UPLC法測(cè)定拉莫三嗪和奧卡西平活性代謝物血清藥物濃度

項(xiàng)茹菡，蔣玉鳳*，賈　莉，王婷婷，李紅健

UPLC法測(cè)定拉莫三嗪和奧卡西平活性代謝物血清藥物濃度

項(xiàng)茹菡1，蔣玉鳳1*，賈莉2，王婷婷2，李紅健2

1.安徽醫(yī)科大學(xué)新疆臨床學(xué)院，烏魯木齊 830001；2.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床藥學(xué)研究所，烏魯木齊 830001

[摘要]目的建立超高效液相色譜(UPLC)同時(shí)測(cè)定人血清中拉莫三嗪(Lamotrigine，LTG)和奧卡西平活性代謝物10-羥基卡馬西平(Monohydroxy-carbazepine，MHD)濃度的方法。方法色譜柱為Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)，柱溫30 ℃，流動(dòng)相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨(20∶80；甲酸調(diào)pH=4)，流速：0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。結(jié)果血清中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣本測(cè)定無(wú)干擾，LTG和MHD分別在1～40 μg/mL和1.25～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r分別是0.999 8和0.999 7。本方法兩個(gè)化合物準(zhǔn)確度RE值在±10%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間精密度RSD值均<10%，LTG回收率73%～80%，MHD回收率89%～97%。結(jié)論本法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好，符合生物樣品的分析要求，適用于LTG和奧卡西平活性代謝物MHD的濃度監(jiān)測(cè)。

[關(guān)鍵詞]UPLC；拉莫三嗪；奧卡西平；10-羥基卡馬西平；血藥濃度

0引言

癲疒間是一組由已知或未知病因所引起，腦部神經(jīng)元高度同步化，且常具自限性的異常放電所導(dǎo)致的綜合征[1-2]。臨床上常用的新型抗癲疒間藥物有拉莫三嗪(LTG)、奧卡西平(OXC)、托吡酯、左乙拉西坦等。其中OXC和LTG是癥狀性部分性癲疒間發(fā)作的首選藥物。OXC和LTG主要作用機(jī)制不同，臨床上經(jīng)常聯(lián)合用于治療頑固性部分性癲疒間，可以增加抗癲疒間療效，避免不良反應(yīng)疊加[3]。而這兩種藥物治療窗窄、血藥濃度個(gè)體差異大、不良反應(yīng)發(fā)生率高、服藥周期長(zhǎng)，且主要服藥人群兒童神經(jīng)系統(tǒng)處于發(fā)育階段，代謝動(dòng)力學(xué)不同于成人，為了便于調(diào)整劑量提高療效、降低不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)、提高服藥依從性，臨床上有必要對(duì)服用這兩種藥物的患者進(jìn)行定期血藥濃度監(jiān)測(cè)[4]。OXC是一種無(wú)活性的前體藥物，在體內(nèi)經(jīng)肝細(xì)胞內(nèi)的芳基酮還原酶幾乎全部轉(zhuǎn)化為10-羥基的卡馬西平(MHD)發(fā)揮藥理活性，臨床上通過監(jiān)測(cè)MHD濃度來評(píng)價(jià)OXC療效[5]。目前已有關(guān)于HPLC法同時(shí)測(cè)定LTG和MHD濃度的報(bào)道[6]，然而血清樣品提取方法復(fù)雜，靈敏度低，分析時(shí)間長(zhǎng)。本文在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上[7-8]，建立了靈敏度高、分離度高、分析效率高的UPLC同時(shí)測(cè)定人血清中LTG和MHD濃度的方法。

1材料與方法

1.1儀器超高效液相色譜(UPLC,美國(guó)Waters公司)；5430R型低溫冷凍離心機(jī)可調(diào)移液器(德國(guó)Eppendorf公司)；BP221S型萬(wàn)分之一分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；FJY1002-UVF基因研究型超純水機(jī)(青島富勒姆公司)；SK3200LHC型超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)公司)；WH-3微型漩渦混合儀(上海瀘西公司)。

1.2藥品與試劑LTG對(duì)照品(印度Divis公司，批號(hào):2-CRL-0880211,純度≥98%)；MHD對(duì)照品(大連生物美侖公司，批號(hào)：20140623，純度≥99%)；樣本前處理蛋白沉淀劑(美國(guó)Abbott公司,批號(hào)：20150127-308544)；色譜純乙腈、甲醇(美國(guó)Thermo Fisher公司)；超純水由富勒姆超純水機(jī)制備。

1.3方法

1.3.1色譜條件色譜柱為Waters ACQUITY UPLCTM BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)，流動(dòng)相：乙腈-10 mmol/L乙酸銨(20∶80；甲酸調(diào)pH=4)；流速：0.2 mL/min;柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別精密稱取LTG、MHD對(duì)照品10 mg置于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.3血液樣本處理將血液樣本3 500 r/min離心5 min，移液槍精密量取上層血清100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入樣本前處理蛋白沉淀劑200 μL，渦旋混合60～90 s后，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速低溫高速離心10 min。用1 mL注射器吸取上清液，經(jīng)0.22 μm針頭式過濾器過濾后，注入進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)插管中。

1.4方法學(xué)考察

1.4.1專屬性將LTG和MHD的對(duì)照品儲(chǔ)備液分別用甲醇稀釋成20 μg/mL的工作液先后進(jìn)樣得LTG和MHD對(duì)照品色譜圖。取不同來源健康人空白血清樣本，混合均勻后取100 μL按“1.3.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析得空白血清色譜圖。取混合均勻的空白血清80 μL，先后加入稀釋好的400 μg/mL的LTG工作液和MHD工作液10 μL，渦旋混勻后按“1.3.3”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣分析得加樣血清色譜圖。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限在90 μL空白血清中加入10 μL不同濃度的LTG、MHD，配制成梯度濃度的加樣血清樣品，按“2.3”項(xiàng)方法處理后進(jìn)樣，確定使S/N≥10的LTG、MHD濃度，即為定量下限。制備5個(gè)獨(dú)立的定量下限濃度血清樣本，進(jìn)一步驗(yàn)證其濃度是否使S/N≥10。

用甲醇將LTG和MHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度的工作液。取空白血清80 μL，分別加入10 μg/mL的LTG工作液10 μL、12.5 μg/mL MHD工作液10 μL，配制成LTG血清濃度1 μg/mL、MHD血清濃度1.25 μg/mL的血清樣品。按此法依次配制出LTG血清濃度1、2、4、8、10、20、40 μg/mL，MHD血清濃度1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL的血清樣品。按“1.3.3”項(xiàng)下方法操作后進(jìn)樣分析，將得到的峰面積作線性回歸，得到LTG、MHD標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4常溫穩(wěn)定性和凍存穩(wěn)定性分別制備LTG(4、10、40 μg/mL)和MHD(5、20、80 μg/mL)低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品各5份，放置于室溫(25 ℃)下0、6、12、24 h后處理進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。同樣制備LTG(4、10、40 μg/mL)和MHD(5、20、80 μg/mL)低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品各5份，放置于-20 ℃冰箱內(nèi)20 d，取出解凍后處理進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.4.5凍融穩(wěn)定性制備LTG(4、10、40 μg/mL)和MHD(5、20、80 μg/mL)低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品各5份放置于-80 ℃冰箱內(nèi)凍存，并反復(fù)凍融1、2、3次，每次冷凍時(shí)間均超過24 h。將樣品處理好后進(jìn)樣測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

1.4.6干擾性試驗(yàn)?zāi)壳耙咽占?6例服用LTG患者的血清和50余例服用OXC患者的資料，通過詢問，發(fā)現(xiàn)部分服用LTG、OXC的患者同時(shí)服用丙戊酸鈉、卡馬西平、左乙拉西坦托吡酯。在該方法下將丙戊酸鈉、卡馬西平及左乙拉西坦托吡酯對(duì)照品進(jìn)樣。

2結(jié)果

2.1專屬性LTG的保留時(shí)間是1.84 min，MHD的保留時(shí)間是2.67 min，兩個(gè)化合物在3 min全部出峰且峰型較好，分離度>1.5，對(duì)稱因子在0.95～1.05之間，柱效>8 000。藥物的測(cè)定不受血清內(nèi)源性物質(zhì)干擾。

圖1　拉莫三嗪和10-羥基卡馬西平的超高效液相色譜圖

注：A.LTG對(duì)照品,B.MHD對(duì)照品,C.空白血清,D.空白血清+LTG對(duì)照品+MHD對(duì)照品；1.LTG,2.MHD

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限LTG和MHD分別在1～40 μg/mL和1.25～80 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方法下兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別包含LTG參考有效血藥濃度2.5～15 μg/mL[9]、MHD有效血藥濃度10～35 μg/mL[10]，滿足臨床測(cè)定的需要。

表1　線性回歸方程和線性范圍

2.3準(zhǔn)確度、精密度和回收率本方法準(zhǔn)確度RE值在±15%范圍內(nèi)，批內(nèi)和批間精密度RSD值均<15%，回收率均>70%。符合生物樣品分析要求。見表2。

2.4常溫穩(wěn)定性和凍存穩(wěn)定性LTG和MHD室溫6、12、24 h測(cè)定的RE值均在±15%范圍內(nèi)，RSD值均<10%，樣本放置室溫下24 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。放置于-20 ℃冰箱內(nèi)20 d，藥物RE值均在±5%范圍內(nèi)，RSD值均<10%，表明樣本放置于-20 ℃冰箱內(nèi)20 d能保持穩(wěn)定。見表3。

2.5凍融穩(wěn)定性凍融測(cè)定計(jì)算得到RE值均在±15%范圍內(nèi)，RSD值均<10%，說明血清樣品在反復(fù)凍融3次的情況下仍保持穩(wěn)定。見表4。

表2　拉莫三嗪和10-羥基卡馬西平的準(zhǔn)確度、精密度、回收率(n=5)

表3　拉莫三嗪和10-羥基卡馬西平的常溫穩(wěn)定性和凍存穩(wěn)定性(n=5)

表4　拉莫三嗪和10-羥基卡馬西平的凍融穩(wěn)定性(n=5)

2.6干擾性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丙戊酸鈉不能在該方法下出峰，而卡馬西平、托吡酯不能在4 min內(nèi)出峰，100 μg/mL左乙拉西坦對(duì)照品進(jìn)樣后在0.8 min左右出峰，峰型較小且和溶劑峰相連。與空白血清色譜圖對(duì)照發(fā)現(xiàn)，該方法下左乙拉西坦峰在血清樣本中只能被血清峰掩蓋，排除了該方法下合用藥物的干擾。

圖2　左乙拉西坦對(duì)照品的超高效液相色譜圖

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇在摸索UPLC條件時(shí)，筆者曾選擇甲醇-水、乙腈-水、乙腈-乙酸鈉，然而對(duì)照品峰峰型呈不規(guī)則鋸齒狀，與溶劑峰始終有干擾。當(dāng)流動(dòng)相為甲醇-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-5 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L乙酸銨、乙腈-10 mmol/L乙酸銨(甲酸調(diào)pH=4)時(shí)，對(duì)照品峰型不再出現(xiàn)分叉，有較大的改善。經(jīng)過比較，其中流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L乙酸銨(甲酸調(diào)pH=4)的條件下，峰寬較窄，峰型較尖，柱效最高。

3.2流動(dòng)相比例的優(yōu)化當(dāng)乙腈∶10 mmol/L乙酸銨=30∶70時(shí)，溶劑甲醇、LTG對(duì)照品、MHD對(duì)照品分別在0.5、0.7、0.9 min左右出峰，1 min內(nèi)結(jié)束色譜分析。溶劑峰和LTG對(duì)照品、MHD對(duì)照品峰型和分離度均較好。在此條件下，進(jìn)樣空白血清和加對(duì)照品血清對(duì)比，發(fā)現(xiàn)血清中對(duì)照品峰包含有小的血清峰。經(jīng)過調(diào)整，乙腈∶10 mmol/L乙酸銨=20∶80，溶劑峰和LTG對(duì)照品、MHD對(duì)照品峰型和分離度較好，且不受小的血清峰干擾，同時(shí)測(cè)定兩種物質(zhì)可以在3 min內(nèi)完成。

3.3提取條件的優(yōu)化在優(yōu)化血清樣品的提取條件時(shí)，比較甲醇、乙腈、甲醇和乙腈混溶、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)試劑作為蛋白沉淀劑和雅培公司的樣本前處理蛋白沉淀劑的提取效果，發(fā)現(xiàn)有機(jī)試劑直接沉淀蛋白的效果皆不佳，色譜圖雜峰多，而成品蛋白沉淀劑以1∶2的比例就可以獲得理想的提取效果，色譜圖血清雜峰很少，提取回收率較高。

3.4進(jìn)樣量的確定當(dāng)進(jìn)樣量為5～10 μL，色譜圖完全是分叉峰。減少進(jìn)樣量<5 μL，峰尖不再圓鈍，色譜圖得到較大改善。繼續(xù)減少進(jìn)樣量至2 μL，色譜峰得到較高的柱效。

本實(shí)驗(yàn)所建立的UPLC同時(shí)測(cè)定人血清中LTG和OXC活性代謝物濃度的方法按2010版《中國(guó)藥典》[11]要求進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果符合生物樣本分析需要，并具有出峰時(shí)間短、操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，滿足臨床LTG和OXC活性代謝物濃度監(jiān)測(cè)的需要，更有助于醫(yī)生針對(duì)個(gè)體癲疒間患者調(diào)整劑量，提高療效，降低不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)，提高服藥依從性。

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Ultra performance liquid chromatography spectrometry method for the simultaneous quantification of lamotrigine and oxcarbazepine′s metabolite in human serum

XIANG Ru-han1,JIANG Yu-feng1*,JIA Li2,WANG Ting-ting2,LI Hong-jian2

(1.Xinjiang Clinical College of Anhui Medical University,Urumqi 830001,China;2.Clinical Pharmacy Institute of People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830001,China)

[Abstract]ObjectiveTo establish a method for the simultaneous determination of the concentration of lamotrigine and monohydroxy-carbazepine in serum by Ultra performance liquid chromatography with UV detector.MethodsSerum samples were separated on an ACQUITY UPLCTM BEH C18column (50 mm×2.1 mm,1.7 μm). The column temperature was maintained at 30 ℃ and chromatographic separation was achieved using mobile phase composition with UV detection at 240 nm;acetonitrile-10 mmol/L ammonium acetate solution (20∶80,v/v) (pH adjusted to 4.0 by formic acid) was delivered at a flow rate of 0.20 mL/min. The injection volume was 2 μL. ResultsThe concentration of lamotrigine and monohydroxy-carbazepine had no interference with the endogenous substance in serum. A good linearity was shown in the concentration range 1～40 μg/mL for LTG and 1.25～80 μg/mL for MHD.The linear correlation coefficient (r) was 0.999 8,0.999 7 for OXC and MHD respectively.The intra-day and inter-day precision and accuracy of the quality control samples were within 10.0%.The recoveries were 73%～80% and 89%～97% for OXC,MHD respectively.ConclusionThe method is convenient,accurate,sensitive and of good reproducibility.It conforms to the requirements of analysis in biological samples and is suitable for serum concentration monitoring of lamotrigine and monohydroxy-carbazepine.

Key words：Ultra performance liquid chromatography(UPLC);Lamotrigine;Oxcarbazepine;10-Monohydroxy-carbazepine;Serum concentration

收稿日期：2015-10-12

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院院內(nèi)資助課題(20140312)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605026