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    綠色熒光蛋白放射免疫分析試劑盒的研制

    2016-06-21 00:50:17姜曉靜孫秀柱朱化彬杜衛(wèi)華郝海生趙學(xué)明王棟劉巖
    中國醫(yī)藥生物技術(shù) 2016年3期
    關(guān)鍵詞:生物素內(nèi)源性緩沖液

    姜曉靜,孫秀柱,朱化彬,杜衛(wèi)華,郝海生,趙學(xué)明,王棟,劉巖

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    綠色熒光蛋白放射免疫分析試劑盒的研制

    姜曉靜*,孫秀柱*,朱化彬,杜衛(wèi)華,郝海生,趙學(xué)明,王棟,劉巖

    作者單位:100193 北京,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所(姜曉靜、朱化彬、杜衛(wèi)華、郝海生、趙學(xué)明、王棟、劉巖);712100 陜西楊凌,西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院(姜曉靜、孫秀柱)

    *同為第一作者

    綠色熒光蛋白(GFP)于 1962 年在一種學(xué)名為Aequorea Victoria 的水母中發(fā)現(xiàn),包含 238 個氨基酸殘基[1-2]。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì),在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下,會吸收藍(lán)光的部分能量,發(fā)出綠色熒光。GFP 常用于標(biāo)記某些特定的 RNA、內(nèi)源性代謝產(chǎn)物以及靶蛋白[3],可通過熒光顯微鏡實時觀察,也可通過熒光激活細(xì)胞,分選分離細(xì)胞[4]。這一活體生物標(biāo)記[5]特性,使得 GFP 成為實時觀察細(xì)胞、組織、器官不可或缺的工具[6],在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)中也得到了廣泛的應(yīng)用[7-12]。

    目前,對 GFP 的檢測方法分為定性檢測及定量檢測。定性檢測包括熒光觀察[13]、免疫組化[14-16]、Western blot等[17-19],定量檢測可以通過 ELISA 方法。但通過 ELISA 方法定量檢測 GFP 含量[20-22],顯色時間不容易控制,檢測靈敏度受到免疫反應(yīng)顯色精確度的限制。對于少量 GFP 殘留的檢出率低,不利于精確檢測[23]。

    本實驗應(yīng)用競爭機制原理,研制了一種高靈敏度的GFP 放射免疫檢測試劑盒,最低檢測限位 1 pg/ml。本試劑盒的一抗使用濃度低,樣品的前處理過程簡單,耗時少,能同時檢測大量的樣品,實驗效率高,樣品檢測成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的儀器檢測方法,對實現(xiàn)大批量樣品的 GFP 殘留監(jiān)控具有重要的意義。

    1 材料與方法

    1.1主要試劑和儀器

    緩沖液 A:0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)pH 7.2;緩沖液 B:1% 牛血清白蛋白、0.1% 冷海魚皮膠、0.05% 疊氮鈉、0.1 mol/L PBS pH 7.2;GFP 標(biāo)準(zhǔn)品購自美國 Vector公司;綠色熒光蛋白多克隆抗體(GFP 多抗)購自美國Chemicon 公司,用 0.1 mol/L PBS(pH 7.2)稀釋,稀釋比例為 1∶4000。PR 分離劑由驢抗兔二抗(1∶1000 稀釋)、6% 聚乙二醇(PEG)、γ 球蛋白、0.1 mol/L PBS(pH 7.2)組成,其中驢抗兔二抗購于北方生物技術(shù)研究所;標(biāo)準(zhǔn)品溶液為 9 個濃度梯度,分別為 1、2、4、8、16、32、64、128 和 256 pg/ml;CG-12 型 γ 計數(shù)器為美國德普公司產(chǎn)品。

    1.2方法

    1.2.1綠色熒光蛋白的標(biāo)記GFP 與放射性碘的結(jié)合采用氯胺-T 法進行[24]。將 5 μg GFP 溶于 100 μl 的磷酸緩沖液(0.1 mol/L,pH 7.2)中,加入約 37 mol/L MBq Na125I,磁力攪拌器下加入 15 μl 氯胺-T(1 μg/μl),反應(yīng) 1 min 后加入 5 μl 偏重亞硫酸鈉(2 μg/μl)終止反應(yīng),繼續(xù)攪拌60 s,G-25 凝膠柱層析分離純化。反應(yīng)溫度為 20 ℃。最終得到125I-GFP 放射性活度約 20 000 cpm/100 μl。

    1.2.2綠色熒光蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的配置臨用前吸取 GFP 標(biāo)準(zhǔn)品(1.024 ng/μl)1 μl,加 2 ml 緩沖液 A 溶解,濃度為512 pg/ml,作為 S10,另取試管 9 支,編號 S9~ S1,各加緩沖液 A 1 ml,從 S10中取 1 ml 加到 S9,依次倍比稀釋至 S1,S9~ S1試管的濃度分別為 256、128、64、32、16、8、4、2、1 pg/ml。

    1.2.3綠色熒光蛋白放射免疫分析程序在聚苯乙烯試管上編號,包括總管(T 管)、非特異管(NSB 管)、零結(jié)合管(S0管)、標(biāo)準(zhǔn)管(S1~ S9管)、樣本管(U 管),以上試管必須雙管標(biāo)號;向 S1~ S9管加入 200 μl 標(biāo)準(zhǔn)品、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP;向 U 管加入200 μl 待測樣本、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP;向 NSB 管加入 200 μl 緩沖液 A、100 μl 緩沖液 B 及 100 μl125I-GFP;向 S0管加入 200 μl 緩沖液 A、100 μl GFP 多克隆抗體及 100 μl125I-GFP;充分混勻,放置4 ℃ 24 h,每管分別加入 PR 分離劑 500 μl,充分混勻,室溫放置 20 min,4 ℃ 條件下,3500 r/min 離心 25 min,吸棄上清,測各管沉淀 cpm 數(shù)。

    2 結(jié)果

    本實驗采用平衡法,數(shù)據(jù)分析采用世界衛(wèi)生組織放射免疫分析推薦的 Logit 標(biāo)準(zhǔn)曲線法。標(biāo)準(zhǔn)曲線法使用的計算參數(shù)及計算過程如下:

    ⑴每對試管(T、NSB、S0、S1~ S9、U)的平均計數(shù):計數(shù) = 平均 cpm - 本底計數(shù)。

    ⑵非特異結(jié)合率:NSB% = NSB/T × 100%

    ⑶最大結(jié)合率:B0% =(B0- NSB)/T × 100%

    ⑷各標(biāo)準(zhǔn)管、樣品管結(jié)合率:

    B/B0% =(B - NSB)/(B0- NSB)× 100%,其中 B =標(biāo)準(zhǔn)管(或樣本管)雙管技術(shù)的均值;B0= 零標(biāo)準(zhǔn)(S0)雙管計數(shù)的均值;NSB = 非特異雙管計數(shù)的均值。

    以上各標(biāo)準(zhǔn)點的 B/B0為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)點濃度為橫坐標(biāo),在 Logit-Log 雙對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待測樣本的結(jié)合率,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的樣品蛋白含量?;蛴勺詣?γ 計數(shù)器預(yù)先編制程序,直接給出有關(guān)參數(shù),標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品濃度。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線上 S1、S2、S3、S4、S5及 S9樣品管的對應(yīng)自查值分別為 0.99、2.03、7.92、16.61、30.68 和 258.52 pg/ml,與實際加入濃度相符。B 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù) NSB% = 3.4%,B0/T = 51.04%,線性回歸 r = -0.99991,A = 1.65,B = -1.41,ED75= 2.45,ED50= 14.76,ED25= 89.02。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線測量數(shù)據(jù)如表1 所示。

    圖1 Log-logit 雙對數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線

    表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測量數(shù)據(jù)

    試驗應(yīng)用競爭機制原理,標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中的 GFP 和加入的125I-GFP 共同與一定量的特異性抗體產(chǎn)生競爭性免疫反應(yīng)。125I-GFP 同抗體的結(jié)合量與標(biāo)準(zhǔn)品或樣品中 GFP 的含量呈一定的函數(shù)關(guān)系。用免疫分離試劑(PR)將結(jié)合部分(B)與游離部分(F)分離后,測定結(jié)合部分的放射性強度,并計算相應(yīng)結(jié)合率 B/B0。用已知標(biāo)準(zhǔn) GFP 含量與對應(yīng)結(jié)合率作圖,即得標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查找對應(yīng)結(jié)合率的待測樣品中 GFP 的含量。

    3 討論

    本試劑盒檢測靈敏度高,最低檢測限位 1 pg/ml,明顯高于商用試劑盒,如 Cell Biolabs 公司 GFP ELISA 試劑盒,靈敏度為 30 pg/ml[25-27];Bioo Scientific 公司的 GFP ELISA 試劑盒,檢測范圍為 2 ~ 12 ng/ml[28-29]。同位素檢測靈敏度高于 ELISA 顯色反應(yīng)。

    GFP 放射免疫試劑盒準(zhǔn)確性高,假陽性率低。放射免疫檢測的優(yōu)勢尤其體現(xiàn)在一些含有內(nèi)源性的酶和生物素的動物組織中,如肝臟、脾臟、腎臟。在辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素的 ELISA 體系中,內(nèi)源性的過氧化物酶或生物素會提高陰性樣本的讀值,引發(fā)假陽性的 ELISA反應(yīng)。放射免疫試劑盒由于直接用同位素標(biāo)記抗原,與樣本中抗原競爭抗體,沒有生物素、過氧化物酶體系,從根源上避免了內(nèi)源性酶及生物素的假陽性反應(yīng),大大提高了檢測的效率。

    樣品的前處理過程簡單。體液樣本、細(xì)胞培養(yǎng)液可直接用于測定;組織樣本,無論是否含有內(nèi)源性酶及生物素,前處理步驟僅需組織總蛋白提取及總蛋白定量步驟,不需要對內(nèi)源性酶及生物素進行屏蔽,減少溶液配制,精簡操作步驟,節(jié)約時間,節(jié)約勞動力。而 ELISA 試劑盒通常不包含內(nèi)源性酶及生物素抑制劑,需要使用者單獨配置。

    本試劑盒測定通量高,能同時檢測大量的樣品,提高實驗效率,采用 CG-12 型 γ 放射免疫計數(shù)器可一次同時檢測 300 個試管,大大提高檢測效率。

    本試驗建立一種簡便的、高靈敏度的綠色熒光蛋白放射免疫檢測方法。根據(jù)該法研制的放射免疫試劑盒檢測靈敏度為 1 pg/ml,檢測范圍為 1 ~ 256 pg/ml,一抗稀釋比例為1∶4000,可用于測定體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 GFP 蛋白表達豐度,也可用于測定轉(zhuǎn)基因動物血液、器官、組織蛋白溶液中的GFP 殘留。

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    ·協(xié)會之窗·

    DOI:10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.014

    基金項目:國家自然科學(xué)基金(31301977);農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS06-2016);西北農(nóng)林科技大學(xué)引進人才科研啟動費(Z111021203)

    通信作者:劉巖,Email:liuyan05@caas.cn

    收稿日期:2015-11-04

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