殼聚糖中蛋白質(zhì)含量測定方法的研究

【作者】韓婷，史國華，李素哲，劉俊英 河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)研究院，石家莊市，05006 石家莊億生堂醫(yī)用品有限公司，石家莊市，05000

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殼聚糖中蛋白質(zhì)含量測定方法的研究

【作者】韓婷1，史國華1，李素哲2，劉俊英2
1 河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)研究院，石家莊市，050061
2 石家莊億生堂醫(yī)用品有限公司，石家莊市，050200

【摘要】目的 解決殼聚糖中蛋白質(zhì)含量測定時(shí)出現(xiàn)的沉淀問題。方法 對考馬斯亮藍(lán)法測定殼聚糖中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行方法改進(jìn)。結(jié)果 用鹽酸濃度為5%的考馬斯亮藍(lán)溶液作為染色劑，染色15 min，在最大吸收波長598 nm處進(jìn)行測定；吸光度-蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.003x+0.017 9，r2=0.991，蛋白質(zhì)濃度范圍為5 μg/mL～40 μg/mL時(shí)線性相關(guān)性良好；最低檢出限1 μg/mL，加標(biāo)回收率97.8%～103.7%。結(jié)論 該文確定的殼聚糖中蛋白質(zhì)含量的檢測方法準(zhǔn)確性高、試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、可靠，重現(xiàn)性強(qiáng)，可廣泛用于產(chǎn)品檢驗(yàn)。

【關(guān) 鍵 詞】蛋白質(zhì)含量；殼聚糖；考馬斯亮藍(lán)法；鹽酸

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，是一種天然堿性多糖[1-2]，具有抗菌、止血、止痛作用[3]，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。目前，考馬斯亮藍(lán)法被應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的檢測，但實(shí)際檢測殼聚糖中蛋白質(zhì)含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，染色20 s即出現(xiàn)沉淀，影響測定結(jié)果。為此，我們進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，并對該方法進(jìn)行了改良。

1　儀器和試劑

原料 殼聚糖(石家莊億生堂醫(yī)用品有限公司)。

儀器 UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理（中國）有限公司）；SK-1型快速混勻器（江蘇中大儀器廠）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

試劑 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma 公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250（Sigma公司）；95%乙醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，AR)；鹽酸（天津市永大化學(xué)試劑有限公司，AR）；實(shí)驗(yàn)用水為純化水。

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1配制試劑

(1) 考馬斯亮藍(lán)溶液 稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶解于50 mL的95%乙醇中，加鹽酸50 mL，并用水稀釋至1000 mL，置棕色瓶中，室溫貯存。

(2) 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液 稱取約25 mg牛血清白蛋白（預(yù)先置于含五氧化二磷的真空干燥器中真空干燥至恒重），置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。4oC下貯存，作為原液。臨用時(shí)，取5 mL原液，加純化水稀釋成50 μg/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)液。

(3) 供試品溶液 取殼聚糖1.0 g，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用1%乙酸溶液溶解并稀釋至刻度，混勻，作為供試液。

2.2最大吸收波長

精密移取2 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液于25 mL比色管中，加入10 mL考馬斯亮溶液，用快速混勻器使試管中溶液充分混合，室溫放置15 min，于400～700 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，取2 mL殼聚糖溶液同法操作，結(jié)果見圖1。

圖1　蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)掃描圖譜Fig.1 Scanning spectrum of protein with Coomassie brilliant blue

標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的最大吸收波長均在598 nm處，確定該波長為檢測波長。

2.3鹽酸濃度的選擇

取2 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液7份，加考馬斯亮藍(lán)溶液10 mL（其中鹽酸濃度分別為3%、4%、4.5%、5 %、6%、7 %、9 % (V/V)），快速混勻器使其混合均勻，室溫放置15 min，于598 nm波長處測定吸光度，見表1。

表1　鹽酸濃度選擇Tab.1 Selection of hydrochloric acid concentration

由表1可見，體系反應(yīng)相同的時(shí)間，鹽酸濃度越高，598 nm處的吸光度值越小，靈敏度越差。但實(shí)際檢測時(shí)，鹽酸濃度小于4.5%，反應(yīng)體系有沉淀產(chǎn)生，影響結(jié)果準(zhǔn)確性。因此，為了保證檢測結(jié)果的可靠性，從靈敏度和準(zhǔn)確性兩方面考慮，選擇鹽酸濃度為5%。

2.4染色時(shí)間的選擇

取2 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加10 mL鹽酸濃度5 %的考馬斯亮藍(lán)溶液，快速混合器使其混合均勻，室溫放置，每隔一定時(shí)間對于同一樣品取樣測定，持續(xù)1 h，結(jié)果見表2。

表2　反應(yīng)時(shí)間Tab.2 Reaction time

從表2可以看出，反應(yīng)體系于室溫放置15 min后吸光度值已基本穩(wěn)定，且1 h內(nèi)的吸光度值基本不變，穩(wěn)定性較好，因此確定染色時(shí)間確定為15 min。

2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6個(gè)試管，編號為0～5，向其中依次加入0、 0. 2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液（50 μg/mL），然后用純化水補(bǔ)齊至2 mL，配制成濃度依次為0、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后再依次向其中加入10 mL的考馬斯亮藍(lán)G-250溶液，用快速混勻器使試管中溶液充分混勻，室溫放置15 min后，用0號管作空白，于598 nm波長處測定吸光度值，繪制吸光度值-蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。

圖2　蛋白質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of protein solution

標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.003x+0.017 9，r2=0.991，線性相關(guān)性良好，線性范圍為5～40 μg/mL，最低檢出限1 μg/mL。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可靠，對同一蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液用鹽酸濃度5%的考馬斯亮藍(lán)溶液染色15 min，于598 nm重復(fù)測定6次，結(jié)果見表3。

表3　重復(fù)性試驗(yàn)Tab.3 Repeatability test

同一樣品重復(fù)測定6次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=1.4%，說明該方法重復(fù)性好。

2.7加標(biāo)回收率

稱取4份質(zhì)量均為1.0 g的殼聚糖，分別置于4個(gè)100 mL容量瓶中，加入適量1%乙酸溶液溶解，然后用移液槍依次取2 mL、4 mL、6 mL濃度為500 μg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液原液，分別置于三份殼聚糖溶液中，最后用1%乙酸溶液定容至100 mL；分別量取2 mL上述溶液于4個(gè)25 mL比色管中，依次加入10 mL鹽酸濃度為5%的考馬斯亮藍(lán)溶液，快速混勻器使其混合均勻，室溫放置15 min，于598 nm波長處測定吸光度，每個(gè)樣品平行測定2次，計(jì)算蛋白質(zhì)加入量及加標(biāo)回收率，結(jié)果見表4。

回收率為97.8%～103.7%，平均回收率為101.1%，RSD=2.4%

表4　加標(biāo)回收率Tab.4 Recovery rate

3　結(jié)果與討論

3.1結(jié)果

取供試品溶液2 mL，加鹽酸濃度為5%的考馬斯亮藍(lán)溶液10 mL，混合均勻，室溫放置15 min，于598 nm波長處檢測吸光光度值，計(jì)算殼聚糖中，重復(fù)進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表5。

表5　供試品試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Test results of the sample

3.2結(jié)論

改進(jìn)后殼聚糖中蛋白質(zhì)含量的檢測方法為：取2 mL樣品溶液中加入10 mL鹽酸濃度為5%的考馬斯亮藍(lán)溶液，混合均勻后，室溫放置15 min，598 nm波長處檢測吸光度值，根據(jù)吸光度值-蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算殼聚糖中蛋白質(zhì)含量。

3.3討論

殼聚糖中雜質(zhì)蛋白的檢測，中國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0606.7—2008《組織工程醫(yī)療產(chǎn)品》[4]中殼聚糖部分規(guī)定用考馬斯亮藍(lán)法。在工作實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)該方法準(zhǔn)確性欠佳，重復(fù)性差，混勻后20 s即出現(xiàn)沉淀，分析原因可能為：磷酸濃度太大，殼聚糖析出，產(chǎn)生了沉淀；也有可能是考馬斯亮藍(lán)分子上有磺酸基，殼聚糖在磺酸基和磷酸存在的情況下生成了不溶于水的殼聚糖磷酸酯，給檢測殼聚糖中蛋白質(zhì)含量帶來困難。本文對原方法進(jìn)行了改良，用鹽酸替代磷酸，因殼聚糖鹽酸鹽具有良好的水溶性，且選用的鹽酸濃度合適，因此顯著改善了檢測過程中產(chǎn)生沉淀的問題，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證表明，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，檢測結(jié)果穩(wěn)定、可靠。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉小華, 張宏宇, 李舒梅, 等. 低蛋白含量殼聚糖制備研究[J]. 廣東化工, 2010, 37(5): 100-112.

[2] 楊久林, 謝紅國, 于煒婷, 等. 組織工程用殼聚糖研究進(jìn)展[J]. 功能材料, 2013, 11(44): 1521-1525.

[3] Zivanovic S, Li J, Davidson M, et a1. Physical, mechanical and antibacterial properties of chitosan/PEO blend films[J]. Biomacromolecules, 2007, (8): 1505-1510．

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局. YY/T 0606.7—2008 組織工程醫(yī)療產(chǎn)品[S].

Study of the Determination Method of Protein Content in Chitosan

【W(wǎng)riters】HAN Ting, SHI Guohua, LI Suzhe, LIU Junying
1 Hebei Testing Institute for Medical Instrument and Pharmaceutical Packing Profi le, Shijiazhuang, 050061
2 Shijiazhuang yishengtang Medical Supplies co. Ltd., Shijiazhuang, 050200

【Abstract】Objective Using the Coomassie brilliant blue method to solve the problem of the precipitation when detecting the protein content in chitosan. Methods Improving the Coomassie brilliant blue method. Results Use the Coomassie brilliant blue solution with hydrochloric acid concentration of 5% as stain, stain 15 min , the maximum absorption wavelength is 598 nm. the standard curve of absorbance-protein concentration is y=0.003x+0.017 9. r2=0.991, the linear correlation is good within the protein concentration scope of 5 μg/mL～40 μg/mL, the lowest detection limit is 1 μg/mL, and its recovery is 97.8%～103.7%. Conclusions In this paper, the method of determining the content of protein in chitosan is high accurate, stable, reliable and reproducible, and can be widely used in product testing.

【Key words】protein content, chitosan, Coomassie brilliant blue method, hydrochloric acid

【中圖分類號】R318.08

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi:10.3969/j.issn.1671-7104.2016.02.014

文章編號：1671-7104(2016)02-0122-03

收稿日期：2015-10-29

作者簡介：韓婷，E-mail: 905168841@qq.com