注損傷一致。

綜上所述，認(rèn)為大麻二酚可以保護(hù)大鼠缺血再灌注損傷的心肌，機(jī)制可能為通過腺苷A1途徑，發(fā)揮抗凋亡、抗氧化的作用。對于受體后機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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(本文編輯郭懷印)

通訊作者：王雄，E-mail：sxwangxiong@163.com

中圖分類號：R542.2R256.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．02．008

文章編號：1672-1349(2016)02-0133-05

(收稿日期：2015-10-14)