埃博拉病毒進(jìn)入抑制劑篩選模型的建立與應(yīng)用

王靜，陳淑敏，馬鈴，張瑞欣，李卓榮，余利巖，岑山

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埃博拉病毒進(jìn)入抑制劑篩選模型的建立與應(yīng)用

王靜，陳淑敏，馬鈴，張瑞欣，李卓榮，余利巖，岑山

【摘要】

目的旨在以埃博拉病毒（EBOV）包膜糖蛋白（GP）為靶點(diǎn)，建立埃博拉病毒進(jìn)入抑制劑高通量篩選模型，應(yīng)用該模型篩選具有特異性抑制埃博拉病毒進(jìn)入的活性樣品。

方法利用細(xì)胞水平重組病毒技術(shù)，分別用兩株不同爆發(fā)時(shí)間的 Zaire-EBOV 的 GP 與 HIV 核心質(zhì)粒（pNL4-3.Luc）共表達(dá)，制備重組病毒 EBOV-GP-Old/HIV-luc 和EBOV-GP-New/HIV-luc。利用 ELISA 和熒光素酶檢測(cè)技術(shù)，優(yōu)化病毒產(chǎn)量、感染性、感染劑量及熒光活性測(cè)定時(shí)間等因素，建立藥物篩選模型。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)及陽(yáng)性化合物評(píng)估該模型的穩(wěn)定性和靈敏性。應(yīng)用該模型，對(duì) 242 個(gè)樣品進(jìn)行初步篩選，并通過(guò)與水泡性口膜炎病毒包膜蛋白包裝的重組病毒 VSVG/HIV-luc 進(jìn)行比較，以判斷樣品的特異性。

結(jié)果該模型可用于靶向 GP 蛋白的埃博拉病毒進(jìn)入抑制劑的高通量篩選，并獲得 4 種具有特異性抗埃博拉進(jìn)入活性的樣品。

結(jié)論該模型可用于抗 EBOV 進(jìn)入藥物的高通量篩選，應(yīng)用該模型獲得的陽(yáng)性樣品有助于抗 EBOV 藥物的發(fā)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】埃博拉病毒；高通量篩選分析；進(jìn)入抑制劑

www.cmbp.net.cn中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(3):193-199

作者單位：100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所免疫生物學(xué)室

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2014 年 3 月由扎伊爾埃博拉病毒（Zaire-EBOV）引起的西非疫情是自1976 年首次發(fā)現(xiàn)埃博拉病毒以來(lái)發(fā)生的最大一輪埃博拉疫情。埃博拉病毒為單股負(fù)鏈 RNA 病毒，屬于絲狀病毒科（Filoviridae）。人感染埃博拉病毒后，主要臨床表現(xiàn)為急性發(fā)熱、肌肉酸痛、頭痛、嘔吐及肝臟、腎臟受損或有出血等癥狀［1］。其中扎伊爾型埃博拉病毒致病力最強(qiáng)，且致死率高達(dá)90%［2］。迄今還沒(méi)有被 FDA 批準(zhǔn)的疫苗和藥物來(lái)預(yù)防和治療埃博拉病毒。因此，尋找新的抗埃博拉病毒藥物至關(guān)重要。由于 EBOV 的高致病性和致死率，對(duì)有感染性的埃博拉病毒的研究就只能限定生物安全級(jí)別最高的 BSL-4 級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，使得依賴(lài)于野生型 EBOV 的藥物篩選難以實(shí)現(xiàn)［3］。

隨著基于微型基因組（minigenome）的復(fù)制子及復(fù)制缺陷的假病毒報(bào)告系統(tǒng)迅速發(fā)展，抗病毒化合物的快速篩選得以在生物安全 BSL-2 級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行［4-5］。病毒的細(xì)胞進(jìn)入階段是病毒復(fù)制周期中的重要時(shí)期，在病毒感染早期抑制病毒的進(jìn)入可以減少病毒感染的幾率，同時(shí)也可降低藥物耐藥性的發(fā)生。因此，病毒的進(jìn)入階段成為篩選抗病毒藥物的重要靶點(diǎn)。EBOV 基因組長(zhǎng) 18.9 kb，編碼七種病毒蛋白，其中 EBOV-GP 是唯一負(fù)責(zé)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的蛋白。盡管以 EBOV-GP 蛋白為靶點(diǎn)的抗埃博拉病毒進(jìn)入藥物篩選模型已有報(bào)道，但均以此前的流行株為基礎(chǔ)。2014 年埃博拉病毒的大規(guī)模爆發(fā)表明病毒的遺傳變異改變了其傳播和致病能力。根據(jù)蛋白序列比對(duì)，1976 年經(jīng)典株與 2014 年流行株的 EBOV-GP 蛋白有 19 個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生了突變。因此，為了提高研發(fā)藥物的針對(duì)性，本文將分別以埃博拉病毒經(jīng)典株和流行株的表面包膜糖蛋白為外膜蛋白包裹 HIV 核心制備復(fù)制缺陷型假病毒 HIV/EBOV-GP，通過(guò)熒光報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)來(lái)判斷樣品的抗病毒活性，從而建立以EBOV-GP 蛋白為靶點(diǎn)的病毒進(jìn)入抑制劑高通量篩選模型，并期望應(yīng)用該模型獲得特異性好的埃博拉病毒進(jìn)入抑制劑。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品格爾德霉素及其衍生物樣品由本所合成室提供；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物和天然產(chǎn)物樣品由本所藥用微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2細(xì)胞和質(zhì)粒293T 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自有；Zaire-EBOV 包膜糖蛋白GP 基因 EBOV-GP-New （GIN/2014/Gueckedou-C07）由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；EBOV-GP（COD/1976/Yambuku-Mayinga）由加拿大 McGill 大學(xué) Chen Liang 教授惠贈(zèng)，后由本實(shí)驗(yàn)室克隆改造為 EBOV-GP-Old；攜帶熒光素酶報(bào)告基因的 HIV-luc 質(zhì)粒（pNL4-3.Luc.Eˉ）和水泡性口膜炎病毒外殼糖蛋白（vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G）質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3試劑和儀器DMEM、含 EDTA 的 0.25%胰酶、FBS 和 DNA 轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；熒光素酶活性測(cè)定試劑盒及細(xì)胞裂解液購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；人類(lèi)免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒（酶聯(lián)免疫法）購(gòu)自北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；兔抗 FLAG標(biāo)簽抗體購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；鼠抗 β-actin 抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Centro XS3LB 960 型酶標(biāo)儀為德國(guó) Berthold 公司產(chǎn)品；680 型microplate reader 酶標(biāo)儀、PowerPacTMHC Power Supply 蛋白電泳儀、Mini Trans-Blot 蛋白轉(zhuǎn)膜儀及Gel DocTMXR+凝膠成像儀均為美國(guó) Bio-Rad 公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1埃博拉病毒 GP 蛋白的表達(dá)檢測(cè)根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別將EBOV-GP-New 或 EBOV-GP-Old 與 pNL4-3.Luc.Eˉ質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至 293T 細(xì)胞，同時(shí)將轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1（+） 與 pNL4-3.Luc.Eˉ質(zhì)粒的 293T 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。培養(yǎng) 48 h 后 RIPA 裂解細(xì)胞，冰置 30 min 后于 4 ℃、13 000 r/min 離心 10 min，收集上清液，按常規(guī) Western blot 方法檢測(cè) GP 蛋白的表達(dá)，以?xún)?nèi)源 β-actin 蛋白表達(dá)為內(nèi)參對(duì)照。

1.2.2假型病毒產(chǎn)量及感染性測(cè)定將細(xì)胞按 2 × 105/ml 濃度鋪六孔板，24 h 后將 300 ng pNL-Luc-Eˉ和不同劑量（100、200、400、800、1600 ng）的EBOV-GP-New 或 EBOV-GP-Old 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。48 h 后收取上清病毒液，0.45 μm 濾膜過(guò)濾。取部分病毒液按照人類(lèi)免疫缺陷病毒抗原抗體診斷試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行病毒產(chǎn)量的測(cè)定。

將病毒液按不同稀釋比感染已鋪于 96 孔板中的 293T 細(xì)胞（細(xì)胞濃度為 2 × 105/ml），放入細(xì)胞培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)。48 h 后吸去上清液，加入 100 μl 的 1 × 細(xì)胞裂解液于 37 ℃ 裂解細(xì)胞。30 min 后吸取 10 μl 細(xì)胞裂解液與 40 μl 熒光素酶底物溶液混勻，利用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光素酶活性。

1.2.3高通量篩選流程及模型評(píng)價(jià)按 2 × 105/ml 接種 293T 細(xì)胞至 96 孔板中，培養(yǎng) 24 h后，將樣品與 293T 細(xì)胞于 37 ℃ 細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)孵育 1 h 后加入病毒液，以溶劑 DMSO 為空白對(duì)照，每組設(shè)立三個(gè)平行對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng) 48 h 后測(cè)定細(xì)胞熒光素酶活性，并計(jì)算樣品對(duì)病毒的抑制率。為了對(duì)本篩選模型的穩(wěn)定性以及本模型是否適合高通量篩選進(jìn)行判斷，按照生物技術(shù)高通量篩選模型通用的統(tǒng)計(jì)學(xué)原理的方法來(lái)計(jì)算 Z' 因子和變異系數(shù)（%CV）［6］。

1.2.4陽(yáng)性化合物量效關(guān)系的確定按照上述相同方法，用不同濃度的陽(yáng)性化合物粉防己堿（0.00128、0.0064、0.032、0.16、0.8、2、4 μmol/L）處理細(xì)胞，并以溶劑 DMSO 作為對(duì)照組，每組設(shè)立三個(gè)平行對(duì)照，通過(guò)測(cè)定熒光素酶活性計(jì)算陽(yáng)性化合物半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.5樣品初篩及活性樣品特異性分析初篩樣品（格爾德霉素及其衍生物的作用濃度為 20 μmol/L，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物的作用濃度為 1 mg/ml 和 10 μmol/L，天然產(chǎn)物的作用濃度為 15 μmol/L 或 10 μg/ml）的病毒抑制率通過(guò)上述高通量篩選流程及熒光素酶測(cè)定方法獲得。選取活性樣品，比較在 HIV-luc/EBOV-GP 與模型對(duì)照組 HIV-luc/VSVG 中的檢測(cè)結(jié)果，進(jìn)行樣品特異性評(píng)價(jià)。

2　結(jié)果

2.1扎伊爾型埃博拉重組病毒感染性分析方法測(cè)試

2.1.1編碼 EBOV-GP-New 和 EBOV-GP-Old基因的質(zhì)粒構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)［7］報(bào)道，在 NCBI 中查找扎伊爾型埃博拉病毒流行株的基因組序列（Genbank KJ660347，2031 bp），利用基因合成技術(shù)，成功將帶 FLAG 標(biāo)簽的 GP 基因克隆至真核表達(dá)載體 pcDNA3.1（+） 中，命名為 EBOV-GP-New。同時(shí)將本室現(xiàn)有的 GP 質(zhì)粒（RefSeq NC_002549.1，2031 bp）亞克隆至 pcDNA3.1（+） 載體中，命名為EBOV-GP-Old。上述兩種質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定序列正確，構(gòu)建示意圖如圖1A 所示。

圖1　Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒感染性測(cè)試［A：Zaire-EBOV 的 GP 基因示意圖；B：Zaire-EBOV GP 蛋白表達(dá)鑒定（1：EBOV-GP-Old；2：EBOV-GP-New；3：pcDNA3.1（+））；C：Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒感染后的熒光素酶活性測(cè)定（1：pcDNA3.1（+）；2：EBOV-GP-Old；3：EBOV-GP-New）］Figure 1　Test of Zaire-EBOV GP/HIV-luc pseudovirions infectivity ［A： Schematic representation of Zaire-EBOV GP genes； B：Identification of Zaire-EBOV GP expression （1： EBOV-GP-Old； 2： EBOV-GP-New； 3： pcDNA3.1（+））； C： Luciferase activity was determined 48 h post-infection （1： pcDNA3.1（+）； 2： EBOV-GP-Old； 3： EBOV-GP-New）］

圖2　GP 蛋白對(duì) Zaire-EBOV GP/HIV-luc 假病毒的產(chǎn)量及感染性的影響（A：Western blot 檢測(cè) GP 蛋白的表達(dá)情況；B：ELISA 技術(shù)檢測(cè) GP 蛋白對(duì)病毒產(chǎn)量的影響；C：通過(guò)等量假病毒感染 293T 細(xì)胞后測(cè)定熒光素酶活性來(lái)檢測(cè) GP 蛋白對(duì)病毒感染性的影響）Figure 2　Effect of GP expression on the production and infectivity of Zaire-EBOV GP/HIV-luc pseudovirus （A： The expression of GP and β-actin were detected by Western blot； B： The pseudoviral supernatants were used to determined the p24 level by ELISA kit；C： Equal amounts of pseudovirus were infected 293T cells and 48 h later， luciferase activity was determined）

2.1.2GP 蛋白的表達(dá)鑒定及 Luc 活性檢測(cè)在293T 細(xì)胞中共表達(dá)pNL4-3.Luc.Eˉ與EBOV-GP-Old 或 EBOV-GP-New，利用 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) GP 的表達(dá)情況，同時(shí)收獲病毒上清，感染 293T 細(xì)胞，48 h 后測(cè)定細(xì)胞裂解液的熒光素酶活性。結(jié)果表明，EBOV-GP-Old 或EBOV-GP-New 都能夠正確表達(dá)，且表達(dá)水平接近（圖1B）。在感染細(xì)胞中，兩者均可顯著提高熒光素酶活性，遠(yuǎn)高于對(duì)照組（圖1C）。這說(shuō)明 GP 能與 pNL4-3 共轉(zhuǎn)后包裝成具有感染性的假病毒。

2.2產(chǎn)毒條件優(yōu)化

為了優(yōu)化 Zaire-EBOV GP/HIV-luc 的產(chǎn)毒條件，我們研究了不同劑量 GP 蛋白表達(dá)質(zhì)粒與病毒產(chǎn)量和感染性的關(guān)系，以確定 GP 包膜質(zhì)粒與核心質(zhì)粒間的最佳轉(zhuǎn)染比例。結(jié)果顯示，隨著 GP 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的增加，細(xì)胞中 GP 蛋白的含量也隨之增加（圖2A）。當(dāng) EBOV-GP-Old 和 EBOV-GP-New轉(zhuǎn)染量分別為 0.2 和 0.1 μg 時(shí)，p24 含量最高（圖2B），這兩種劑量下測(cè)定的熒光素酶活性也較強(qiáng)，但相差不大（圖2C）。綜合分析病毒產(chǎn)量及其感染性?xún)梢蛩睾?，我們統(tǒng)一將 GP 與 pNL4-3.Luc 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量比例定于 2∶3，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中。

2.3高通量篩選模型的建立

為了優(yōu)化高通量篩選模型中的各個(gè)條件，我們進(jìn)一步研究病毒感染量及熒光測(cè)定時(shí)間點(diǎn)對(duì)最終熒光值的影響。將病毒液以不同比例稀釋并感染細(xì)胞，分別于 24、48 及 72 h 時(shí)檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。結(jié)果顯示，感染后 48 和 72 h 時(shí)熒光值較高，且隨著病毒稀釋比例的增加，熒光值逐漸降低（圖3）。根據(jù)以上結(jié)果，我們將病毒感染量及細(xì)胞熒光素酶活性測(cè)定時(shí)間分別設(shè)定為病毒稀釋比1∶5 和感染后 48 h。

為了評(píng)價(jià)該模型能否應(yīng)用于高通量篩選，我們使用 Z′ 因子及 %CV 值評(píng)估該模型的質(zhì)量。Z′ 因子能夠同時(shí)反映信號(hào)的動(dòng)態(tài)范圍和數(shù)據(jù)變化程度，是評(píng)價(jià)高通量篩選方法穩(wěn)定性的一個(gè)重要參數(shù)。Z′因子大于 0.5 且 %CV 值小于 20% 時(shí)，則認(rèn)為該模型符合高通量篩選標(biāo)準(zhǔn)，適用于高通量藥物篩選。表1 顯示，這兩種模型均符合高通量篩選的要求。

2.4陽(yáng)性化合物對(duì)高通量篩選模型的檢測(cè)

粉防己堿是鈣離子通道阻斷劑，具有抗炎、免疫及抗過(guò)敏等作用，同時(shí)被證明其能夠抑制埃博拉病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞且在鼠體內(nèi)的抗埃博拉研究中取得了很好療效［8］。因此，我們以粉防己堿作為陽(yáng)性化合物檢測(cè)該高通量篩選模型的靈敏性。結(jié)果顯示，不同濃度的粉防己堿與抗 EBOV-GP-Old/HIV-luc 和 EBOV-GP-New/HIV-luc 假病毒活性呈現(xiàn)較明顯的量效關(guān)系（圖4），IC50值分別為 938.7 nmol/L 和 56.13 nmol/L。

圖3　病毒稀釋比與檢測(cè)時(shí)間對(duì)熒光素酶活性的影響（A：EBOV-GP-Old/HIV-luc；B：EBOV-GP-New/HIV-luc）Figure 3　Effects of viral dilution and detection time on luciferase activities （A： EBOV-GP-Old/HIV-luc； B： EBOV-GP-New/ HIV-luc）

表1　評(píng)價(jià)高通量篩選方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)值Table 1　Summary of statistical parameters to assess its accuracy of the HTS assay

圖4　粉防己堿的劑量效應(yīng)關(guān)系（A：EBOV-GP-Old/HIV-luc；B：EBOV-GP-New/HIV-luc）Figure 4　Dose-response relationship of tetrandrine （A： EBOV-GP-Old/HIV-luc； B： EBOV-GP-New/HIV-luc）

圖5　樣品初步篩選結(jié)果（A：格爾德霉素及其衍生物；B：大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物；C：天然產(chǎn)物單體化合物）Figure 5　Results of the preliminary screening （A： Geldanamycin and its derivatives；B： Macrolides fermentation broth and monomeric compounds； C： Monomeric compounds from natural products）

2.5樣品的初步篩選

有研究表明格爾德霉素抑制埃博拉病毒的復(fù)制［9］，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)化合物具有廣譜抗病毒作用［10］。因此，我們利用 EBOV-GP-Old/HIV-luc 篩選模型對(duì)相關(guān)樣品進(jìn)行了初步篩選，包括格爾德霉素及其衍生物 21 個(gè)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物45個(gè)和天然產(chǎn)物單體化合物 176 個(gè)（圖5）。結(jié)果顯示，格爾德霉素及其衍生物中有20 個(gè)樣品對(duì) EBOV 的抑制率高于 50%，陽(yáng)性率達(dá) 95.23%。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物和天然產(chǎn)物單體化合物的陽(yáng)性率分別為48.89% 和 5.68%。

2.6活性樣品的特異性分析

為了確認(rèn)活性樣品對(duì) EBOV-GP 的作用特異性，在排除對(duì)細(xì)胞毒性因素后，還同時(shí)檢測(cè)其對(duì)VSVG/HIV-luc 感染性的影響。VSVG/HIV-luc 與EBOV-GP/HIV-luc 有相同的 HIV 骨架，只是表面表達(dá)不同的病毒膜蛋白來(lái)介導(dǎo)病毒進(jìn)入。若活性樣品只對(duì) EBOV-GP 介導(dǎo)的病毒進(jìn)入有明顯抑制作用，而對(duì) VSV 病毒沒(méi)有抑制或抑制率很低，則說(shuō)明此樣品對(duì) EBOV 具有特異性。我們對(duì)初篩中獲得的活性樣品進(jìn)行兩種包膜病毒抑制率的比較，并設(shè)依法韋倫為對(duì)照組。結(jié)果顯示，格爾德霉素及其衍生物、多數(shù)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素發(fā)酵液粗提品及單體化合物和天然產(chǎn)物同時(shí)對(duì) VSVG/HIV-luc 與EBOV-GP/HIV-luc 發(fā)揮抑制作用。最終獲得 4 種對(duì) EBOV 具有特異性抑制作用的樣品（圖6）。

3　討論

近年來(lái)，進(jìn)入抑制劑已經(jīng)成為一類(lèi)新的抗病毒藥物。EBOV-GP 蛋白介導(dǎo) EBOV 與細(xì)胞表面受體的結(jié)合，通過(guò)病毒內(nèi)吞作用和膜融合進(jìn)入宿主細(xì)胞。阻斷 EBOV-GP 介導(dǎo)的病毒進(jìn)入將有效抑制病毒感染及由其引起的細(xì)胞毒性。因此，以 EBOV-GP為靶點(diǎn)進(jìn)行抗埃博拉病毒藥物的篩選不失為一種較為理想的策略。

為了實(shí)現(xiàn)在低生物安全環(huán)境下篩選靶向EBOV-GP 蛋白的抗埃博拉活性樣品，本研究利用毒性最強(qiáng)的扎伊爾型 EBOV 的 GP 蛋白包裹 HIV核心制備復(fù)制缺陷型假病毒 EBOV-GP/HIV-luc，模仿 EBOV 的進(jìn)入過(guò)程，并通過(guò)對(duì)病毒產(chǎn)量、感染比例及時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化，建立高通量篩選模型。同時(shí)利用 Z′ 值及陽(yáng)性化合物的量效關(guān)系驗(yàn)證該模型的穩(wěn)定性和靈敏性。

1：DMSO；2：EFV（5 nmol/L）；3：C51#（15 μmol/L）；4：C126# （2.5 μg/ml）；5：C173#（5 μg/ml）；6：B6#（2.5 μmol/L）圖6　活性樣品的特異性分析Figure 6　Analysis for the specificity of samples

通過(guò)該高通量篩選模型初步獲得的活性樣品至少會(huì)有 4 種類(lèi)別：①EBOV-GP/HIV-luc 的進(jìn)入抑制劑；②HIV 復(fù)制抑制劑；③熒光素酶活性抑制劑；④細(xì)胞毒性樣品。因此，為了獲得能夠特異性抑制 EBOV 進(jìn)入過(guò)程的活性樣品，還需要利用表達(dá)不同包膜蛋白的 VSVG/HIV-luc 對(duì)初篩結(jié)果進(jìn)行特異性分析。值得說(shuō)明的是，在應(yīng)用該模型對(duì)多組樣品的初步篩選工作中，格爾德霉素及其衍生物具有較高陽(yáng)性率且抑制率可達(dá) 90% 以上，但在與VSVG/HIV-luc 包膜病毒抑制率的比較后并未表現(xiàn)出對(duì) EBOV 的特異性抑制作用。據(jù)研究報(bào)道，格爾德霉素以 Hsp90 為作用靶點(diǎn)發(fā)揮廣譜的抗病毒作用，可能是通過(guò)降解病毒的 RNA 聚合酶或影響感染性 EBOV 的出芽釋放過(guò)程［11］而對(duì)多種負(fù)鏈RNA 病毒發(fā)揮抗病毒作用的。本文的結(jié)果也表明格爾德霉素及其衍生物并不是通過(guò)阻斷 EBOV 的進(jìn)入過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)自身對(duì) EBOV 的抑制的，但是，格爾德霉素對(duì) EBOV 的高抑制率也從另一方面證明了該組樣品做為抗 EBOV 藥物的可能性。

綜上所述，本文建立的抗 EBOV 進(jìn)入藥物篩選模型，靶點(diǎn)明確，步驟簡(jiǎn)單，穩(wěn)定靈敏，可應(yīng)用于高通量篩選影響 EBOV 進(jìn)入過(guò)程的活性樣品。抗 EBOV 進(jìn)入藥物篩選模型的建立有助于推動(dòng)特異性藥物機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)新的抗埃博拉病毒的有效藥物。

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Author Affiliation: Department of Immunobiology， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College， Beijing 100050， China

www.cmbp.net.cnChin Med Biotechnol, 2016, 11(3):193-199

Establishment and application of screening assay for EBOV entry inhibitor

WANG Jing， CHEN Shu-min， MA Ling， ZHANG Rui-xin， LI Zhuo-rong， YU Li-yan， CEN Shan

【Abstract】

ObjectiveTo establish a screening assay for EBOV entry inhibitors targeting EBOV glycoprotein and to screen samples with specific inhibition on the entry of EBOV by the models.

MethodsBy cell-based recombinant virus technology， the recombinant virus （EBOV-GP-Old/HIV-luc and EBOV-GP-New/ HIV-luc） were prepared by HIV core （pNL4-3.Luc） packed with two epidemic strains of EBOV glycoprotein， followed by further optimization of viral yield， infectivity， infection dose and determination time of luciferase activity. The stability and sensitivity of the assays were evaluated according to statistical parameters and positive compounds. 242 samples were screened and the vesicular stomatitis G packed pseudovirions （VSVG/HIV-luc） were used for analysis of sample specificity.

ResultsThe assay for EBOV entry inhibitors targeting GP protein was established. 4 samples were found to show the specific inhibition on the entry of EBOV using the HTS assay.

ConclusionThe assay is suitable for anti-EBOV drug screening and the obtained positive samples may lead toward the discovery of EBOV drugs.

【Key words】Ebolavirus；High-throughput screening assays；Entry inhibitor

DOI：10.3969/j.issn.1673-713X.2016.03.001

基金項(xiàng)目：“重大新藥創(chuàng)制”國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09301002-001-015）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81501756）；國(guó)家微生物生物資源平臺(tái)（NIMR-2015-3）

通信作者：岑山，Email：shancen@imb.pumc.edu.cn

收稿日期：2015-12-16

Corresponding Author:CEN Shan， Email： shancen@imb.pumc.edu.cn