結(jié)核特異性多肽E6、E7和C14對(duì)單核-巨噬細(xì)胞亞型極化的影響

申?yáng)|梅，方毅敏，申雁鳴，劉國(guó)標(biāo)，姚亞男，賴小敏

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結(jié)核特異性多肽E6、E7和C14對(duì)單核-巨噬細(xì)胞亞型極化的影響

申?yáng)|梅，方毅敏，申雁鳴，劉國(guó)標(biāo)，姚亞男，賴小敏

【摘要】

目的運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核-巨噬細(xì)胞極化亞型 M1 （CD14+CD16+）及 M2（CD14+CD163+），探討結(jié)核特異性多肽對(duì)單核-巨噬細(xì)胞極化分型的影響。

方法以 3 種結(jié)核特異性多肽 E6、E7 和 C14 作為刺激物，刺激人急性白血病單核細(xì)胞株（THP-1 細(xì)胞）、結(jié)核病患者胸水單個(gè)核細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激物不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)單核-巨噬細(xì)胞極化表面標(biāo)記表達(dá)的影響。

結(jié)果結(jié)核特異性多肽 E6 刺激 THP-1 24 + 0 h、24 + 24 h、24 + 48 h、24 + 72 h 后，CD16/CD163 陽(yáng)性率分別為16.85%/13.78%、19.59%/15.68%、18.14%/14.19%、13.61%/ 11.47%。E7 刺激效果與 E6 相似，C14 對(duì) THP-1 的CD16/CD163 表達(dá)影響不如前兩種多肽強(qiáng)。結(jié)核特異性多肽E6 刺激結(jié)核患者胸水或血標(biāo)本單核細(xì)胞 19 h 后，CD14+CD16+陽(yáng)性率（1# 患者：1.66%，2# 患者：4.37%）與 CD14+CD163+陽(yáng)性率（1# 患者：1.76%，2# 患者：2.82%）差異不大，但 CD14+CD16+CD86+陽(yáng)性率（1# 患者：2.20%，2# 患者：6.16%）大于 CD14+CD163+CD206+陽(yáng)性率（1# 患者：1.37%，2# 患者：0.92%）。E7 刺激效果與 E6 相似，C14 對(duì)結(jié)核患者胸水或血標(biāo)本單核細(xì)胞CD14/CD16/CD163 表達(dá)影響不如前兩種多肽強(qiáng)。

結(jié)論3 種結(jié)核特異性多肽特別是 E6、E7 體外刺激單核細(xì)胞株 THP-1、結(jié)核患者胸水或血標(biāo)本單核細(xì)胞主要向M1 型單核-巨噬細(xì)胞極化。

【關(guān)鍵詞】肽類；白血病，單核細(xì)胞，急性；單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)；極化分型

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):216-223

作者單位：510080 廣州，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，熱帶病防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，結(jié)核病防治研究所，海洋微生物功能分子廣東省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省重大傳染病預(yù)防和控制技術(shù)中心（申?yáng)|梅、姚亞男、賴小敏）；510095 廣州市胸科醫(yī)院（方毅敏、申雁鳴、劉國(guó)標(biāo)）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的嚴(yán)重威脅人類健康的慢性傳染病，是我國(guó)重點(diǎn)防治疾病之一。

MTB 屬于胞內(nèi)寄生菌，在體內(nèi)主要寄居于單核-巨噬細(xì)胞中。單核-巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性細(xì)胞群體，不同組織甚至同一組織的巨噬細(xì)胞在表型和功能方面存在較大的差異。而巨噬細(xì)胞根據(jù)表型和分泌因子不同可分為經(jīng)典活化 M1 型及選擇活化M2 型［1-2］。M1 型經(jīng)典的表面標(biāo)記有 CD16/CD86/ HLA-DR 等［3-4］，M2 型經(jīng)典的表面標(biāo)記有 CD163/ CD206/CD209/CD36 等［5-7］。

本研究采用 3 種結(jié)核特異性多肽 E6、E7 和C14 刺激人急性白血病單核細(xì)胞株 THP-1、結(jié)核患者胸水及外周血單個(gè)核細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析不同刺激時(shí)間、刺激物對(duì)單核細(xì)胞株表面標(biāo)記CD16、CD163 等表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本人急性單核細(xì)胞白血病單核細(xì)胞株THP-1 由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院黃曦教授惠贈(zèng)。結(jié)核患者胸水及外周血等標(biāo)本來(lái)自廣州市胸科醫(yī)院，用于分離單個(gè)核細(xì)胞。

1.1.2主要材料與試劑12 孔板為加拿大杰特生化制品國(guó)際有限公司產(chǎn)品；3 種結(jié)核特異性多肽為本實(shí)驗(yàn)室前期自行研發(fā)，包括多肽 E6（中國(guó)發(fā)明專利公開(kāi)號(hào)：201110130364.8）、E7（中國(guó)授權(quán)發(fā)明專利號(hào)：200810220523.1）和 C14，委托西安華辰生物科技有限公司合成，純度 ≥ 98%，其中 E6、E7 來(lái)源于 MTB 特異性分泌蛋白 ESAT-6，C14來(lái)源于另一種特異性分泌蛋白 CFP-10；對(duì)照刺激劑 LPS（大腸埃希菌 055：B5）為美國(guó) Sigma 公司產(chǎn)品；人重組 IFN-γ、IL-4、IL-13 均為美國(guó) PeproTech 公司產(chǎn)品；流式抗體鼠抗人 CD14-FITC、CD16-APC-eFluor 780、CD163-PerCP-eFluor 710、CD206-eFluor 450 均購(gòu)自美國(guó) eBioscience 公司；鼠抗人 CD163-PerCP-Cy5.5 購(gòu)自美國(guó) Biolegend公司；鼠抗人 CD86-APC 購(gòu)自美國(guó) BD 公司；細(xì)胞培養(yǎng)基 RPMI 1640、胎牛血清和青霉素/鏈霉素雙抗混合液均為美國(guó) Gibco BRL 公司產(chǎn)品。

1.1.3儀器流式細(xì)胞儀 FACS Gallios 為美國(guó)Beckman Coulter 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1THP-1 細(xì)胞株培養(yǎng)用 RPMI 1640 完全培養(yǎng)基（含10% 胎牛血清 FBS、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 鏈霉素）于 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2THP-1 的體外刺激將處于對(duì)數(shù)期的THP-1 細(xì)胞按密度為（6 ～ 8）× 105/ml 鋪于 12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分組如下：組 1（陰性對(duì)照組）：RPMI 1640 培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞 24 h；組 2（陽(yáng)性對(duì)照組 1）：LPS（1 μg/ml）和 IFN-γ（20 ng/ml）共刺激培養(yǎng)；組 3（陽(yáng)性對(duì)照組 2）：IL-4（20 ng/ml）和 IL-13（20 ng/ml）共刺激培養(yǎng)；組 4：E6 （20 μg/ml）刺激培養(yǎng)；組 5：E7（20 μg/ml）刺激培養(yǎng)；組 6：C14（20 μg/ml）刺激培養(yǎng)。各組對(duì)應(yīng)刺激劑刺激培養(yǎng) THP-1 24 h（培養(yǎng)基不含血清及雙抗），半量換液后再加 1 ml 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng) 0、24、48、72 h，以上 4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24 + 0 h、24 + 24 h、24 + 48 h、24 + 72 h）分別收集細(xì)胞作流式細(xì)胞分析。

1.2.3結(jié)核患者胸水及血液標(biāo)本中單個(gè)核細(xì)胞的體外刺激用淋巴細(xì)胞分離液分離胸水及外周血得到單個(gè)核細(xì)胞，按細(xì)胞密度為 3 × 105/ml 鋪于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分組如下：組 A（陰性對(duì)照組 1）：未刺激、未培養(yǎng)；組 B（陰性對(duì)照組 2）：未刺激、RPMI 1640 培養(yǎng)（含 IL-2）19 h；組 C（陽(yáng)性對(duì)照組 1）：LPS（1 μg/ml）和 IFN-γ （20 ng/ml）刺激培養(yǎng)；組 D（陽(yáng)性對(duì)照組 2）：IL-4 （20 ng/ml）和 IL-13（20 ng/ml）刺激培養(yǎng)；組 E：E6（20 μg/ml）刺激培養(yǎng)；組 F：E7（20 μg/ml）刺激培養(yǎng)；組 G：C14（20 μg/ml）刺激培養(yǎng)，各刺激組均加入 IL-2。各刺激劑分別刺激培養(yǎng)細(xì)胞19 h 后收集細(xì)胞作流式細(xì)胞分析。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記將收集到的細(xì)胞離心，2% 小牛血清 PBS 洗滌 1 次，用50 μl 染色緩沖液重懸細(xì)胞，按說(shuō)明書(shū)加鼠抗人CD14-FITC、CD16-APC-eFluor 780、CD163-PerCP-eFluor 710 或 CD163-PerCP-Cy5.5 抗體，經(jīng)體外刺激的胸水及血標(biāo)本單個(gè)核細(xì)胞加染鼠抗人CD86-APC、CD206-eFluor 450 抗體，4 ℃ 避光孵育 30 min，2% 小牛血清 PBS 洗去游離的抗體，300 ～ 400 μl 2% 多聚甲醛固定細(xì)胞后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面 CD14、CD16、CD163、CD86、CD206 等的表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS16.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)正態(tài)分布以均數(shù)、非正態(tài)分布以上四分位間距（P25）、中位數(shù)（P50）和下四分位間距（P75）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用 t 檢驗(yàn)、Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)和 Kruskal Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)驗(yàn)證。P ≤ 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1LPS + IFN-γ/IL-4 + IL-13 對(duì) THP-1 表面標(biāo)記 CD16/CD163 表達(dá)的影響

1 μg/ml LPS + 20 ng/ml IFN-γ、20 ng/ml IL-4 + 20 ng/ml IL-13［8］分別作用于 THP-1 細(xì)胞 24 h，低濃度的各刺激劑再分別作用 0、24、48、72 h，4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集細(xì)胞，并用 CD16-APC-eFluor 780、CD163-PerCP-eFluor 710 流式抗體進(jìn)行表面染色。4 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，①陽(yáng)性對(duì)照組 1：各時(shí)間點(diǎn) CD16 陽(yáng)性率分別為 12.86%（陰性對(duì)照組13.97%）、16.99%（20.68%）、17.86%（16.67%）、24.98%（12.93%）（與陰性對(duì)照組相比 P 均 ＞ 0.05）（圖1B），提示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD16 表達(dá)呈升高的趨勢(shì)（圖2A）；4 個(gè)時(shí)間點(diǎn) CD163 陽(yáng)性率分別為 8.78%（陰性對(duì)照組 11.28%）、12.49% （17.51%）、13.83%（13.80%）、13.18%（12.46%）（P 均 ＞ 0.05）（圖1B），提示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD163 表達(dá)呈先升高后下降的趨勢(shì)（圖2B）。②陽(yáng)性對(duì)照組 2：各時(shí)間點(diǎn) CD16 陽(yáng)性率分別為12.46 %（陰性對(duì)照組 13.97%）、12.05%（20.68%）、10.32%（16.67%）、9.19%（12.93%）（P 均 ＞ 0.05）（圖1B），提示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD16 表達(dá)呈下降的趨勢(shì)（圖2A）；4 個(gè)時(shí)間點(diǎn) CD163 陽(yáng)性率分別為 8.98%（陰性對(duì)照組 11.28%）、10.48% （17.51%）、7.13%（13.80%）、6.34%（12.46%）（P 均 ＞ 0.05）（圖1B），提示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD163 表達(dá)呈下降的趨勢(shì)（圖2B）。Genin 等［9］用 150 nmol/L PMA 作用于 THP-1 細(xì)胞 24 h，再用 20 ng/ml IL-4 + 20 ng/ml IL-13 刺激，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng) CD163 表達(dá)不斷升高，與我們的結(jié)果有所不同。

圖1　無(wú)刺激物或陽(yáng)性刺激物刺激培養(yǎng) THP-1 細(xì)胞后 CD16和CD163 表達(dá)情況［A：THP-1 細(xì)胞未刺激、培養(yǎng) 24 + 48 h 的流式表面染色結(jié)果；B：LPS（1 μg/ml）+ IFN-γ（20 ng/ml）、IL-4（20 ng/ml）+ IL-13（20 ng/ml）分別刺激 THP-1 后 CD16/CD163的表達(dá)情況］Figure 1　The expressions of CD16 and CD163 on THP-1 cells after cultivation with no-irritant or the positive irritants ［A： The results of flow cytometry of THP-1 cells which was unstimulated and cultured for 24 + 48 h； B： The expression of CD16/CD163 on THP-1 cells after stimulation with LPS （1 μg/ml） + IFN-γ （20 ng/ml）， or IL-4（20 ng/ml） + IL-13（20 ng/ml）］

2.2多肽對(duì) THP-1 表面標(biāo)記 CD16/CD163 表達(dá)的影響

20 μg/ml 結(jié)核特異性多肽 E6 刺激 THP-1細(xì)胞 24 + 0 h、24 + 24 h、24 + 48 h、24 + 72 h，各時(shí)間點(diǎn) CD16 陽(yáng)性率分別為 16.85%（陰性對(duì)照組13.97%）、19.59%（20.68%）、18.14%（16.67%）、13.61%（12.93%）（P 均 ＞ 0.05）（圖3），提示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD16 表達(dá)呈先升高后下降的趨勢(shì)，在刺激 24 + 24 h 達(dá)到峰值（圖2A）；各時(shí)間點(diǎn) CD163 陽(yáng)性率分別為 13.78%（陰性對(duì)照組11.28%）、15.68%（17.51%）、14.19%（13.80%）、11.47%（12.46%）（P 均＞ 0.05）（圖3），提示隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，CD163 表達(dá)同樣呈先升高后下降的趨勢(shì)，在刺激 24 + 24 h 達(dá)到峰值（圖2B）。E7、 C14 多肽 CD16、CD163 表達(dá)趨勢(shì)與 E6 基本相同。值得注意的是 C14 對(duì)表面標(biāo)記的影響，除刺激 24 + 72 h，CD163 稍微比陰性對(duì)照組低，其他時(shí)間點(diǎn) CD16 與 CD163 表達(dá)都比陰性對(duì)照組高（P ＞ 0.05）（圖2 和圖3）。

圖2　THP-1 細(xì)胞刺激前后 CD16/CD163 隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Figure 2　The expressions of CD16/CD163 on THP-1 cells before and after stimulation

圖3　結(jié)核特異性多肽 E6、E7 和 C14 刺激 THP-1 細(xì)胞后 CD16和CD163 表達(dá)結(jié)果Figure 3　The expressions of CD16 and CD163 on THP-1 cells after stimulation with the MTB-specific peptides

2.3LPS + IFN-γ/IL-4 + IL-13 對(duì)結(jié)核患者標(biāo)本表面標(biāo)記 CD14/CD16/CD163 表達(dá)的影響

1# 結(jié)核患者胸水單個(gè)核細(xì)胞，各刺激劑作用19 h 后，收集細(xì)胞流式表面染色。結(jié)果顯示，①LPS + IFN-γ 刺激組：CD14 陽(yáng)性率為 1.39%（兩個(gè)陰性對(duì)照組：組 A 和組 B 分別為 11.75%、7.24%），CD14+CD16+（M1 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為0.12%（組 A 11.06%/組 B 6.30%），CD14+CD163+（M2 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為 0.22%（組A 11.31%/組 B 6.32%）?？梢?jiàn) M1 型與 M2 陽(yáng)性率差異不大，后者稍多于前者。2# 結(jié)核患者胸水及血標(biāo)本分析結(jié)果顯示 M1 型（陽(yáng)性率 1.86%）稍少于 M2 型（陽(yáng)性率 3.5%），且差異較大。M1/M2 兩群細(xì)胞分別增加一個(gè)表面標(biāo)記后，CD14+CD16+CD86+（M1' 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為 0.85%（組 A 10.49%/組 B 6.71%），CD14+CD163+CD206+（M2' 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率 0.72%（組 A 3.57%/組 B 5.44%），可見(jiàn) M1'型占優(yōu)勢(shì)。2# 結(jié)核患者胸水及血標(biāo)本顯示也是M1' 型占優(yōu)勢(shì)。②IL-4 + IL-13 刺激組，與組 A/組 B比較，CD14+、CD14+CD16+、CD14+CD163+、CD14+CD16+CD86+陽(yáng)性率均降低，M1 型與 M2陽(yáng)性率差異不大，后者稍多于前者，2# 患者則為 M1 型稍多；M1/M2 各增加一個(gè)表面標(biāo)記后，1# 與 2# 患者結(jié)果都顯示 M1' 占優(yōu)勢(shì)（表1 ～表3）。

2.4多肽對(duì)結(jié)核患者標(biāo)本表面標(biāo)記 CD14/CD16/ CD163 表達(dá)的影響

表1　1# 結(jié)核患者胸水單核細(xì)胞亞群陽(yáng)性率（%）Table 1　The positive percentages of monocyte subsets from the No. 1 patient’s hydrothorax （%）

表2　2# 結(jié)核患者胸水單核細(xì)胞亞群陽(yáng)性率（%）Table 2　The positive percentages of monocyte subsets from the No. 2 patient’s hydrothorax （%）

1# 結(jié)核患者胸水單個(gè)核細(xì)胞，E6 刺激 19 h后，CD14 陽(yáng)性率為 2.83%（組 A 11.75%/組 B 7.24%），CD14+CD16+（M1 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為 1.66%（兩個(gè)陰性對(duì)照組：組 A 和組 B 分別為 11.06%、6.30%），CD14+CD163+（M2 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為 1.76%（組 A 11.31%/組 B 6.32%），可見(jiàn) M1 型與 M2 陽(yáng)性率差異不大，后者稍多于前者。2# 結(jié)核患者胸水顯示 M1 型（陽(yáng)性率 4.37%）多于 M2 型（陽(yáng)性率 2.82%），且差異較大。1# 結(jié)核患者 M1/M2 兩群細(xì)胞分別增加一個(gè)表面標(biāo)記后，CD14+CD16+CD86+（M1′ 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為 2.20%（組 A 10.49%/組 B 6.71%），CD14+CD163+CD206+（M2' 型單核-巨噬細(xì)胞）陽(yáng)性率為 1.37%（組 A 3.57%/組 B 5.44%），可見(jiàn) M1' 型占優(yōu)勢(shì)。2# 結(jié)核患者胸水顯示也是M1' 型占優(yōu)勢(shì)。E7 與 E6 結(jié)果幾乎一致。值得注意的是 C14 刺激組，1# 結(jié)核病本胸水單個(gè)核細(xì)胞，相比于組 A/B，CD14+、CD14+CD16+、CD14+CD163+、CD14+CD16+CD86+、CD14+CD163+CD206+陽(yáng)性率有增高有降低，而 E6、E7 刺激組，相對(duì)于組 A/B 都是降低的。2# 結(jié)核患者胸水單個(gè)核細(xì)胞，C14 刺激組相比于 E6、E7 刺激組，以上各細(xì)胞群的陽(yáng)性率幾乎均最高（表1 ～ 3）。

表3　2# 結(jié)核患者外周血標(biāo)本單核細(xì)胞亞群陽(yáng)性率（%）Table 3　The positive percentages of monocyte substrate from the blood of 2# patient （%）

3　討論

單核-巨噬細(xì)胞因所處微環(huán)境的不同，M1、M2兩種亞型可相互轉(zhuǎn)換。在脂多糖（LPS）和 IFN-γ 或TNF-α 刺激下可分化成 M1 型，在 IL-4 和 IL-13刺激下則可分化成 M2a 型，免疫復(fù)合物和 IL-β的微環(huán)境則分化成 M2b 型，IL-10 刺激分化成M2c 型［10］。Boudjeltia 等［11］提出 CD14+CD16+單核細(xì)胞，抗原遞呈能力強(qiáng)，產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。CD16+單核細(xì)胞在 TLR2 配體存在下培養(yǎng) 2 d，會(huì)優(yōu)先分化成 CD16+樹(shù)突狀細(xì)胞，該細(xì)胞抗原遞呈能力強(qiáng)［12］，說(shuō)明 CD14+CD16+單核細(xì)胞遷移至組織后更傾向于成為 M1 型巨噬細(xì)胞，并且該群細(xì)胞產(chǎn)生高水平的促炎性因子 TNF-α 及低水平的抗炎性因子 IL-10［13-14］，這也進(jìn)一步證實(shí) CD14+CD16+單核細(xì)胞傾向于成為 M1 型巨噬細(xì)胞。CD163 是表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞表面的一種膜受體，是清道夫受體家族成員之一。腹主動(dòng)脈瘤上清中可溶性的CD163 促進(jìn)巨噬細(xì)胞高表達(dá) CD163，低表達(dá)HLA-DR，該細(xì)胞分泌 IL-10 多，而產(chǎn)生促炎性因子 IL-12 少［15］，可認(rèn)為 CD163+細(xì)胞是 M2 型巨噬細(xì)胞。

THP-1 是比較成熟的用于體外研究單核-巨噬細(xì)胞功能的細(xì)胞株，本文用結(jié)核特異性多肽 E6、E7、C14 刺激 THP-1，探討幾種多肽對(duì)單核-巨噬細(xì)胞 M1/M2 極化的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在刺激 24 + 0 h、24 + 24 h、24 + 48 h、24 + 72 h，各時(shí)間點(diǎn)都為 CD16+細(xì)胞群占優(yōu)勢(shì)，即使在加入 CD14 表面標(biāo)記共染情況下，也得到相似的結(jié)果（數(shù)據(jù)未展示）。說(shuō)明結(jié)核特異性多肽 E6、E7、C14 體外刺激THP-1 型單核細(xì)胞更傾向分化 M1 型單核-巨噬細(xì)胞。

本文用結(jié)核患者胸水和血標(biāo)本，進(jìn)一步驗(yàn)證E6、E7、C14 對(duì)單核-巨噬細(xì)胞極化亞型的影響，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩例結(jié)核患者胸水單核細(xì)胞在受幾種多肽刺激 19 h 后，1# 患者 CD14+CD16+陽(yáng)性率小于 CD14+CD163+陽(yáng)性率，2# 患者 CD14+CD16+陽(yáng)性率大于 CD14+CD163+陽(yáng)性率，但差異不明顯，可能由個(gè)體差異引起。在兩群細(xì)胞分別增加CD86（M1 型表面標(biāo)記［16］）、CD206（M2 型表面標(biāo)記［7， 16］）標(biāo)記染色后，2 例患者都顯示CD14+CD16+CD86+細(xì)胞群陽(yáng)性率高于CD14+CD163+CD206+細(xì)胞群，即 M1 型單核-巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)，這與 THP-1 的體外刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

目前數(shù)篇文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用 MTB 感染純種小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠試驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯恐邪l(fā)現(xiàn)，早期感染的小鼠組織中存在 M1 型巨噬細(xì)胞的極化，而晚期感染的組織或體液如骨髓或支氣管肺泡灌洗液中主要為 M2 型巨噬細(xì)胞，推測(cè) M2 型巨噬細(xì)胞有助于MTB 的潛伏感染和結(jié)核病灶的形成［17-18］。但是，在人類結(jié)核病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，外周血單核細(xì)胞、局部病灶組織或體液（如胸水等）中巨噬細(xì)胞，特別是結(jié)核抗原特異性單核-巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)如何，與機(jī)體局部及全身免疫狀態(tài)相關(guān)性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。THP-1 是目前公認(rèn)的可用于體外研究單核-巨噬細(xì)胞功能的細(xì)胞株，用 10 ～ 160 ng/ml 不等濃度的 PMA 刺激不同時(shí)間讓 THP-1 分化成M0 型巨噬細(xì)胞［9， 16］，再用 LPS 和 IFN-γ 或者IL-4 和 IL-13 分別刺激分化成 M1/M2 型巨噬細(xì)胞。機(jī)體感染結(jié)核菌之后，結(jié)核菌首先通過(guò)其特異性的抗原物質(zhì)作用于單核細(xì)胞誘導(dǎo)各種免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。因此，本文試圖用結(jié)核特異性多肽直接作用于 THP-1 細(xì)胞株、結(jié)核患者胸水及血標(biāo)本單核細(xì)胞，探討各刺激劑對(duì) M1/M2 型單核-巨噬細(xì)胞極化是否有影響。初步試驗(yàn)結(jié)果顯示，3 種標(biāo)本得出一致的結(jié)果是 M1 型（CD14+/CD16+和CD14+CD16+CD86+）占優(yōu)勢(shì)。提示這些多肽或許更偏向于 M1 型誘導(dǎo)。但仍需要更多的試驗(yàn)驗(yàn)證。此外，體外的試驗(yàn)不能完全反應(yīng)體內(nèi)真實(shí)情況，需進(jìn)一步用結(jié)核患者病理組織 M1/M2 原位染色探討局部病灶中各型細(xì)胞數(shù)量和比例。

參考文獻(xiàn)

［1］ Krausgruber T， Blazek K， Smallie T， et al. IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses. Nat Immunol， 2011， 12（3）：231-238.

［2］ Satoh T， Takeuchi O， Vandenbon A， et al. The Jmjd3-Irf4 axis regulates M2 macrophage polarization and host responses against helminth infection. Nat Immunol， 2010， 11（10）：936-944.

［3］ Tanoue S， Chang LY， Li Y， et al. Monocyte-derived dendritic cells from cirrhotic patients retain similar capacity for maturation/activation and antigen presentation as those from healthy subjects. Cell Immunol，2015， 295（1）：36-45.

［4］ Mueller CK， Schultze-Mosgau S. Histomorphometric analysis of the phenotypical differentiation of recruited macrophages following subcutaneous implantation of an allogenous acellular dermal matrix. Int J Oral Maxillofac Surg， 2011， 40（4）：401-407.

［5］ Kasonga AE， Deepak V， Kruger MC， et al. Arachidonic acid and docosahexaenoic acid suppress osteoclast formation and activity in human CD14+ monocytes， in vitro. PLoS One， 2015， 10（4）：e0125145.

［6］ Boss M， Kemmerer M， Brüne B， et al. FABP4 inhibition suppresses PPARγ activity and VLDL-induced foam cell formation in IL-4-polarized human macrophages. Atherosclerosis， 2015， 240（2）：424-430.

［7］ Wynn TA， Barron L， Thompson RW， et al. Quantitative assessment of macrophage functions in repair and fibrosis. Curr Protoc Immunol，2011， Chapter 14：Unit14.22.

［8］ Chanput W， Mes JJ， Savelkoul HF， et al. Characterization of polarized THP-1 macrophages and polarizing ability of LPS and food compounds. Food Funct， 2013， 4（2）：266-276.

［9］ Genin M， Clement F， Fattaccioli A， et al. M1 and M2 macrophages derived from THP-1 cells differentially modulate the response of cancer cells to etoposide. BMC Cancer， 2015， 15：577.

［10］ Laskin DL. Macrophages and inflammatory mediators in chemical toxicity： a battle of forces. Chem Res Toxicol， 2009， 22（8）：1376-1385.

［11］ Boudjeltia KZ， Brohee D， Piro P， et al. Monocyte-platelet complexes on CD14/CD16 monocyte subsets： relationship with ApoA-I levels. A preliminary study. Cardiovasc Pathol， 2008， 17（5）：285-288.

［12］ Azeredo EL， Neves-Souza PC， Alvarenga AR， et al. Differential regulation of toll-like receptor-2， toll-like receptor-4， CD16 and human leucocyte antigen-DR on peripheral blood monocytes during mild and severe dengue fever. Immunology， 2010， 130（2）：202-216.

［13］ Sekerkova A， Krepsova E， Brabcova E， et al. CD14+CD16+ and CD14+CD163+ monocyte subpopulations in kidney allograft transplantation. BMC Immunol， 2014， 15：4.

［14］ Wang X， Kang FB， Wang GP， et al. Research progress of CD14+CD16+ subtypes monocytes. Immunol J， 2012， 28（10）：910-913. （in Chinese）王鑫， 康富標(biāo)， 王桂平， 等. CD14+CD16+亞型單核細(xì)胞的研究進(jìn)展. 免疫學(xué)雜志， 2012， 28（10）：910-913.

［15］ Rubio-Navarro A， Amaro Villalobos JM， Lindholt JS， et al. Hemoglobin induces monocyte recruitment and CD163-macrophage polarization in abdominal aortic aneurysm. Int J Cardiol， 2015，201：66-78.

［16］ Wei J， Besner GE. Besner M1 to M2 macrophage polarization in heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor therapy for necrotizing enterocolitis. J Surg Res， 2015， 197（1）：126-138.

［17］ Schreiber T， Ehlers S， Heitmann L， et al. Autocrine IL-10 induces hallmarks of alternative activation in macrophages and suppresses antituberculosis effector mechanisms without compromising T cell immunity. J Immunol， 2009， 183（2）：1301-1312.

［18］ Redente EF， Higgins DM， Dwyer-Nield LD， et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol， 2010， 88（1）：159-168.

Author Affiliations: Department of Microbiology， Zhongshan School of Medicine， Sun Yat-sen University， Ministry of Education Key Laboratory of Tropical Disease Control， Institute of Tuberculosis Control， Guangdong Provincial Department of Education Key Laboratory of Functional Molecules from Marine Microorganisms， Guangdong Provincial Research Center for Severe Infectious Disease Prevention and Control Technology， Guangzhou 510080， China （SHEN Dong-mei， YAO Ya-nan， LAI Xiao-min）；Guangzhou Chest Hospital， Guangzhou 510095， China （FANG Yi-min， SHEN Yan-ming， LIU Guo-biao）

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):216-223

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The influence of the Mycobacterium tuberculosis （MTB）-specific peptides E6， E7 and C14 on the monocyte-macrophage polarization

SHEN Dong-mei， FANG Yi-min， SHEN Yan-ming， LIU Guo-biao， YAO Ya-nan， LAI Xiao-min

【Abstract】

ObjectiveTo explore the influence of Mycobacterium tuberculosis （MTB）-specific peptide to monocyte-macrophage polarizationby utilizing flow cytometry to investigate the expression of CD14/CD16/CD163 of the cells.

MethodsThe expressions of M1 （CD14+CD16+）/M2 （CD14+CD163+） of the monocytes （THP-1， and the monocytes from the hydrothorax and peripherial blood from tuberculosis （TB） patients） were detected by flow cytometry with 3 MTB-specific peptides as stimulants at the different time.

ResultsThe positive percentages of CD16/CD163 of THP-1 cell line treated with the MTB peptide E6 at the times 24 + 0 h， 24 + 24 h， 24 + 48 h， and 24 + 72 h were 16.85%/13.78%， 19.59%/15.68%， 18.14%/14.19%， 13.61%/11.47%， respectively. The MTB peptide E7 exerted effect similar to E6， but the MTB peptide C14 showed a less effect. After treated with E6 at 19 h， the positive percentages of CD14+CD16+of the monocytes of hydrothorax from 2 TB patients were 1.66% （No. 1 patient） and 4.37% （No. 2 patient）， as well as CD14+CD163+were 1.76% （No. 1 patient） and 2.82% （No. 2 patient）. The difference between the two types of cells was not very remarkable， but the difference seemed to be significant when addedanother detection mark CD86 to CD14+CD16+， and CD206 to CD14+CD163+， respectively. E7 and C14 had the similar corresponding effects on the polarization of monocytes of hydrothorax and peripherial blood as observed at THP-1 cell line.

Conclusion3 MTB-specific peptides， especially E6 and E7， can mainly induce THP-1 and the monocytes of hydrothorax and peripherial blood from TB patients towards the M1 macrophage polarization.

【Key words】Peptide；Leukemia， monocytic， acute；Mononuclear phagocyte system；Polarization

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.004

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81271779）；“十二五”防治傳染病科技重大專項(xiàng)分任務(wù)（2012ZX10004903-004-002）；廣東省自然科學(xué)基金（2014A030313725）；廣州市科創(chuàng)委產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)（2060404）

通信作者：賴小敏，Email：laixm@mail.sysu.edu.cn

收稿日期：2016-01-22

Corresponding Author:LAI Xiao-min， Email： laixm@mail.sysu.edu.cn