《現(xiàn)代生物科技專(zhuān)題》中克隆技術(shù)的研究

山東省章丘市第四中學(xué)生物組 陳 燕

克?。ㄓ⒄Z(yǔ)：Clone），在廣義上是指利用生物技術(shù)由無(wú)性生殖產(chǎn)生與原個(gè)體有完全相同基因組后代的過(guò)程。在生物學(xué)上，是指選擇性地復(fù)制出一段DNA序列（分子克?。?、細(xì)胞（細(xì)胞克隆）或個(gè)體（個(gè)體克?。?。

一、分子水平的克隆—PCR技術(shù)

該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴(lài)于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)。

PCR由三個(gè)基本反應(yīng)步驟：①模板DNA的高溫變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解旋，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合；②模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的適溫延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的鏈。重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。

二、細(xì)胞水平的克隆—?jiǎng)游锛?xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是用酶解法將組織碎塊分離成單個(gè)細(xì)胞，用培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸浮液，在體外適宜條件下使細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，并保留一定的結(jié)構(gòu)和功能特性。

（一）細(xì)胞培養(yǎng)所需的條件

1.培養(yǎng)液

現(xiàn)多用合成培養(yǎng)液。合成培養(yǎng)液有多種，不同培養(yǎng)液適用于不同細(xì)胞?？筛鶕?jù)培養(yǎng)細(xì)胞的特殊要求進(jìn)行添加：抗生素、有機(jī)補(bǔ)充物（如丙酮酸鈉，谷胺酰氨等）、促細(xì)胞分裂因子（生長(zhǎng)因子類(lèi)的FGF等）、貼壁和鋪展因子（如膠原蛋白，纖粘蛋白等）。

2.血清

在細(xì)胞培養(yǎng)液中必須添加一定量的血清方能獲得成功。血清中除了含有細(xì)胞生長(zhǎng)的部分氨基酸外，還有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和貼壁的成分。不同動(dòng)物血清的作用差別很大，即使同一種動(dòng)物的不同個(gè)體間的差異也很顯著。不同種細(xì)胞要求血清量也不同，大部分細(xì)胞生長(zhǎng)液中加入10%血清已可滿足細(xì)胞生長(zhǎng)要求。目前國(guó)內(nèi)外正在研制無(wú)血清培養(yǎng)液，以避免血清中某些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒復(fù)制的影響。

3.PH

細(xì)胞生長(zhǎng)的PH為6.6－7.8，但最適PH 7.0－7.4。培養(yǎng)液中的緩沖體系主要是碳酸氫鹽、磷酸氫鹽和血清。

4.溫度

細(xì)胞培養(yǎng)的最適宜溫度應(yīng)與細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物體溫一致。

此外，成功的細(xì)胞培養(yǎng)還需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作及潔凈的培養(yǎng)器皿。

（二）細(xì)胞生長(zhǎng)的三個(gè)階段

1.潛伏期

細(xì)胞從接種到貼壁生長(zhǎng)繁殖的一段時(shí)間。

2.指數(shù)生長(zhǎng)期

指數(shù)生長(zhǎng)期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期，在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)3-5d后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多，生長(zhǎng)空間日趨減少，細(xì)胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)分正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。

3.停滯期

即細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞與營(yíng)養(yǎng)液的交換面積減少，代謝產(chǎn)物積累，PH下降細(xì)胞停止增殖，進(jìn)入停滯期。

（三）動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)

1.原代細(xì)胞（primary cell）

動(dòng)物組

織經(jīng)胰蛋白酶等消化、分散、獲得單個(gè)細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中大多數(shù)組織均可制備原代細(xì)胞，但生長(zhǎng)的快慢及難易程度不一。原代細(xì)胞一般對(duì)病毒較易感染，尤其是來(lái)源于胚胎或幼畜組織的細(xì)胞。

2.二倍體細(xì)胞株（diploid cell strain）

將長(zhǎng)成的原代細(xì)胞消化分散成單個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)傳代，其細(xì)胞染色體數(shù)與原代細(xì)胞一樣，仍為二倍體。此種細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)大，對(duì)病毒的易感性則基本無(wú)變化。

3.傳代細(xì)胞系（establishell cell line）

與上述兩類(lèi)細(xì)胞不同，這類(lèi)細(xì)胞在傳代過(guò)程中染色體發(fā)生異常變異，在體外可無(wú)限制分裂。

三、個(gè)體水平的克隆—?jiǎng)游锛?xì)胞核移植技術(shù)

所謂細(xì)胞核移植技術(shù)，就是將供體細(xì)胞核移入除去核的卵母細(xì)胞中，使后者不經(jīng)過(guò)精子穿透等有性過(guò)程即可被激活、分裂并發(fā)育成新個(gè)體，使得核供體的基因得到完全復(fù)制。

（一）供體核的獲得

供體核可以是早期胚胎細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和體細(xì)胞。早期都采用合子核到64細(xì)胞期的胚胎細(xì)胞核質(zhì)體分裂球作供體細(xì)胞核，80年代開(kāi)始，隨著胚胎干細(xì)胞(embryo stem cells，ES)的建立和對(duì)其研究的深入，人們對(duì)胚胎干細(xì)胞在核移植方面的應(yīng)用前景寄予厚望，但ES建系太困難，僅在小鼠上獲得成功。1997年Dolly羊的出現(xiàn)，開(kāi)始了體細(xì)胞的核移植，并發(fā)展很快。

（二）受體細(xì)胞去核

作為細(xì)胞核移植的受體細(xì)胞主要有三類(lèi)∶去核的卵母細(xì)胞、受精卵和2-細(xì)胞胚胎，其中卵母細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛。研究證明，體外成熟培養(yǎng)的卵母細(xì)胞核移植成功率不如體內(nèi)成熟的卵母細(xì)胞，其原因可能是卵母細(xì)胞在體外成熟過(guò)程中，需要合成一些蛋白質(zhì)來(lái)完成第一次減數(shù)分裂，其活動(dòng)有可能受到抑制。

（三）核卵重組

在顯微操作儀操縱下，用一直徑接近卵裂球大的移植針吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核的受體卵母細(xì)胞的間隙中，根據(jù)移入的部位不同，可分為帶下移植和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)注射。在移植針移開(kāi)后，對(duì)移植卵裂球上方的透明帶施加壓力使卵裂球與卵母細(xì)胞接觸。

（四）細(xì)胞融合與激活

由于卵細(xì)胞去核過(guò)程中破壞了卵膜和一部分細(xì)胞質(zhì)，若直接移植，成功率很低，故需對(duì)重組胚融合，其采用的方法有仙臺(tái)病毒法、物理或化學(xué)方法(如電融合法、鈣離子載體、乙醇、蛋白質(zhì)酶合成抑制劑等)激活受體細(xì)胞，使其完成細(xì)胞分裂和發(fā)育過(guò)程，電融合法更常用。

（五）重構(gòu)胚培養(yǎng)與移植

重構(gòu)胚需一定時(shí)間的培養(yǎng)，方可移植到受體，家兔和豬重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)24h以?xún)?nèi)，就可通過(guò)非手術(shù)移植，而羊和牛重構(gòu)胚所需培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般發(fā)育到囊胚或桑椹胚時(shí)移植。