通腑化瘀湯對術(shù)后腸梗阻大鼠腸組織COX-2及Cajal間質(zhì)細(xì)胞表達的影響

張寶剛，陳蘇寧，梁靚靚，于　飛

·論著·

通腑化瘀湯對術(shù)后腸梗阻大鼠腸組織COX-2及Cajal間質(zhì)細(xì)胞表達的影響

張寶剛，陳蘇寧*，梁靚靚，于飛

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中醫(yī)科，沈陽 110004

[摘要]目的建立術(shù)后腸梗阻大鼠模型，觀察通腑化瘀湯對術(shù)后腸梗阻大鼠腸組織環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)及Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal，ICC)表達的影響，評估腸粘膜損傷程度，為臨床更好地防治術(shù)后腸梗阻提供有效的治療方劑和理論依據(jù)。方法取健康雄性SD大鼠45只，隨機分為通腑化瘀湯組(藥物組)、生理鹽水對照組(對照組)、空白組，藥物組和對照組給予開腹手術(shù)建立術(shù)后腸梗阻模型，手術(shù)后6、16 h時間點分別給予通腑化瘀湯藥液和生理鹽水各0.8 mL灌胃，空白組不給予手術(shù)處理。處死前取大鼠小腸遠(yuǎn)端距盲腸約5 cm的腸組織，采用HE染色顯微鏡下觀察腸粘膜損傷情況；免疫組織化學(xué)方法檢測c-kit蛋白(ICC特異性標(biāo)志物)和COX-2蛋白的平均光密度值。結(jié)果對照組與空白組相比，COX-2表達顯著提高(P<0.05)，c-kit表達顯著降低(P<0.05)，腸黏膜損傷程度較重；藥物組與對照組相比，COX-2表達顯著降低(P<0.05)，c-kit表達顯著提高(P<0.05)，損傷的腸粘膜得到一定程度修復(fù)。結(jié)論通腑化瘀湯能夠減少術(shù)后腸梗阻小腸組織COX-2的表達，改善ICC形態(tài)并提高ICC數(shù)量，抑制炎癥反應(yīng)，對受損傷的腸粘膜起到保護作用。

[關(guān)鍵詞]通腑化瘀湯；術(shù)后腸梗阻；COX-2；Cajal間質(zhì)細(xì)胞

0引言

術(shù)后腸梗阻(Postoperative ileus，POI)是由于腹部或非腹部手術(shù)而造成的，是手術(shù)創(chuàng)傷打擊后不可避免的胃腸動力障礙性疾病[1]，臨床上多表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹痛、腹脹、腸鳴音消失以及排氣排便延遲等一系列癥狀。腹部術(shù)后腸梗阻的處理是臨床最棘手的難題之一，是腹部手術(shù)后常見的并發(fā)癥。術(shù)后腸梗阻不僅延緩了患者術(shù)后康復(fù)速度，而且給患者的身心、家庭及經(jīng)濟均造成了較為沉重的負(fù)擔(dān)。

COX-2是一種促炎因子，COX-2的過度表達加劇炎癥反應(yīng)和組織損傷，對腸道平滑肌產(chǎn)生抑制作用，減弱消化道運動功能[2]。ICC是胃腸道的起搏細(xì)胞，位于胃腸道的許多區(qū)域，在胃腸運動調(diào)控中起著重要作用[3-5]。很多胃腸運動功能障礙性疾病如腸梗阻、糖尿病胃輕癱、慢性傳輸性便秘等，均存在ICC數(shù)量和功能的異常改變[6-8]。然而在POI中，ICC是否存在異常變化的報道較少。本研究以健康SD大鼠建立術(shù)后腸梗阻模型，觀察通腑化瘀湯對術(shù)后腸梗阻大鼠腸組織胃腸道起搏細(xì)胞ICC及促炎因子COX-2表達的影響，更好地為POI的預(yù)防及治療提供有效手段。

1材料與方法

1.1動物SD大鼠45只，均為雄性，體重(200±20)g，中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實驗室提供，實驗動物使用許可證編號：SYXK(遼)2010-0098。由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物管理中心飼養(yǎng)。

1.2藥品與試劑通腑化瘀湯(組方：生大黃15 g、枳實10 g、厚樸10 g、黃芪20 g、丹參15 g、炙甘草6 g)由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院中藥局提供，用溫開水將其完全溶解，制成濃度為1 g/mL的藥液。兔抗大鼠COX-2抗體和兔抗大鼠c-kit抗體均購自博奧森公司，免疫組化檢測試劑盒購自福州邁新公司，DAB試劑盒購自北京中杉公司。

1.3動物分組、模型的建立、給藥與取材將健康雄性SD大鼠45只隨機分為通腑化瘀湯藥物組(藥物組)、生理鹽水對照組(對照組)、空白組，每組15只。按照中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗室動物房標(biāo)準(zhǔn)進行分籠常規(guī)飼養(yǎng)1周，溫度控制在25 ℃，濕度控制在50%。給予藥物組和對照組共30只大鼠行腹部手術(shù)，具體方法如下：①大鼠手術(shù)前禁食24 h，可飲水。②5%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔內(nèi)注射麻醉。③麻醉后腹部備皮，碘伏消毒，溫生理鹽水浸濕的紗布中間開一長約2～3 cm的開口鋪在下腹部正中；無菌條件下于下腹部正中線做一個長約2 cm的切口，依次切開皮膚、腹壁肌肉后進腹，暴露腹腔。④用生理鹽水濕棉簽在腹腔內(nèi)找到回盲部，輕輕移出盲腸及全部小腸外置于濕紗布之上；用生理鹽水濕棉球由回盲部小腸末端自下而上擦拭全部小腸腸管，力度均勻，時間20 min，注意防止損傷腸系膜血管以保護腸管勿缺血壞死。⑤然后用生理鹽水濕棉簽按順序?qū)⑷磕c管放回腹腔，注意防止小腸扭轉(zhuǎn)。⑥用手術(shù)縫合線連續(xù)縫合腹膜肌肉、間斷縫合皮膚，關(guān)腹。⑦術(shù)后將大鼠置于暖燈下恢復(fù)2 h，麻醉清醒后禁食不禁水。⑧手術(shù)后24 h重新開腹切取遠(yuǎn)端小腸(距離盲腸5 cm處)全層標(biāo)本長約1.0 cm，剔去腸脂垂，PBS洗凈腸內(nèi)容物，分別置于4%多聚甲醛和-80 ℃冰箱保存。通腑化瘀湯藥物組:腹部手術(shù)后6、16 h，均給予大鼠通腑化瘀湯0.8 mL灌胃(根據(jù)等效劑量比值表計算60 kg成人76 g/d藥物，即1.267 g/(kg·d)，等效換算至大鼠為7.92 g/(kg·d)，200 g大鼠為1.58 g/d即1.58 mL/d。生理鹽水對照組：腹部手術(shù)后6、16 h均給予生理鹽水0.8 mL灌胃?？瞻捉M：不行手術(shù)，但與手術(shù)組一同禁食24 h，不禁水。

1.4免疫組織化學(xué)染色及HE染色步驟取出放在多聚甲醛中固定72 h的小腸組織，切成2～3 mm小塊，按常規(guī)方法制作組織切片。免疫組織化學(xué)染色：①脫蠟：將待用切片置入恒溫箱，烘烤切片1 h，取出切片后，迅速放入二甲苯溶液中，浸泡脫蠟2次，每次20 min。②梯度水化：脫蠟后將切片依次放入100%無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇下行浸泡，然后PBS緩沖液沖洗5 min。③抗原修復(fù)：將切片放入檸檬酸緩沖液中，放入微波爐中高火5 min悶10 min，再加熱1 min悶10 min，冷卻至室溫，PBS沖洗5 min。④封閉內(nèi)源性過氧化物酶：滴加3%過氧化物酶阻斷劑，室溫下孵育20 min，然后PBS緩沖液沖洗，3×5 min。⑤封閉非特異性抗原：滴加山羊血清，室溫下孵育20 min。⑥一抗孵育：滴加適當(dāng)比例的一抗(COX-2的抗體濃度為1∶200，c-kit的抗體濃度為1∶100)，4 ℃冰箱過夜。第2天PBS緩沖液沖洗，3×5 min。⑦二抗孵育：滴加生物素化的二抗，室溫下孵育20 min，PBS緩沖液沖洗，3×5 min。⑧S-P溶液孵育：滴加S-P溶液(鏈霉素抗生物素-過氧化物酶),室溫下孵育20 min，PBS緩沖液沖洗，3×5 min。⑨顯色：滴加DAB顯色溶液(1 mL+1滴顯色劑)，在室溫下控制背景程度，顯色約1～3 min，待出現(xiàn)陽性時流水終止。⑩復(fù)染、脫水封片：蘇木素復(fù)染2 min，流水返藍(lán)10 min。然后上行梯度酒精(30%、70%、100%)脫水，二甲苯脫酒精，中性樹膠封片。HE染色：①脫蠟：二甲苯10 min→二甲苯10 min→100%酒精10 min→95%酒精10 min→85%酒精10 min→水洗；②蘇木素10 min→水洗直流水沖洗20 min；③伊紅1 min→水洗片刻；④脫水→透明→封片。

1.5判定標(biāo)準(zhǔn)免疫組化染色結(jié)果判定：顯微鏡下觀察切片的顯色反應(yīng)，c-kit免疫組化染色以胞膜、胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或褐色為陽性表達，主要分布于粘膜下層、肌層；COX-2以胞質(zhì)、核膜著色為主，主要分布于粘膜層及粘膜下層。400×視野下隨機選5個視野，應(yīng)用ImagePro-Plus專業(yè)圖形分析系統(tǒng)，計算c-kit、COX-2的平均光密度值，其包含表達面積和表達濃度信息，在選定的面積一定時，平均光密度值越大，表示c-kit、COX-2的表達越強，可代表其相對表達量。腸黏膜損傷程度觀察：在光鏡下觀察三組腸粘膜組織腸絨毛排列是否整齊，有無變短脫落及融合成片；各層組織是否存在炎性細(xì)胞浸潤。

2結(jié)果

2.1各實驗組大鼠術(shù)后24 h小腸組織COX-2、c-kit的表達水平免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示：空白組小腸組織上COX-2未見明顯表達，或可見少量表達，散在分布；對照組表達強烈，顏色呈黃褐色，著色較深，分布密集，廣泛分布于粘膜及粘膜下層，肌層也可見表達，平均光密度高于空白組(P<0.05)；藥物組COX-2表達較對照組明顯減少，與對照組相比著色較淺，平均光密度值低于對照組(P<0.05)。小腸組織ICC特異性蛋白c-kit空白組表達強烈，顏色呈黃褐色，著色較深，主要分布于粘膜下層和漿膜層；對照組表達偏弱且可見陽性細(xì)胞減少，著色偏淡，分布稀疏，甚至缺如，平均光密度顯著低于空白組(P<0.05)；藥物組尚可見著色較深的c-kit陽性表達，與對照組相比，藥物組平均光密度值增加(P<0.05)。見表1、圖1～圖2。

表1　各組大鼠術(shù)后24 h小腸組織COX-2、c-kit平均光密度比較

注：*與空白組比較，P<0.05；#與對照組比較，P<0.05

圖1　各組大鼠小腸組織COX-2表達(400×)

圖2　各組大鼠小腸組織c-kit表達(400×)

2.2各實驗組小腸粘膜組織病理染色觀察空白組腸粘膜上皮排列有序，絨毛結(jié)構(gòu)清晰，組織結(jié)構(gòu)正常，未見損傷；對照組腸粘膜絨毛排列不整齊，大部分絨毛高矮不一、變短、間距增寬、上皮脫落、間質(zhì)充血水腫，部分可見絨毛融合成片，炎癥細(xì)胞浸潤；藥物組與對照組相比，腸粘膜絨毛有明顯改善，排列稍顯不齊，粗細(xì)基本相等，無粘連成片現(xiàn)象，絨毛間質(zhì)充血、水腫較對照組有所好轉(zhuǎn)，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯改善。見圖3。

圖3　各組大鼠腸粘膜組織(HE×100)

3討論

術(shù)后腸梗阻發(fā)生因素眾多，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)生機制可能與術(shù)后神經(jīng)反射對胃腸道動力的抑制，手術(shù)操作刺激中性粒細(xì)胞釋放大量的炎癥因子和多種麻醉劑對腸道蠕動的抑制等因素相關(guān)[1]。其中，手術(shù)觸發(fā)腸道炎癥介質(zhì)的釋放被認(rèn)為是POI發(fā)生的關(guān)鍵因素，對胃腸動力影響較大，是臨床預(yù)防和治療的重點和難點。

COX-2是一種誘導(dǎo)型環(huán)氧酶糖蛋白，是催化花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)和血栓素的限速酶，是炎癥反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，通常情況下在組織細(xì)胞中幾乎不表達。當(dāng)受到刺激時，機體中的單核巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生大量的COX-2[9]。誘導(dǎo)型COX-2催化AA氧化生成一系列PG[10]。PG可產(chǎn)生氧自由基和活性氧，其主要生理功能PGE2能誘發(fā)炎癥反應(yīng)，促進局部血管擴張，毛細(xì)血管通透性增加，引起紅、腫、熱、痛等癥狀，造成腸粘膜炎癥、組織破壞及潰瘍形成。ICC位于人類消化道許多區(qū)域，c-kit為ICC特異性表達蛋白。然而在POI時，腸壁內(nèi)的ICC發(fā)生了怎樣的改變，迄今其病理機制仍未十分明確。其可能機制是POI患者胃腸道肌層的白細(xì)胞聚集和巨噬細(xì)胞激活將iNOS表達上調(diào)，進而產(chǎn)生過量的NO。后者是重要的腸神經(jīng)抑制性遞質(zhì)[11]，其作用的主要靶向分子是鳥苷酸環(huán)化酶(Soluble guanylate cyclase，sGC)，NO與sGC結(jié)合后催化生成環(huán)磷酸鳥苷(Cyclic guanosine3′,5′-monophospate，cGMP)，一種催化鳥苷三磷酸(Guanosine triphosphate，GTP)轉(zhuǎn)變?yōu)閏GMP的酶。cGMP作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，激活cGMP依賴蛋白激酶(cGMP-dependent protein kinases，PKG)，激活后的PKG磷酸化目標(biāo)蛋白，包括離子通道、離子泵和參與調(diào)控胞內(nèi)Ca2+水平的酶，從而降低胃腸道平滑肌細(xì)胞(Smooth muscle cells，SMC)內(nèi)Ca2+濃度，抑制SMC興奮，導(dǎo)致胃腸平滑肌松弛效應(yīng)。Lino等用免疫熒光雙標(biāo)染色發(fā)現(xiàn)整個胃腸道肌層內(nèi)ICC細(xì)胞幾乎都呈sGC陽性，免疫電鏡觀察也進一步證實sGC陽性細(xì)胞具有ICC的超微結(jié)構(gòu)特征。相關(guān)研究顯示，應(yīng)用外源性NO的供體后，小鼠小腸ICC的起搏節(jié)律和幅度均降低，而應(yīng)用鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑或ATP敏感性鉀離子通道阻滯劑后，可以阻斷外源性NO供體引起的ICC電流的降低[12]，NO發(fā)揮抑制性作用的主要靶細(xì)胞是ICC。

腸梗阻屬中醫(yī)“腸結(jié)病”，“關(guān)格”的范疇，祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣滯血瘀即可造成腹氣不通，不通則痛，繼而出現(xiàn)“痛，嘔，脹，閉”四大癥狀[13]。其病機往往因術(shù)后機體正氣耗傷，氣虛推動無力，致脾胃升降功能失調(diào)，腑氣不通，氣滯血瘀，腸道燥屎內(nèi)結(jié)而發(fā)生本病。通腑化瘀湯由大黃、厚樸、枳實、黃芪、丹參、炙甘草六味中藥組成，是在《傷寒論》小承氣湯基礎(chǔ)上化裁而成。方中大黃瀉下攻積、活血祛瘀為君藥；厚樸、枳實為臣藥，厚樸下氣除滿、枳實行氣消痞，合而用之，即能消痞除滿，又能使胃腸氣機通降下行以助瀉下通便；佐以黃芪、丹參，可益氣健脾、托毒生肌，并增活血祛瘀之功；炙甘草緩急止痛、益氣補中、調(diào)和諸藥為使藥，六藥合用具有通腑瀉濁，活血化瘀之功。本方君、臣、佐、使配伍得當(dāng)，補氣健脾與瀉下攻積藥同用，避免了攻邪則正氣不支、補正則邪實愈壅的缺陷，起到攻補兼施的作用。本次實驗中，免疫組化結(jié)果顯示：藥物組COX-2蛋白的表達較對照組顯著減少，ICC數(shù)量增加，其形態(tài)得到一定程度的修復(fù)，病理染色顯示藥物組小腸組織腸粘膜損傷明顯減輕。其機制可能為通腑化瘀湯抑制腹腔肥大細(xì)胞及腸道巨噬細(xì)胞分泌促炎介質(zhì)，減少白細(xì)胞代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，抑制胃腸道平滑肌的Ca2+內(nèi)流，減輕胃腸道ICC的損傷。通過改善腸道及局部臟器的血液循環(huán)，增加局部組織供氧，促進炎性滲出物的吸收，進而保護腸粘膜，增加胃腸收縮，促進胃腸動力的恢復(fù)。本方還可增強機體免疫力，調(diào)節(jié)身體的整體機能，促進術(shù)后身體的康復(fù)。

本實驗通過病理染色和免疫組織化學(xué)方法初步證明了通腑化瘀湯確實能夠減輕術(shù)后腸道炎癥反應(yīng)，保護腸道粘膜以及促進腸道動力恢復(fù)。為本方今后在臨床上的應(yīng)用及進一步研究提供了依據(jù)。

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Effect of Tongfu Huayu decoction on expression of COX-2 and interstitial cells of Cajal in postoperative ileus rats

ZHANG Bao-gang,CHEN Su-ning*,LIANG Jing-jing,YU Fei

(Department of Traditional Chinese Medicine,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

[Abstract]ObjectiveTo provide effective prescriptions and theoretical basis for better prevention and treatment of postoperative ileus in the clinic,establish the model of the postoperative ileus rats,then observe the expression of the cyclooxygenase-2 (COX-2) and interstitial cells of Cajal (ICC) in the small intestine tissue of the postoperative ileus rats under the intervention of the Tongfu Huayu decoction,and assess the degree of the intestinal mucosa injury.MethodsForty-five healthy male SD rats were divided into 3 groups at random:group of Tongfu Huayu decoction (drug group),group of normal saline(control group) and blank group.The bellies of rats in the first two groups were operated to establish the model of the postoperative ileus.After 6 h and 16 h,the Tongfu Huayu decoction and normal saline of 0.8 mL was respectively lavaged,while the blank group was not processed.The distal small intestine tissue of the rats about 5 cm away from the cecum was cut off before executing.HE method was used to observe the situation of the intestinal mucosa injury under the microscope;the average optical density value of the COX-2 and the c-kit which was the specific marker of the interstitial cells of Cajal was tested by immunohistochemistry.ResultsThe expression of the COX-2 in control group improved significantly compared with blank group (P<0.05),the expression of the c-kit was lower (P<0.05),and the degree of the intestinal mucosa injury was severer;the expression of the COX-2 in drug group decreased significantly compared with control group (P<0.05),the expression of the c-kit was higher (P<0.05),and to some extent,the intestinal mucosa injury was repaired.ConclusionTongfu Huayu decoction can decrease the expression of the COX-2,improve the morphology of interstitial cells of Cajal and increase the number of interstitial cells of Cajal,and inhibit the inflammation,thus playing an important role in preventing the intestinal mucosa.

Key words：Tongfu Huayu decoction;Postoperative ileus;COX-2;Interstitial cell of Cajal

收稿日期：2016-02-23

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201605001