粳稻超親變異系籽粒谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)特性及序列變異分析

徐振華　曲瑩　劉海英 　朱立楠 　張忠臣 　金正勛,*

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 哈爾濱 150030；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 五常水稻研究所，黑龍江 五常 150229; *通訊聯(lián)系人，E-mail：zxjin326@hotmail.com)

粳稻超親變異系籽粒谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)特性及序列變異分析

徐振華1,2曲瑩1劉海英1,2朱立楠1張忠臣1金正勛1,*

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 哈爾濱 150030；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 五常水稻研究所，黑龍江 五常 150229;*通訊聯(lián)系人，E-mail：zxjin326@hotmail.com)

徐振華， 曲瑩， 劉海英， 等. 粳稻超親變異系籽粒谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)特性及序列變異分析. 中國水稻科學(xué)， 2016， 30(3)： 304-312.

摘要:選用籽粒蛋白質(zhì)含量有顯著差異的親本和雜種后代超親變異系，比較分析灌漿過程中籽粒蛋白質(zhì)積累特性、谷氨酰胺合成酶(GS)活性變化、GS基因mRNA表達(dá)量變化和基因堿基序列。結(jié)果表明，雜交后代通過籽粒蛋白質(zhì)含量的連續(xù)定向選可獲得超親變異系，籽粒蛋白質(zhì)積累量與基因型緊密相關(guān)；灌漿過程中籽粒GS活性呈單峰曲線變化，籽粒蛋白質(zhì)含量與籽粒GS活性密切相關(guān)，而且籽粒GS活性也能產(chǎn)生超親變異；在灌漿過程中籽粒蛋白質(zhì)含量不同的親本及超親變異系籽粒GS1.3 和GS2 基因的mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，即隨灌漿進(jìn)程mRNA表達(dá)量逐漸增加，到抽穗后15～20d表達(dá)量最高，隨后逐漸下降，呈單峰曲線變化；GS1.3 和GS2 基因mRNA表達(dá)量與籽粒蛋白質(zhì)含量關(guān)系密切，GS基因mRNA表達(dá)量高的基因型籽粒蛋白質(zhì)含量也高，而且超親表達(dá)；盡管不同品種GS1.3 和GS2 基因堿基序列保守性很高，但不同品種水稻GS1.3 和GS2 基因的堿基序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列并不完全一致，存在著個(gè)別堿基不同的基因多態(tài)性，品種間有性雜交后代在基因分離和穩(wěn)定過程中通過堿基的替換仍然能發(fā)生堿基的隨機(jī)性變化及三聯(lián)體密碼和氨基酸的變化。

關(guān)鍵詞:粳稻； 超親變異系； 籽粒； GS基因表達(dá)； 序列變異

谷氨酰胺合成酶(GS)是無機(jī)態(tài)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)氮過程和植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，是氮代謝途徑中具有多功能的酶，參與調(diào)控多個(gè)氮代謝過程[1-3]。谷氨酰胺合成酶活性的降低可影響植物體內(nèi)氮代謝及糖代謝過程。在水稻籽粒灌漿過程中，不同品種間GS活性變化與籽粒蛋白質(zhì)含量和蒸煮食味品質(zhì)間的關(guān)系甚密[4-8]。GS在水稻中有2個(gè)同工型酶，即GS1和GS2，其中GS1是由OsGS1.1、OsGS1.2、OsGS1.3共同編碼。OsGS1.1和OsGS1.2在所有組織中均表達(dá)，但OsGS1.1偏向于在NH4+不足的環(huán)境中表達(dá)，而OsGS1.2則更偏向于在NH4+充足的環(huán)境中表達(dá)，OsGS1.3主要在穗中檢測(cè)到表達(dá)[8-9]；GS2基因的主要功能是將葉綠體以及光呼吸中再合成的NH4+合成為谷氨酰胺[10]。Jacek和Andrej等的研究結(jié)果表明，谷氨酰胺合成酶是植物氮同化的關(guān)鍵酶，此酶在進(jìn)化中是相當(dāng)保守的[11]。

有性雜交后代在數(shù)量性狀上產(chǎn)生超親遺傳變異是生物界普遍存在的現(xiàn)象。品種間有性雜交仍然是目前乃至將來培育水稻新品種的主要途徑之一。因此，本研究以籽粒蛋白質(zhì)含量為選擇指標(biāo)，從F2代起連續(xù)定向選擇培育成的籽粒蛋白質(zhì)含量有顯著差異的F10超親變異系，比較分析灌漿成熟過程中籽粒GS基因的表達(dá)特性及其基因序列，旨在為闡明水稻GS活性和基因表達(dá)量與蛋白質(zhì)含量的關(guān)系以及雜種后代籽粒蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生超親遺傳變異的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料和試驗(yàn)方法

2002年選用籽粒蛋白質(zhì)含量不同的2個(gè)親本系選1號(hào)(蛋白質(zhì)含量為9.52%)和通769(8.27%)配制單交組合，以籽粒蛋白質(zhì)含量為選擇指標(biāo)，從F2起逐代按高、低兩個(gè)方向進(jìn)行連續(xù)的定向選擇至F10，從中選擇蛋白質(zhì)含量有顯著差異且超親變異的2個(gè)品系東農(nóng)1101(7.81%)和東農(nóng)1124(10.18%)。

2013年選用上述親本及超親變異系進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，盆的規(guī)格為長60 cm、寬40 cm、高60 cm。4月1-15日按供試材料的生育期進(jìn)行分期播種，大棚盤育苗，單粒等距離點(diǎn)播催芽籽，旱育秧管理，5月15日插秧，每個(gè)品種插3盆，每盆等距離插長勢(shì)一致的秧苗24棵，待緩苗后定植12棵苗，正常肥水管理。

抽穗時(shí)每個(gè)供試材料選取同日抽出且大小基本一致的穗掛牌標(biāo)記，待抽穗后第10 d、15 d、20 d、25 d、30 d分別取掛牌標(biāo)記的稻穗8個(gè)，迅速放入液氮中，然后各稻穗中選取灌漿一致的穗中部籽粒20粒，在低溫下去殼去胚后放入凍存管里，置于-80℃冰柜保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2谷氨酰胺合成酶活性及基因mRNA表達(dá)量測(cè)定

參照金正勛等[4]方法測(cè)定谷氨酰胺合成酶活性。采用RT-PCR方法測(cè)定GS基因mRNA表達(dá)量。用冷飽和酚法[12]提取籽粒總RNA，以無RNase的DNaseⅠ進(jìn)行處理，消除基因組DNA污染，取1 μg 處理后的RNA用于反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上已公布的水稻GS基因序列，利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)同工型基因的RT-PCR引物(表1)。以Actin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，其中，正向引物為5’-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’；反向引物為5’-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。

按照Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行第1鏈cDNA的合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，對(duì)5個(gè)時(shí)期的供試材料同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增內(nèi)參基因，利用Quantity one 7.0.5軟件分析條帶亮度，調(diào)整cDNA濃度直至擴(kuò)增內(nèi)參基因條帶亮度一致。以調(diào)整濃度后的cDNA為模板擴(kuò)增目標(biāo)基因。擴(kuò)增程序如下： 95℃下預(yù)變性10 min；95℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下45 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用Quantity one 7.0.5軟件對(duì)擴(kuò)增譜帶進(jìn)行表達(dá)豐度的比對(duì)分析。

1.3谷氨酰胺合成酶基因cDNA克隆及全序列分析

1.3.1質(zhì)粒與細(xì)菌菌株

用于基因克隆及構(gòu)建的質(zhì)粒載體有Peasy-T1(購自TransGen Biotech公司)，主要用于PCR產(chǎn)物的克隆。所有的質(zhì)粒擴(kuò)增及其克隆操作都在大腸桿菌(E.coli)菌株Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行。

1.3.2PCR擴(kuò)增谷氨酰胺合成酶基因全長cDNA

參考NCBI上已公布的水稻谷氨酰胺合成酶基因GS1.3和GS2的核苷酸序列，設(shè)計(jì)并合成引物(表1)，通過NCBI中BLAST的同源比對(duì)功能，對(duì)設(shè)計(jì)的引物特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，用PCR方法從合成的水稻籽粒cDNA庫中擴(kuò)增谷氨酰胺合成酶基因全長cDNA片段。

表1PCR實(shí)驗(yàn)所用引物

Table 1. PCR primers used in the study.

引物名稱 Primername 引物序列號(hào)Primersequencenumber引物序列(5'-3')Primersequence(5'-3')RT-GS1-3-SAB180689CTCCACCCTCAAGCCATCTRT-GS1-3-AACGACGCCAGCAATCTCART-GS2-SX14246GGAACCCATCCCTACTAACART-GS2-ATCACCTCAAATCCTCCATCTOs-GS1-3-AAB180689CTCACTTGCCGTTGGATTOs-GS1-3-SATTGATAGCCTGTGCGTCTCOs-GS2-SX14246GTTGGTGATTATCTGTAGGGGOs-GS2-AAAGGTGGCGTGGTTTTCT

表2灌漿不同時(shí)期水稻籽粒蛋白質(zhì)含量比較

Table 2. Comparison of protein content in rice grains during grain filling.

%

數(shù)據(jù)后跟不同小寫字母表示在5%水平上差異顯著。下同。

Values followed by different lowercase letters mean significant difference at 0.05 level.The same as below.

PCR條件如下：95℃下10 min；95℃下1 min；55℃下1 min；72℃下5 min，共30個(gè)循環(huán)，最后在72℃下延伸15 min。

1.3.3PCR產(chǎn)物的克隆鑒定

PCR產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠電泳上分離后，用NucleoTrap 膠回收試劑盒 (Clontech) 回收目的片段，并連接到Peasy-T1載體中轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞。然后通過IPTG和X-gal進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，提取質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行酶切鑒定。

1.3.4cDNA序列分析

克隆在Peasy-T1載體中的谷氨酰胺合成酶基因cDNA，委托上海英濰捷基貿(mào)易有限公司測(cè)定全核苷酸序列，雙向重復(fù)測(cè)定。利用網(wǎng)站NCBI分析核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列，序列比較分析在DNAMAN數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒蛋白質(zhì)積累特性比較

灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒蛋白質(zhì)含量多重比較結(jié)果列于表2。

由表2可見，后代東農(nóng)1124的精米蛋白質(zhì)含量顯著高于高親系選1號(hào)，而后代東農(nóng)1101的精米蛋白質(zhì)含量顯著低于低親通769；在灌漿各時(shí)期，籽粒蛋白質(zhì)含量高的后代及親本積累的蛋白質(zhì)含量均高于蛋白質(zhì)含量低的后代及親本。說明有性雜交后代通過籽粒蛋白質(zhì)含量的連續(xù)定向選擇能獲得籽粒蛋白質(zhì)含量顯著高的超親變異系。

2.2灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒GS酶活性比較

灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒谷氨酰胺合成酶活性多重比較結(jié)果列于表3。

親本及超親變異系在灌漿過程中籽粒GS活性變化趨勢(shì)基本一致，均呈單峰曲線變化，即隨著灌漿進(jìn)程酶活性逐漸上升，達(dá)到峰值后逐漸降低(表3)。但不同材料的酶活性達(dá)到峰值的時(shí)間有差異，其中，親本系選1號(hào)和后代東農(nóng)1124在抽穗后15 d達(dá)到峰值，親本通769和后代東農(nóng)1101則在抽穗后20 d達(dá)到峰值。說明抽穗后15～20 d是籽粒GS活性最強(qiáng)的時(shí)期，其中高蛋白品種達(dá)到酶活性峰值的時(shí)間要早于低蛋白品種，籽粒蛋白質(zhì)的合成與積累主要在灌漿前中期。

由表3還可知，灌漿各時(shí)期籽粒蛋白質(zhì)含量高的后代東農(nóng)1124的GS活性顯著或略高于蛋白質(zhì)含量低的后代；而且高蛋白質(zhì)含量后代的GS活性顯著強(qiáng)于高親，低蛋白質(zhì)含量后代的GS活性顯著或略低于低親。說明籽粒蛋白質(zhì)含量與籽粒GS活性密切相關(guān)，而且籽粒GS活性能產(chǎn)生超親變異。

DAH-抽穗后天數(shù)。下同。

DAH，Days after heading. The same as below.

圖1灌漿不同時(shí)期親本及雜種后代籽粒GS基因mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量變化

Fig. 1. Expression of genes involved in GS in grains of tested parents and their derived progenies at various days after heading.

2.3灌漿過程中親本及超親變異系籽粒GS基因mRNA表達(dá)量變化

灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒GS酶同工型基因GS1.3和GS2的mRNA表達(dá)量變化示于圖1。

由圖1可見，親本及超親變異系在灌漿過程中籽粒GS1.3和GS2基因的mRNA表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，隨著籽粒灌漿進(jìn)程2個(gè)同工型基因的mRNA表達(dá)量逐漸增加，達(dá)到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，峰值出現(xiàn)在抽穗后15～20 d。與GS1.3基因相比，GS2基因的譜帶亮度普遍大，說明在灌漿過程中籽粒GS2基因的mRNA表達(dá)量大于GS1.3基因，在籽粒GS同工型基因中GS2基因是主要表達(dá)的基因，在籽粒谷氨酰胺合成酶活性中起主要作用。

以系選1號(hào)的GS基因表達(dá)量為基準(zhǔn)，計(jì)算灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒GS1.3和GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)行多重比較，其結(jié)果列于表4。

表3灌漿不同時(shí)期親本及后代籽粒谷氨酰胺合成酶活性比較

Table 3. Comparison of grain glutamine synthetase activity during grain filling for parents and hybrid progenies.OD·grain-1min-1

供試材料Material10DAH15DAH20DAH25DAH30DAH系選1號(hào)Xixuan10.39a0.90b0.88c0.78b0.58b通769Tong7690.47a0.95b0.99b0.60c0.50b東農(nóng)1101Dongnong11010.38a0.71c0.83c0.53c0.54b東農(nóng)1124Dongnong11240.41a1.25a1.06a0.97a0.87a

表4灌漿不同時(shí)期親本及超親變異系籽粒GS1.3和GS2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

Table 4. Relative expression levels of GS genes in parents and hybrid progenies after heading.OD·grain-1min-1

供試材料Material10DAHGS1.3GS215DAHGS1.3GS220DAHGS1.3GS225DAHGS1.3GS2系選1號(hào)Xixuan11.00Bc1.00Dd1.00Aa1.00Bb1.00Aa1.00Bb1.00Cc1.00Cc通769Tong7690.98Bc2.87Bb0.71Bc1.06Bb0.96Aa0.90Bc1.32Aa2.16Aa東農(nóng)1101Dongnong11011.20Ab1.76Cc0.83Bb0.33Cc0.69Bb0.72Cd1.15Bb0.84Dd東農(nóng)1124Dongnong11241.35Aa3.08Aa0.76Bc2.16Aa0.97Aa1.43Aa1.00Cc1.80Bb

數(shù)據(jù)后跟不同大小寫字母表示在0.01和0.05水平上差異顯著。

Values flanked by different uppercase and lowercase letters mean significant difference at 0.01 and 0.05 levels.

由表4可見，抽穗后10 d，籽粒蛋白質(zhì)含量高的東農(nóng)1124的GS1.3和GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于高親系選1號(hào)；籽粒蛋白質(zhì)含量低的后代東農(nóng)1101的GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于低親通769，但GS1.3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于低親；抽穗后15 d，籽粒蛋白質(zhì)含量高的東農(nóng)1124的GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于高親系選1號(hào)，而GS1.3基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于高親；籽粒蛋白質(zhì)含量低的東農(nóng)1101的GS1.3和GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于低親通769；抽穗后20～25d，籽粒蛋白質(zhì)含量高的東農(nóng)1124的GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著高于高親系選1號(hào)，而GS1.3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量與高親之間沒有顯著差異；籽粒蛋白質(zhì)含量低的東農(nóng)1101的GS1.3和GS2基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著低于低親通769。說明灌漿不同時(shí)期籽粒蛋白質(zhì)含量與GS1.3和GS2基因的mRNA表達(dá)量有密切關(guān)系，在灌漿不同時(shí)期籽粒蛋白質(zhì)含量高的品種其GS基因的mRNA表達(dá)量也高，而且雜交后代能超親表達(dá)。

2.4親本及超親變異系籽粒GS基因克隆及相似性比較

由基因測(cè)序結(jié)果可知，親本及超親變異系籽粒GS1.3和GS2基因的cDNA全序列長分別為1113 bp和1287 bp，分別編碼371個(gè)和429個(gè)氨基酸，包含了全部的編碼區(qū)序列，與預(yù)期結(jié)果完全相符?，F(xiàn)將其中的親本系選1號(hào)籽粒GS1.3基因和GS2基因的cDNA全長核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列分別示于圖2～3。

將測(cè)得的供試材料GS1.3-系選1號(hào)、GS1.3-通769、GS1.3-東農(nóng)1101、GS1.3-東農(nóng)1124和GS2-系選1號(hào)、GS2-通769、GS2-東農(nóng)1101、GS2-東農(nóng)1124基因cDNA全序列與GenBank中已發(fā)表的日本晴GS1.3和GS2的核苷酸序列AB180689和X14246進(jìn)行比較，其結(jié)果如圖4所示。

由圖4可見，與日本晴相比，親本系選1號(hào)和通769及超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124的GS1.3同源性分別為99.7%、99.8%、99.6%、99.6%，GS2同源性分別為99.9%、99.9%、100%、100%，證明本研究已成功克隆GS1.3和GS2的cDNA，并說明籽粒蛋白質(zhì)含量不同的水稻品種間谷氨酰胺合成酶基因序列差異很小，具有非常高的保守性，并且GS2的保守性大于GS1.3。

2.5親本及超親變異系籽粒GS基因全長cDNA序列比較

現(xiàn)將日本晴和親本及超親變異系籽粒GS1.3基因cDNA全序列堿基和三聯(lián)體密碼變異位點(diǎn)比較結(jié)果列于表5。

由表5可見，超親變異系東農(nóng)1101與母本系選1號(hào)相比，有5個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，其中120位點(diǎn)和126位點(diǎn)的堿基G轉(zhuǎn)換成A，三聯(lián)體密碼由AGG和TTG分別變成AGA和TTA，都為精氨酸(R)和亮氨酸(L)；214位點(diǎn)的堿基G轉(zhuǎn)換成A，三聯(lián)體密碼GTC變成ATC，由纈氨酸(V)變成異亮氨酸(I)；549位點(diǎn)的堿基T和552位點(diǎn)的堿基C分別轉(zhuǎn)換成C和T，三聯(lián)體密碼TTT和GCC分別變成TTC和GCT，都為苯丙氨酸(F)和丙氨酸(A)。與父本通769相比，有6個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，其中126位點(diǎn)和214位點(diǎn)的堿基G轉(zhuǎn)換成A，三聯(lián)體密碼TTG和GTC分別變成TTA和ATC，前者都為亮氨酸，后者由纈氨酸(V)變成異亮氨酸(I)；306位點(diǎn)和652位點(diǎn)的堿基A轉(zhuǎn)換成G，三聯(lián)體密碼由GAA和ATG分別變成GAG和GTG，前者都為谷氨酸(E)，后者由甲硫氨酸(M)變成纈氨酸(V)；549位點(diǎn)的堿基T和552位點(diǎn)的堿基C分別轉(zhuǎn)換成C和T，三聯(lián)體密碼由TTT和GCC分別變成TTC和GCT，前者都為苯丙氨酸(F)，后者都為丙氨酸(A)。與父母本同時(shí)相比，超親變異系東農(nóng)1101有4個(gè)位點(diǎn)的堿基與雙親不同，其中126位點(diǎn)、549位點(diǎn)、552位點(diǎn)的堿基變化和三聯(lián)體密碼的變化沒引起氨基酸的變化，只有214位點(diǎn)的堿基變化和三聯(lián)體密碼的變化導(dǎo)致了氨基酸的變化。

圖2系選1號(hào)籽粒GS1.3基因的cDNA全長序列(上)及推導(dǎo)出的氨基酸序列(下)

Fig. 2. Deduced cDNA sequence(top) and amino acid sequence(bottom) of grain GS1.3 gene in Xixuan 1.

圖3系選1號(hào)籽粒GS2基因CDNA全序列(上)及推導(dǎo)出的氨基酸序列(下)

Fig. 3. CDNA sequence(top) and deduced amino acid sequence(bottom) of grain GS2 gene in Xixuan 1.

1-日本晴; 2 系選1號(hào); 3-通769; 4-東農(nóng)1101; 5-東農(nóng)1124。

1, Nipponbare; 2, Xixuan 1; 3, Tong 769; 4, Dongnong 1101; 5, Dongnong 1124.

圖4供試材料間GS1.3(A)和GS2(B)基因序列的同源性

Fig. 4. Comparison of homology between GS1.3(A) and GS2(B) gene sequences for the tested materials.

表5日本晴、供試親本及超親變異系籽粒GS1.3基因cDNA全序列三聯(lián)體密碼比較

Table 5. Comparison of triplets for gene cDNA sequence of GS1.3 in grains of Nipponbare, tested parents and their derived progenies.

品種Variety堿基位點(diǎn)Basesite96120126214230287306549552652930日本晴NipponbareGGGAGATTGGTCCAATGTGAGTTTGCCGTGGTA系選1號(hào)Xixuan1GGGAGGTTGGTCCAATGTGAGTTTGCCGTGGTA通769Tong769GGGAGATTGGTCCAATGTGAATTTGCCATGGTA東農(nóng)1101Dongnong1101GGGAGATTAATCCAATGTGAGTTCGCTGTGGTA東農(nóng)1124Dongnong1124GGAAGATTGGTCCGATATGAGTTTGCCGTGGTT

超親變異系東農(nóng)1124與母本系選1號(hào)相比，有5個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，其中96位點(diǎn)和120位點(diǎn)的堿基G轉(zhuǎn)換成A，三聯(lián)體密碼由GGG和AGG分別變成GGA和AGA，都為甘氨酸(G)和精氨酸(R)；230位點(diǎn)的堿基A和287位點(diǎn)的堿基G分別轉(zhuǎn)換成G和A，三聯(lián)體密碼由CAA和TGT分別變成CGA和TAT，由原來的谷氨酰胺(Q)和半胱氨酸(C)分別變成精氨酸(R)和酪氨酸(Y)；930位點(diǎn)的堿基A顛換成T，三聯(lián)體密碼GTA變成GTT，都為纈氨酸(V)。與父本通769相比，有6個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生變化，其中96位點(diǎn)和287位點(diǎn)的堿基G轉(zhuǎn)換成A，三聯(lián)體密碼由GGG和TGT分別變成GGA和TAT，前者都為甘氨酸(G)，后者由半胱氨酸(C)變成酪氨酸(Y)；306位點(diǎn)、230位點(diǎn)、652位點(diǎn)的堿基A轉(zhuǎn)換成G，三聯(lián)體密碼由GAA、CAA、ATG分別變成GAG、CGA、GTG，前者都是谷氨酸(E)，后兩者分別由谷氨酰胺(Q)變成精氨酸(R)，甲硫氨酸(M)變成纈氨酸(V)；930位點(diǎn)的堿基A顛換成T，三聯(lián)體密碼GTA變成GTT，都為纈氨酸(V)。與父母本同時(shí)相比，超親變異系東農(nóng)1124有4個(gè)位點(diǎn)的堿基與雙親不同，其中96位點(diǎn)和930位點(diǎn)的堿基變化和三聯(lián)體密碼的變化沒引起氨基酸的變化，但230位點(diǎn)和287位點(diǎn)的堿基變化和三聯(lián)體密碼的變化導(dǎo)致了氨基酸的變化。

將超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124相互比較可知，兩個(gè)變異系間有8個(gè)位點(diǎn)的堿基和三聯(lián)體密碼不同，其中96位點(diǎn)、126位點(diǎn)、549位點(diǎn)、552位點(diǎn)及930位點(diǎn)的三聯(lián)體密碼變化沒導(dǎo)致氨基酸的變化，而214位點(diǎn)、230位點(diǎn)、287位點(diǎn)的三聯(lián)體密碼變化導(dǎo)致了氨基酸的變化。

由親本和超親變異系間的籽粒GS2基因的全長cDNA核苷酸序列比較可知，2個(gè)超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124的核苷酸序列完全一致，但與母本系選1號(hào)相比，兩個(gè)超親變異系只有在784位點(diǎn)的堿基A轉(zhuǎn)換成G，三聯(lián)體密碼由ATC變成GTC，由異亮氨酸(I)變成纈氨酸(V)。與父本通769相比，兩個(gè)超親變異系也只有在700位點(diǎn)的堿基A轉(zhuǎn)換成G，三聯(lián)體密碼由ACA變成GCA，由蘇氨酸(T)變成丙氨酸(A)。

由以上堿基序列比較結(jié)果可知，堿基發(fā)生變異后既能形成只與母本或父本單親一樣的序列或不一樣的序列，也能形成與雙親都不一樣的序列，而且變異后既能形成同義的三聯(lián)體密碼，也能形成突變的三聯(lián)體密碼。通過雜交產(chǎn)生的后代在基因分離和穩(wěn)定過程中通過某位點(diǎn)的堿基變化，可形成個(gè)別堿基不同的多態(tài)性基因和改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的突變基因。

2.6親本及超親變異系籽粒GS氨基酸序列保守功能域比較

GS序列保守功能域包括谷氨酰胺合成酶ATP結(jié)合功能域、谷氨酰胺合成酶催化功能域、谷氨酰胺合成酶銨離子集合功能域。本研究根據(jù)日本晴氨基酸序列預(yù)測(cè)的保守功能域?qū)τH本及超親變異系間的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列保守功能域進(jìn)行比較分析，其結(jié)果分別列于表6和表7。

由表6可見，超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124與母本系選1號(hào)和父本通769相比，GS1.3氨基酸序列保守功能域氨基酸起始和終止位置及谷氨酰胺合成酶ATP結(jié)合功能域的氨基酸序列完全一致；在谷氨酰胺合成酶催化功能域中，超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124與母本系選1號(hào)的氨基酸序列完全一致，但與父本通769相比，兩個(gè)超親變異系在第108位氨基酸上由甲硫氨酸(M)變成纈氨酸(V)；在谷氨酰胺合成酶銨離子集合功能域中，雙親的氨基酸序列完全一致，但超親變異系東農(nóng)1101與雙親相比，在第72位氨基酸上由纈氨酸(V)變成異亮氨酸(I)，超親變異系東農(nóng)1124與雙親相比，分別在第77位和第96位氨基酸上由谷氨酰胺(Q)變成精氨酸(R)，半胱氨酸(C)變成酪氨酸(Y)。

由表7可見，超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124與母本系選1號(hào)和父本通769相比，GS2氨基酸序列保守功能域氨基酸起始和終止位置及谷氨酰胺合成酶ATP結(jié)合功能域和谷氨酰胺合成酶銨離子集合功能域的氨基酸序列完全一致；在谷氨酰胺合成酶催化功能域中，超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124的氨基酸序列完全一致，但與母本系選1號(hào)相比，在第273位氨基酸上由異亮氨酸(I)變成纈氨酸(V)；與父本通769相比，在第234位氨基酸上由蘇氨酸(T)變成丙氨酸(A)。

表6GS1.3保守功能域氨基酸序列比較

Table 6. Conserved domain analysis of the GS1.3 sequence.

功能域Domain氨基酸序列位置Positionsequence起始Start終止End系選1號(hào)Xixuan1通769Tong769東農(nóng)1101Dongnong1101東農(nóng)1124Dongnong1124谷氨酰胺合成酶ATP結(jié)合功能域GSATPbindingdomain239255————谷氨酰胺合成酶催化功能域GScatalyticdomain105357VMM→VM→V谷氨酰胺合成酶銨離子集合功能域GSbeta-graspdomain1999——V→IQ→RC→Y

“—” 表示氨基酸序列一致。下同。

‘—’ means the identical amino acid sequence. The same as below.

表7GS2保守功能域氨基酸序列比較

Table 7. Conserved domain analysis of the GS2 sequence.

功能域Domain氨基酸序列位置Positionsequence起始Start終止End系選1號(hào)Xixuan1通769Tong769東農(nóng)1101Dongnong1101東農(nóng)1124Dongnong1124谷氨酰胺合成酶ATP結(jié)合域GSATPbindingdomain294305————谷氨酰胺合成酶催化功能域GScatalyticdomain159411ITI→VT→AI→VT→A谷氨酰胺合成酶銨離子集合功能域GSbeta-graspdomain73154————

由上比較結(jié)果可知，與親本相比超親變異系的GS1.3和GS2基因堿基序列中個(gè)別堿基的變化導(dǎo)致了該酶催化功能域和銨離子集合功能域的氨基酸序列變化。

3討論

關(guān)于灌漿過程中GS活性與蛋白質(zhì)合成積累的關(guān)系，國內(nèi)外已有較多報(bào)道。Xie等[13]研究結(jié)果表明，籽粒GS活性的變化對(duì)籽粒蛋白質(zhì)合成影響較小，籽粒GS活性與籽粒蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性較小。朱紅梅等[12]研究結(jié)果表明，水稻高蛋白質(zhì)含量基因型品種功能葉的GS活性明顯高于低蛋白質(zhì)含量基因型品種。唐湘如等[14]研究結(jié)果表明，水稻產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量均高的品種超豐早1號(hào)成熟后期葉片和籽粒的全氮、蛋白氮和非蛋白氮含量及GS活性較高，籽粒蛋白質(zhì)含量和產(chǎn)量增加。本研究的供試材料是在同一個(gè)雜交組合分離群體中通過籽粒蛋白質(zhì)含量的連續(xù)定向選擇獲得的籽粒蛋白質(zhì)含量有顯著差異的超親變異系，而且試驗(yàn)是在嚴(yán)格控制環(huán)境條件的盆栽里進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果可靠性很高。由本研究結(jié)果可知，在灌漿過程中籽粒GS1.3和GS2基因的mRNA表達(dá)量及GS活性變化趨勢(shì)非常一致，都是單峰曲線變化，峰值都出現(xiàn)在抽穗后15～20d，而且籽粒蛋白質(zhì)含量與GS1.3和GS2基因的mRNA表達(dá)量及GS活性變化又是同步變化關(guān)系，即籽粒蛋白質(zhì)含量高的超親變異系的GS1.3和GS2基因的mRNA表達(dá)量及GS活性顯著大于蛋白質(zhì)含量低的超親變異系，并且mRNA表達(dá)量和GS活性也表現(xiàn)出超親變異，因此筆者認(rèn)為蛋白質(zhì)含量與籽粒GS基因mRNA表達(dá)量和活性有很密切的關(guān)系。由基因堿基序列和氨基酸序列比較分析還可知，籽粒蛋白質(zhì)含量、GS酶活性及GS2基因mRNA表達(dá)量有顯著差異的超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124間的GS2基因編碼序列和氨基酸序列卻完全一致。由于氨基酸序列相同的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)與功能也應(yīng)相同。因此，GS基因mRNA表達(dá)量變化導(dǎo)致的酶活性變化是超親變異系間籽粒蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)顯著差異的內(nèi)在原因?；騧RNA表達(dá)量變化主要受基因調(diào)控因子的影響，即基因啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子等因素的控制。這也許是各研究者對(duì)籽粒蛋白質(zhì)含量與GS活性關(guān)系上得到不同結(jié)果的原因之一。所以，今后的GS活性與籽粒蛋白質(zhì)含量的關(guān)系研究應(yīng)該重視GS基因調(diào)控因子的結(jié)構(gòu)變異和功能變異，這對(duì)闡明有性雜交產(chǎn)生數(shù)量性狀的超親遺傳變異分子機(jī)制及GS 在籽粒蛋白質(zhì)合成積累上的作用都具有重要意義。

研究表明，在植物體內(nèi)蘊(yùn)藏著大量的自然等位基因變異，這些基因序列變異直接導(dǎo)致表型變異[15]。功能上有差異的突變主要有以下幾種可能：一是基因重要功能域內(nèi)的非同義突變，導(dǎo)致酶活性中心重要氨基酸取代而影響其功能；二是在啟動(dòng)子區(qū)域上下游存在的其他順式元件中發(fā)生變異，從而影響基因?qū)φ{(diào)控信息的響應(yīng)與基因表達(dá)[16]。基因內(nèi)部不同位點(diǎn)上的堿基發(fā)生變化是生物界形成復(fù)等位基因和基因多態(tài)性的內(nèi)在原因。由本研究結(jié)果可知，雖然籽粒蛋白質(zhì)含量不同的親本及超親變異系間GS1.3和GS2基因編碼區(qū)堿基序列同源性很高，氨基酸序列保守性很強(qiáng)，序列相似度高達(dá)99%以上，甚至GS2基因在兩個(gè)超親變異系東農(nóng)1101和東農(nóng)1124中序列相似度達(dá)到了100%，但水稻不同品種間GS1.3和GS2基因的堿基序列和蛋白質(zhì)氨基酸序列并不完全一致，與親本相比，通過有性雜交定向選擇培育的籽粒蛋白質(zhì)含量超親變異系仍然在個(gè)別堿基位點(diǎn)上發(fā)生變化，甚至改變蛋白質(zhì)功能域上的氨基酸。這就說明，品種間有性雜交后代在基因分離和重組過程中通過堿基轉(zhuǎn)換或顛換產(chǎn)生個(gè)別堿基和氨基酸有差異的等位基因和同工型酶，是生物界基因產(chǎn)生多態(tài)性和表型性狀產(chǎn)生遺傳變異的內(nèi)在分子機(jī)制和重要途徑。已有研究結(jié)果也表明，單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和小的插入缺失是大多數(shù)生物基因組中最豐富的變異[17]。由本研究結(jié)果還可知，基因堿基序列的變化是不同品種間等位基因產(chǎn)生多態(tài)性的內(nèi)在基礎(chǔ)，但由于三聯(lián)體密碼的簡并現(xiàn)象而并不是每個(gè)堿基的變化都能導(dǎo)致氨基酸序列的變化和蛋白質(zhì)功能的變化。因此，從DNA水平上檢測(cè)分析得到的基因多態(tài)性信息不一定能準(zhǔn)確反映不同品種間等位基因遺傳功能的多樣性，這也許是根據(jù)DNA分子標(biāo)記遺傳距離選配親本得不到理想遺傳變異的內(nèi)在原因。

參考文獻(xiàn)：

[1]Cren M, H irel B Glulamine synthetase in higher plant: Regulation of gene and protein expression from the organ to the cell.PlantCellPhysiol, 1999.40: 1187-1193.

[2]Hill J, Phylip L H. Bacterial aspartic proteinases.FEBSLet, 1997, 409(3): 357-360.

[3]Ochs G, Schoth G,Trischler M, et al. Complexity and expression of the glutamine synthetase multigene family in the amphidiploid cropBrassicanapus.PlantMolBiol, 1999，39: 395-405.

[4]金正勛, 錢春榮, 楊靜,等．水稻灌漿成熟期籽粒谷氨酰胺合成酶活性變化及其與稻米品質(zhì)關(guān)系的初步研究. 中國水稻科學(xué)．2007，21(1)：103-106.

Jin Z X, Qian C R, Yang J, et al. Changes of activity of glutamine synthetase during grain filling and its influence on rice grain quality.ChinJRiceSci, 2007,21:103-106.

[5]Paulam M, Ligia M L, Isabel M S. Expression of he plastid located luta mine synt hetase of medicago t run catula.PlantPhysiol， 2003， 132(1): 390-399.

[6]黃星，李曉光，劉洪亮，等. 水稻籽粒蛋白質(zhì)含量選擇對(duì)雜交后代蛋白質(zhì)含量及氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響. 中國水稻科學(xué)，2009，23(6)：657-660.

Huang X, Li X G, Liu H L, et al. Effects of grain protein content selection on protein content and key enzymes activities for nitrogen metabolism in rice hybrid progenies.ChinJRiceSci, 2009,23:657-660

[7]莫良玉, 吳良?xì)g, 陶勤南. 高等植物GS/GOGAT循環(huán)研究進(jìn)展. 植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 2001, 7(2): 223-231.

Mo L Y, Wu L H, Tao Q N. Research advances on GS/GOGAT cycle in higher plants.PlantNutFerSci, 2001,7(2):223-231.

[8]Tabuchi M, Sugiyama K, Ishiyama K, et al. Severe reduction in growth rate and grain filling of ricemutants lacking OsGS1:1, a cytosolic glutamine synthetase1:1.PlantJ, 2005, 42: 641-651.

[9]Tabuchi M, Abiko T, Yamaya T. Assimilation of ammonium ions andreutilization of nitrogen in rice (OryzasativaL.).JExpBot, 2007, 58: 2319-2327.

[10]Miflin B J，Lea P J. Ammonia assimilation //The Biochemistry of Plants. New York: Academic Press,1980:169-202.

[11]Jacek B, Andrzej B L. Evolution of the glutamine synthetase gene in plants.PlantSci, 2011，28:51-58.

[12]朱紅梅, 榮湘民, 劉強(qiáng). 等. 不同基因型水稻籽粒蛋白質(zhì)含量差異的研究：Ⅰ.兩個(gè)常規(guī)早稻品種籽粒蛋白質(zhì)含量差異. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001, 27(1): 13-16.

Zhu H M, Rong X M, Liu Q, et al. Differences in contents of grain protein of different genotype rice varieties: Ⅰ. Differences in contents of grain protein between two varieties of early convention rice.JHunanAgricUniv,2011,27(1):13-16.

[13]Xie Z J, Jiang D, Cao W X, et al. Effects of post anthesis soil water status on the key regulatory enzymes of starch and protein accumulation in wheat grains.JPlantPhysiolMolBiol,2003, 29(4): 309-316.

[14]唐湘如, 余鐵橋. 密度對(duì)飼用雜交稻幾種酶活性的影響及其與產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量的關(guān)系. 雜交水稻，1999， (6):47-50.

Tang X R, Yu T Q. Effects of density on activities of several enzymes in fodder hybrid rice and its relation to protein content and yield.HybridRice,1999, (6):47-50.

[15]吳永生, 李新海，郝轉(zhuǎn)芳，等. 玉米Gln1-4的gDNA序列、基因結(jié)構(gòu)、保守功能域與等位變異. 作物學(xué)報(bào)，2009, 35(6):983-991.

Wu Y S, Li X H, Hao Z F, et al. Genomic DNA sequence, gene structure, conserved domains, and natural alleles of Gln1-4 gene in maize.ActaAgronSin, 2009, 35(6):983-991.

[16]Reddy A. Alternative splicing of pre-messenger RNAs in plants in the genomic era.AnnuRevPlantBiol, 2007, 58: 267-294.

[17]Kruglyak L. The use of a genetic map of biallelic markers in linkage studies.NatGenet, 1997, 17: 21-24.

Expression Characteristics and Sequence Variation Analysis of Glutamine Synthetase Gene in Grain ofjaponicaRice with Transgressive Variation

XU Zhen-hua1,2, QU Ying1, LIU Hai-ying1,2, ZHU Li-nan1, ZHANG Zhong-chen1, JIN Zheng-xun1,*

(1Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China;2Wuchang Rice Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Wuchang 150229, China;*Corresponding author, E-mail：zxjin326@hotmail.com)

XU Zhenhua, QU Ying, LIU Haiying, et al. Expression characteristics and sequence variation analysis of glutamine synthetase gene in grain ofjaponicarice with transgressive variation. Chin J Rice Sci, 2016, 30(3): 304-312.

Abstract:The transgressive variants derived from rice varieties with significant difference in grain protein content were used to investigate the expression level and structure of glutamine synthetase gene(GS), activity of glutamine synthetase and protein accumulation characteristics during grain filling. The results showed that transgressive variants could be obtained through successive directive selection of grain protein content, because the grain protein content was closely related to corresponding genotype. During grain filling, the activity of glutamine synthetase followed a single-peak curve, highly correlated with grain protein content and significantly differed between parents and progenies. GS1.3 and GS2 genes, in transgressive variants and their parents with different protein content, exhibited similar transcription trend during grain filling, that is, the transcription level increased 15-20 days before heading and then decreased gradually. Moreover, the grain protein content was closely related to GS1.3 and GS2 expression levels. The varieties with higher GS transcription level showed higher protein content compared with their parents. In addition, although GS1.3 and GS2 gene sequences showed high conservation, the gene sequence and protein sequence of GS1.3 and GS2 were not completely identical in different varieties, and there are some single nuclear polymorphisms. Random base variation as well as changes in codon and amino acids might occur because inter-variety sexual hybridization causes base substitution during segregation and stability.

Key words:japonica rice; transgressive variant; grain; GS gene expression; sequence variation

DOI:10.16819/j.1001-7216.2016.5150

收稿日期:2015-10-19； 修改稿收到日期: 2015-12-23。

基金項(xiàng)目:科技部科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015BAD23B05)； 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目。

中圖分類號(hào):Q786;S511.032

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-7216(2016)03-0304-09

中國水稻科學(xué)(Chin J Rice Sci),2016,30(3):304-312

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