Cu2+脅迫對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性的影響

張　娟，魏克強(qiáng)，趙　婷（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006）

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Cu2+脅迫對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性的影響

張娟，魏克強(qiáng)*，趙婷
（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原030006）

摘要：重金屬銅是養(yǎng)殖水體的主要污染物，嚴(yán)重影響甲殼動物的免疫機(jī)能。以淡水克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）為實驗對象，以亞致死濃度（1.0、3.0、5.0、10.0 mg·L-1，96-h LC50=22.14 mg·L-1）的Cu2+為脅迫因子，采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法，通過分析血細(xì)胞內(nèi)酚氧化酶原（proPO）、絲氨酸蛋白酶（SP）以及血淋巴中酚氧化酶（PO）、血藍(lán)蛋白（Hc）和血細(xì)胞數(shù)（THC）的水平，探討了Cu2+脅迫對酚氧化酶原激活系統(tǒng)（proPO-AS）活性的影響。結(jié)果表明，與未染毒的對照組相比，Cu2+顯著抑制proPO、PO的活性以及THC、Hc的含量（P＜0.05）；但僅在10.0 mg·L-1Cu2+濃度下，SP的活性顯著降低（P＜0.05）。研究結(jié)果提示，水體Cu2+對螯蝦具有免疫毒性效應(yīng)，氧化應(yīng)激導(dǎo)致的血細(xì)胞數(shù)、血藍(lán)蛋白含量、絲氨酸蛋白酶活性抑制可能是影響proPO-AS活性的主要機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：克氏原螯蝦；血藍(lán)蛋白；酚氧化酶；絲氨酸蛋白酶；Cu2+

張娟，魏克強(qiáng)，趙婷. Cu2+脅迫對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）酚氧化酶原激活系統(tǒng)活性的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2016, 35（5）：865-870.

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當(dāng)前，我國水域生態(tài)環(huán)境的污染狀況日益嚴(yán)重，《2012年中國環(huán)境狀況公報》指出，重金屬銅（Cu）已成為內(nèi)陸漁業(yè)水域最主要的污染物之一，其超標(biāo)范圍仍在持續(xù)擴(kuò)大。污染水體中，羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、保羅美對蝦（Farfantepenaeus paulensis）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）等甲殼動物的血細(xì)胞數(shù)減少、血藍(lán)蛋白的合成下調(diào)、酚氧化酶的活性降低，進(jìn)而對病原體的易感性顯著升高［1-4］。作為一種必需微量元素，Cu雖然是甲殼動物血藍(lán)蛋白（Hc）、酚氧化酶原（proPO）、酚氧化酶（PO）、氧化物歧化酶（SOD）等重要免疫因子的組成成分［5-6］，但高濃度Cu2+會導(dǎo)致體內(nèi)活性氧自由基（ROS）的水平提高，產(chǎn)生毒性效應(yīng)。研究表明，適量的ROS有助于機(jī)體的免疫防御，如對蝦血細(xì)胞“呼吸暴發(fā)”釋放的羥自由基（·OH）、超氧陰離子（O-2·）、過氧化氫（H2O2）等活性氧中間產(chǎn)物（ROIs）是吞噬殺滅病原菌的重要屏障［1，7］；大量的ROS則造成氧化損傷，組織蛋白羰基化，顯著抑制體液免疫水平［8-9］。H2O2還能夠激活細(xì)胞膜上獨(dú)立的配體，氧化胞內(nèi)的酪氨酸蛋白激酶（PTK），抑制蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）活性，損傷T淋巴細(xì)胞與NK細(xì)胞［7］。目前，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是重金屬Cu的主要免疫毒性機(jī)制之一。

甲殼動物的免疫防御依賴于天然免疫應(yīng)答，主要由細(xì)胞免疫與體液免疫組成。其中，酚氧化酶原激活系統(tǒng)（Prophenoloxidase activating system，proPO-AS）是重要的識別系統(tǒng)，在血淋巴的小顆粒細(xì)胞（SGC）與顆粒細(xì)胞（GC）中合成、儲存和釋放，由proPO、PO、模式識別蛋白（PRP）、絲氨酸蛋白酶（SP）及其抑制劑等多種成分組成，被病原微生物細(xì)胞表面的脂多糖、肽聚糖等分子特異性激活后，無活性的proPO形成具有免疫活性的PO，在這一系列的級聯(lián)反應(yīng)中絲氨酸蛋白酶發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［10-11］。甲殼動物的血藍(lán)蛋白是占血淋巴總蛋白90%以上的含銅呼吸蛋白，近年來發(fā)現(xiàn)，其具有兩種亞基類型：HC1（具有廣譜抗菌肽的功能）和HC2（氨基末端被蛋白水解后可表現(xiàn)出PO活性）［12］，而Cu濃度升高可增加HC2的mRNA合成［13］。這表明，甲殼動物血淋巴中的血細(xì)胞數(shù)、血藍(lán)蛋白含量以及血細(xì)胞內(nèi)的proPO、SP和PO水平與proPOAS的活性密切相關(guān)，但對重金屬污染物Cu是如何調(diào)控proPO-AS的機(jī)制還不清楚。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）隸屬于節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、螯蝦科（Crayfish），原產(chǎn)于墨西哥北部和美國南部［14］，目前已成為我國重要的淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，2013年產(chǎn)量達(dá)50萬t。克氏原螯蝦對外界環(huán)境條件的要求低，富集重金屬的能力強(qiáng)，給該產(chǎn)品品質(zhì)和質(zhì)量安全帶來了潛在的影響。近年來它被廣泛應(yīng)用于甲殼動物免疫學(xué)研究以及指示環(huán)境污染的模式實驗動物［15-16］。基于此，本實驗以Cu2+為脅迫因子，淡水克氏原螯蝦為模式生物，通過分析不同濃度和時間暴露下，其血細(xì)胞內(nèi)酚氧化酶原、絲氨酸蛋白酶活性以及血淋巴中酚氧化酶、血藍(lán)蛋白和血細(xì)胞水平的變化，為甲殼動物免疫毒理學(xué)的研究提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料與試劑

1.1.1材料

健康活潑、螯肢完整的克氏原螯蝦，體長（8.3± 0.5）cm、體重（18.9±4.9）g，購自太原市五龍口水產(chǎn)市場。實驗前，在充分曝氣的玻璃水族箱（45 cm×30 cm×30 cm）內(nèi)暫養(yǎng)7 d，每日定時換水、投喂餌料，水溫為（26±2）℃，實驗前24 h停止飼喂。

1.1.2試劑

硫酸銅CuSO4·5H2O為分析純（天津市登峰化學(xué)試劑廠），實驗前用蒸餾水配制10 g·L-1的Cu2+母液備用；L-DOPA、LPS、BAPNA等購自Sigma公司。

1.2試驗方法

1.2.1染毒與采樣

采用靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法。在前期測得的96 h半致死濃度（LC50=22.14 mg·L-1）的基礎(chǔ)上，將Cu2+濃度分別設(shè)置為1.0、3.0、5.0、10.0 mg·L-1（近似于96 h-LC50的1/20、1/7、1/4和1/2）4個處理組，并設(shè)不添加Cu2+的對照組。每組處理15尾螯蝦，同時設(shè)置3個重復(fù)。分別于染毒24、48、72、96 h隨機(jī)抽取3尾，每個處理組共取9尾螯蝦，置于冰上麻醉15 min后，用含抗凝劑（葡萄糖2.05 g、檸檬酸鹽0.8 g、NaCl 0.2 g，雙蒸水稀釋到100 mL）的1.0 mL注射器圍心腔抽取血淋巴液。

1.2.2血細(xì)胞裂解液的制備

參考Hernández-López等［17］的方法制備血細(xì)胞裂解液（HLS）。將抽取的血淋巴液700×g、4℃離心15 min（ZONKIA KDC-140HR，中國），上清液作為血清樣品-80℃保存?zhèn)溆?；沉淀用同體積生理鹽水重懸后，700×g、4℃離心15 min，棄上清，再次用同體積的生理鹽水重懸混勻，之后轉(zhuǎn)移到超聲波細(xì)胞破碎儀（Scientz-ID，中國）處理1 min，再經(jīng)15 000×g、4℃離心20 min后，上清液即為血細(xì)胞裂解液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3血細(xì)胞數(shù)量的測定

參考Nicosia等［18］的方法，取20 μL血淋巴液甲醛固定，然后滴加到血細(xì)胞計數(shù)板中，在光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51，日本）下計數(shù)。

1.2.4血藍(lán)蛋白含量的測定

參考Qiu等［19］的方法，將血清稀釋為10%的溶液，在酶標(biāo)儀（Spectra Max M5，美國）上測定334 nm處的吸光度值。血藍(lán)蛋白含量（mmol·L-1）=（所測吸光度值×反應(yīng)液總體積）/（消光系數(shù)2.69×待測樣品體積）。

1.2.5酚氧化酶原系統(tǒng)活性的測定

以L-DOPA為底物，參考Ashida［20］和Perazzolo等［21］的方法進(jìn)行測定。酚氧化酶活性：取100 μL血清與100 μL 20 mg·mL-1的L-DOPA混勻，在490 nm下讀取吸光度值（Spectra Max M5，美國），每隔30 s讀取一次，共讀取10 min。酚氧化酶原活性：取100 μL HLS加入50 μL的胰蛋白酶（1 mg·mL-1）作為激活劑，25℃放置10 min，之后加入50 μL L-DOPA，5 min后加入800 μL磷酸緩沖液（pH7），于490 nm處每隔30 s讀取吸光度值，共讀取10 min。均以1 mL血清每分鐘OD490增加0.001為一個酶活單位（U·mL-1）。

參考Pan等［22］的方法，以BAPNA為底物進(jìn)行絲氨酸蛋白酶活性檢測。取100 μL HLS與1 mg·mL-1LPS進(jìn)行混合，室溫放置15 min，加入500 μL Tris-HCl緩沖液，30℃孵育30 min，隨后加入200 μL 50%乙酸終止反應(yīng)。對照組用TBS取代HLS。用酶標(biāo)儀（Spectra Max M5，美國）在405 nm下讀取光密度值。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示。利用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異性顯著（圖中以*表示）。

2　結(jié)果與分析

2.1Cu2+脅迫對血細(xì)胞數(shù)的影響

如圖1所示，整個實驗期間對照組的總血細(xì)胞數(shù)（THC）無明顯變化。隨染毒時間的延長，Cu2+（1.0～10 mg·L-1）脅迫下，螯蝦的THC明顯降低（P＜0.05），以10 mg·L-1Cu2+脅迫尤為顯著。低濃度（1.0～3.0 mg·L-1）處理組染毒48 h THC呈現(xiàn)出適應(yīng)性調(diào)整的趨勢，而高濃度（5.0～10.0 mg·L-1）保持著對THC的抑制。

2.2Cu2+脅迫對血藍(lán)蛋白含量的影響

在96 h暴露期間，以1.0 mg·L-1與10 mg·L-1Cu2+對血清血藍(lán)蛋白（Hc）含量的抑制尤為明顯（P＜0.05）。隨著染毒時間的延長，3.0 mg·L-1與5.0 mg·L-1Cu2+脅迫下，Hc含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05），呈現(xiàn)出先降低后增加并逐步恢復(fù)到正常水平的趨勢（圖2）。

2.3Cu2+脅迫對酚氧化酶活性的影響

由圖3可見，不同濃度的Cu2+對血清酚氧化酶（PO）活性均有顯著的抑制作用（P＜0.05）。隨著暴露時間的延長，1.0、3.0 mg·L-1Cu2+處理組PO活性逐漸下降，5.0、10.0 mg·L-1Cu2+處理組PO活性逐漸上升。在染毒96 h后，低濃度Cu2+（1.0～3.0 mg·L-1）比高濃度Cu2+（5.0～10 mg·L-1）的影響更為顯著。

圖1　不同濃度Cu2+脅迫對克氏原螯蝦血細(xì)胞數(shù)的影響Figure 1 Effects of different Cu2+concentrations on total haemocytecount（THC）in hemolymph of P. clarkii

圖2　不同濃度Cu2+脅迫對克氏原螯蝦血清中血藍(lán)蛋白含量的影響Figure 2 Effects of different Cu2+concentrations on hemocyanin content in serum of P. Clarkii

圖3　不同濃度Cu2+脅迫對克氏原螯蝦血清中酚氧化酶活性的影響Figure 3 Effects of different Cu2+concentrations on PO activity in serum of P. Clarkii

2.4Cu2+脅迫對絲氨酸蛋白酶活性的影響

與對照組相比，5.0 mg·L-1與10 mg·L-1Cu2+染毒48 h顯著抑制了絲氨酸蛋白酶（SP）活性（P＜0.05）。96 h后，3.0 mg·L-1與10 mg·L-1處理組的SP活性顯著下降（P＜0.05）。整個實驗期間，10 mg·L-1Cu2+對SP活性的影響最為明顯（圖4）。

2.5Cu2+脅迫對酚氧化酶原活性的影響

如圖5所示，與對照組相比，不同濃度的Cu2+對血細(xì)胞內(nèi)酚氧化酶原（proPO）活性均有抑制作用（P＜0.05）。在不同的染毒時間，分別以1.0 mg·L-1（24 h）、5.0 mg·L-1（48 h）、10 mg·L-1（72 h和96 h）Cu2+對proPO活性的影響最顯著。這與PO活性隨Cu2+濃度梯度的變化規(guī)律不太一致，似乎表明在由無活性的酶原轉(zhuǎn)換為有活性酶的過程中某些因素起著調(diào)控作用。

綜合上述結(jié)果，染毒96 h，高濃度Cu2+（10 mg·L-1）對血淋巴血細(xì)胞數(shù)、血藍(lán)蛋白含量、酚氧化酶活性以及血細(xì)胞內(nèi)酚氧化酶原、絲氨酸蛋白酶水平的抑制效應(yīng)最為明顯。暴露48～72 h，低濃度Cu2+（3.0、5.0 mg· L-1）染毒對各指標(biāo)也有不同程度的抑制作用。同時發(fā)現(xiàn)，在染毒24 h時，1.0 mg·L-1Cu2+對血藍(lán)蛋白含量和酚氧化酶活性具有增強(qiáng)作用?？梢?，Cu2+暴露72 h導(dǎo)致的血細(xì)胞數(shù)目減少、血細(xì)胞中proPO水平下降可能是造成血清中PO活性下降的主要原因。隨著暴露時間延長至96 h，proPO、SP的活性受到抑制，但血藍(lán)蛋白的含量逐漸上升，PO活性也明顯上升，表明部分血藍(lán)蛋白可能表現(xiàn)出了PO活性。

圖4　不同濃度Cu2+脅迫對克氏原螯蝦血清中絲氨酸蛋白酶酶活性的影響Figure 4 Effects of different Cu2+concentrations on serine proteinase activity in HLS of P. Clarkii

圖5　不同濃度Cu2+脅迫對克氏原螯蝦HLS中酚氧化酶原活性的影響Figure 5 Effects of different Cu2+concentrations on proPO activity in HLS of P. Clarkii

3　討論

一些研究顯示，低濃度的Cu2+會降低螯蝦的攝食能力，10 mg·L-1Cu2+染毒3 h后其心跳速率明顯下降［23-24］。在96 h染毒期間，隨著暴露時間的延長和濃度的增加，螯蝦的活動性明顯減弱甚至靜止于水底，有的因呼吸困難浮在水面，機(jī)體的生理機(jī)能逐漸降低。

免疫系統(tǒng)對外部環(huán)境的擾動極其敏感，是研究污染物毒性效應(yīng)的理想靶位點。穩(wěn)定的血細(xì)胞數(shù)和血藍(lán)蛋白水平可以反映甲殼動物的健康狀況，因此PO活性是評價其免疫功能的重要標(biāo)志［10］。克氏原螯蝦的血細(xì)胞有三種類型（透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞和顆粒細(xì)胞），在天然免疫防御中發(fā)揮著吞噬、包囊、黑化等重要作用。在污染物脅迫下，羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、保羅美對蝦（Farfantepenaeus paulensis）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）等蝦類的血細(xì)胞總數(shù)（THC）顯著下降［1，3-4，25］，與螯蝦的觀察結(jié)果基本一致。這可能是由于Cu2+產(chǎn)生的過量ROS會導(dǎo)致血細(xì)胞凋亡或壞死［26］，鰓、肝胰腺等組織的氧化損傷使大量的血細(xì)胞從血淋巴向組織器官遷移［1，8，27］。甲殼動物血藍(lán)蛋白的氨基酸序列、蛋白結(jié)構(gòu)與酚氧化酶具有高度的相似性，推測它們可能起源于共同的祖先蛋白［6］。血藍(lán)蛋白的亞基類型HC2，其氨基末端被蛋白水解后能夠表現(xiàn)出PO活性［12］。在Cu2+脅迫下，克氏原螯蝦肝胰腺中血藍(lán)蛋白HC2的mRNA表達(dá)升高，合成的血藍(lán)蛋白釋放進(jìn)入循環(huán)血淋巴中［13］。本實驗還表明，1.0 mg·L-1Cu2+暴露24 h，可以促進(jìn)螯蝦血藍(lán)蛋白的合成，與Osuna-Jimenéz等［13］的研究結(jié)果一致；但當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到3.0 mg·L-1以上時，血藍(lán)蛋白含量顯著低于對照組。這可能是由于高濃度的Cu2+會造成蛋白質(zhì)、核酸等大分子的氧化損傷，產(chǎn)生蛋白質(zhì)羰基化、DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)等效應(yīng)，從而抑制其合成、降低其載氧功能和PO活性，影響機(jī)體的健康狀況［8，27］。也有研究認(rèn)為，血藍(lán)蛋白含量先上升后下降的變化可能是由于其mRNA表達(dá)序列標(biāo)記的多態(tài)位點不同所造成的［13］。由此可見，Cu2+脅迫對血淋巴中的血細(xì)胞數(shù)與血藍(lán)蛋白可能具有不同的調(diào)控機(jī)制。

在血細(xì)胞內(nèi)，無活性的proPO通過絲氨酸蛋白酶參與調(diào)控的級聯(lián)反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腜O。研究顯示，低劑量的Cu2+可以激活甲殼動物的proPO，Cu2+濃度增加后又顯著抑制proPO和PO的水平［8，28］。本研究中，隨著染毒濃度和暴露時間（如5.0 mg·L-1Cu2+，48 h；10 mg·L-1Cu2+，96 h）的增加，絲氨酸蛋白酶的活性明顯下降，同時血細(xì)胞中的proPO與血清中的PO活性也受到了顯著抑制。這提示我們，Cu2+可能參與了血細(xì)胞內(nèi)proPO-AS的調(diào)控，這3種酶活性的變化可能都與氧化應(yīng)激有關(guān)［1，7-9，29］。

甲殼動物的proPO-AS的組成復(fù)雜，激活路徑涉及多種成分，PO活性受多種因素影響，研究結(jié)果可能與染毒劑量、暴露時間、受試動物、環(huán)境條件等因素有關(guān)，其確切機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。在96 h的染毒期間，與血藍(lán)蛋白、絲氨酸蛋白酶相比，血細(xì)胞數(shù)和proPO、PO活性對水體1.0～10.0 mg·L-1Cu2+更為敏感，可以作為評價Cu2+免疫毒性的標(biāo)志物。

4　結(jié)論

（1）低濃度（1.0 mg·L-1）的Cu2+也具有免疫毒性，在染毒96 h后，隨著濃度的增加，Cu2+能夠抑制血淋巴中的血細(xì)胞數(shù)、血藍(lán)蛋白含量與酚氧化酶活性，三者的變化規(guī)律基本一致，以10 mg·L-1Cu2+最為顯著。

（2）當(dāng)濃度最高達(dá)10 mg·L-1時，Cu2+還會抑制proPO-AS中的酚氧化酶原、酚氧化酶、絲氨酸蛋白酶活性，Cu2+可能參與了proPO-AS的調(diào)控。

（3）螯蝦血細(xì)胞及其胞內(nèi)外的蛋白成分，如血藍(lán)蛋白、絲氨酸蛋白酶、酚氧化酶及其酶原，具有不同的生理作用與理化性質(zhì)，Cu2+誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可能通過不同的機(jī)制對其進(jìn)行調(diào)控。

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中圖分類號：X503.225

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-2043（2016）05-0865-06

doi:10.11654/jaes.2016.05.007

收稿日期：2015-11-08

基金項目：教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金（200801081012）;山西省人才引進(jìn)與開發(fā)專項基金項目（2006）

作者簡介：張娟（1988—），女，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士研究生，從事水生生物學(xué)方面的研究。E-mail：15935113601@163.com

*通信作者：魏克強(qiáng)E-mail：kqwei@sxu.edu.cn；kqwei88@aliyun.com

Effect of Cu2+stress on activity of prophenoloxidase activating system in Procambarus clarkii

ZHANG Juan, WEI Ke-qiang*, ZHAO Ting
（School of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China）

Abstract：Copper（Cu）is one of ubiquitous contaminants in the aquatic environment, causing potential immunotoxicity to crustacean. In the present study, the effect of Cu2+stress on prophenoloxidase activating system（proPO-AS）, the most important component of innate defense, was evaluated in freshwater crayfish Procambarus clarkii. After 96 h exposure to sub-lethal concentrations（0, 1.0, 3.0, 5.0 mg·L-1and 10.0 mg·L-1）of Cu2+, the activities of prophenoloxidase（proPO）and serine protease（SP）in hemocyte lysate supernatant（HLS）and the levels of total haemocyte count（THC）, phenoloxidase（PO）, and hemocyanin（Hc）in haemolymph were determined. Results indicated that there was a significant reduction（P＜0.05）in crayfish immunocompetence, including proPO, PO, THC, and Hc, at higher Cu2+concentrations. The SP activity was obviously inhibited only at 10.0 mg·L-1Cu2+. The aqueous Cu2+may play an important role in regulating proPO-AS by inhibiting THC, Hc, and SP. The immune factors, such as THC, proPO, and PO, could be considered as sensitive biomarkers of immunotoxicity in crayfish species.

Keywords：Procambarus clarkii；hemocyanin；phenoloxidase；serine protease；Cu2+