菜心Hau CMS雄性不育系的轉(zhuǎn)育研究

張 艷，陳漢才，李桂花，黎庭耀

（廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510640）

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菜心Hau CMS雄性不育系的轉(zhuǎn)育研究

張 艷，陳漢才，李桂花，黎庭耀

（廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實驗室，廣東 廣州 510640）

摘 要：以甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系Hau CMS為不育胞質(zhì)供體，菜心為父本，進(jìn)行種間雜交和連續(xù)回交，獲得了一個新型菜心Hau CMS不育系，并對不同回交世代材料進(jìn)行了植物學(xué)性狀、分子生物學(xué)和細(xì)胞學(xué)的研究。結(jié)果表明：F1和各回交世代未出現(xiàn)育性分離現(xiàn)象，不育率和不育度均為100%。F1代植株表型有分離，絕大部分特征偏向于母本，利用菜心連續(xù)回交，到BC3群體已基本趨向輪回親本。用19對SRAP引物對F1和回交世代進(jìn)行遺傳變異的分析，結(jié)果顯示：隨著回交次數(shù)的增加，母本特異性條帶逐漸消失，缺失條帶比率從2.30%（F1）上升至50.42%（BC4），BC4群體母本特異性條帶占總帶型比例為4.16%。石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)菜心Hau CMS不育系的花藥敗育發(fā)生于雄蕊原基分化時期，沒有孢原細(xì)胞的分化，無花粉囊的形成。

關(guān)鍵詞：菜心；甘藍(lán)型油菜Hau CMS；種間雜交；SRAP；花藥發(fā)育

菜心（Brassica campestris L.ssp.chinensis var.utilis Tsenet Lee）屬十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種的一個變種，是廣東省分布最廣、栽培面積最大、復(fù)種指數(shù)最高的蔬菜種類，其產(chǎn)品質(zhì)地鮮嫩、口感清甜、風(fēng)味獨(dú)特。

菜心為典型的異花授粉作物，雜種優(yōu)勢明顯。自交不親和和細(xì)胞質(zhì)雄性不育是雜種優(yōu)勢利用的主要途徑，但自交不親和系親本繁殖困難，種子生產(chǎn)成本高。20世紀(jì)70年代我國開始菜心細(xì)胞質(zhì)雄性不育的研究，彭謙等［1-2］以甘藍(lán)型油菜Pol CMS湘油A為不育源，以菜心為父本通過種間雜交和連續(xù)回交，選育出菜心胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)的保持系，進(jìn)而培育出早優(yōu)1號、早優(yōu)2號、中花雜交菜心。陜西省蔬菜花卉研究所同樣利用甘藍(lán)型油菜Pol CMS為母本，用大白菜3411-7為父本，進(jìn)行雜交和連續(xù)回交以及定向培育，育成大白菜異源胞質(zhì)雄性不育系3411-7A，并將其轉(zhuǎn)育到菜心上，育出了秦薹1號菜心［3］。廣西柳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所利用陜西省蔬菜花卉研究所提供的不育系培育出柳雜1號和柳雜2號菜心。但這些雜交種均未能在生產(chǎn)上大面積推廣，主要原因有兩個：（1）Pol CMS不育率易受溫度變化的影響，很難達(dá)到100%不育，給制種帶來一定風(fēng)險；（2）其雜種優(yōu)勢主要表現(xiàn)在葉片、葉柄伸長，側(cè)芽增多，商品性狀不佳。

Hau CMS是傅廷棟1999年發(fā)現(xiàn)的天然芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，蜜腺正常、不育性穩(wěn)定、敗育徹底，目前已通過遠(yuǎn)緣雜交轉(zhuǎn)移至甘藍(lán)型油菜中［4］。本研究以甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育Hau CMS為不育胞質(zhì)供體，菜心為輪回親本進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，成功選育出菜心Hau CMS不育系，并對各回交世代進(jìn)行遺傳學(xué)分析，在此基礎(chǔ)上探討通過遠(yuǎn)緣雜交將不育基因?qū)氩诵牡募夹g(shù)和方法，以期為菜心雄性不育系的轉(zhuǎn)育提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 試驗材料

2010年以國家油菜武漢改良分中心提供的新型甘藍(lán)型油菜Hau CMS雄性不育材料為母本、菜心自交系7-2為父本進(jìn)行雜交，獲得種間雜種，2011—2014連續(xù)3年用自交系7-2與其回交，在BC4代即獲得穩(wěn)定的菜心雄性不育系7-2A及其相應(yīng)的保持系7-2B。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物學(xué)性狀觀察 在植株營養(yǎng)生長期和抽薹開花期，分別觀察植株的葉片形狀、大小、葉色、苔色、側(cè)芽、抽薹期、開花期等性狀。在開花期，觀察植株的花器官形態(tài)。

1.2.2 花藥發(fā)育的石蠟切片 選取菜心不育系和保持系主莖頂端花序，按花蕾的著生順序及大小分級后，F(xiàn)AA固定液固定，70%乙醇保存。按常規(guī)石蠟切片程序制作切片：不同濃度酒精逐級脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，展片，脫蠟，染色，封藏?；ɡ贆M切，切片厚度4～6 μm，1%甲苯胺蘭染色［5］。

1.2.3 F1和回交世代SRAP分析 采集幼嫩的菜心葉片，DNA提取采用CTAB法，參照文獻(xiàn)［6］的方法并略有改動。

SRAP引物設(shè)計原理參照文獻(xiàn)［7］，引物序列見表1。PCR體系（15 μL）為：100 ng模板DNA、引物各50 ng、1×反應(yīng)緩沖液、200 μmol/l dNTPs、1.5 mmol/l MgCl2和1U Taq DNA聚合酶（MBI公司）。PCR程序參照文獻(xiàn)［7］，PCR產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。

表1　本研究使用的SRAP引物

2　 結(jié)果與分析

2.1 F1和回交世代的植物學(xué)形態(tài)

母本為甘藍(lán)型油菜，植株高大，基葉橢圓或長橢圓形，伸長莖葉出現(xiàn)明顯的琴狀缺刻，薹莖葉披針形、無琴狀缺刻、半包莖著生，葉面、薹莖被蠟粉，葉色藍(lán)綠，分枝多，需低溫春化，不育度和不育率為100%（圖1A，封三）。父本為菜心，早熟，葉片卵圓形，葉色和薹色為油綠色，無蠟粉，側(cè)芽少，無需低溫春化（圖1B，封三）。通過甘藍(lán)型油菜與菜心雜交獲得的F1代和各回交世代未出現(xiàn)育性分離現(xiàn)象，不育率和不育度均為100%。通過田間植物學(xué)性狀觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代有分離，絕大部分單株特征偏向于母本，與甘藍(lán)型油菜相似，但少數(shù)單株在葉片形狀、大小、顏色、抽薹開花期等方面出現(xiàn)偏向父本的特征，個別單株不需要低溫即可抽薹開花。植株苗期不黃化，100%不育且不育性穩(wěn)定，蜜腺正常，能正常結(jié)實（圖1C、D，封三）。選擇早抽薹的F1單株與菜心回交，得到BC1，BC1代植株表型分離最嚴(yán)重，有的保持母本性狀，有的代相似父本，大多數(shù)為中間型，植株高矮不均，株型變小，分枝數(shù)減少，葉片變小，部分單株葉面和薹莖無蠟粉（圖1E、F，封三）。選擇無蠟粉，抽薹早的單株與菜心繼續(xù)回交，BC2代植株表型依然分離嚴(yán)重，但是絕大部分特征偏向于父本，出現(xiàn)和父本極其相似的單株，僅在葉色、薹色和抽薹期方面稍有不同，葉色、薹色啞綠，無光澤，抽薹期較父本推遲7 d左右（圖1G，封三）。BC3代植株性狀基本趨向輪回親本，抽薹期略晚，較父本推遲3～5 d（圖1H，封三）。選擇抽薹期較早，性狀與父本最相似的植株與父本回交得到BC4，BC4代植株生長整齊一致，圓葉、柄短、葉色和薹色油綠，側(cè)芽少，不育性穩(wěn)定、敗育徹底，蜜腺正常，結(jié)實性好（圖1I、J，封三）。

2.2 F1和回交世代SRAP分析

2.2.1 親本和雜種F1分析 用170對SRAP引物對2個親本進(jìn)行篩選，隨機(jī)選取19對擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的SRAP引物對2個親本、雜種F1和回交后代進(jìn)行分析。親本總共擴(kuò)增出145條帶，其中甘藍(lán)型油菜特異性帶32條，菜心特異性帶12條，甘藍(lán)型油菜和菜心共有的帶型為101條。

F1總共擴(kuò)增出522條帶，其中甘藍(lán)型油菜特異性條帶181條、占總帶型的34.67%，母本特異帶缺失12條、占總帶型的2.30%，菜心特異性帶41條、占總帶型的7.85%，甘藍(lán)型油菜和菜心共有的帶型為264條、占總帶型的50.57%，雙親均沒有的新增帶型36條、占總帶型的6.90%。

2.2.2 回交一代（BC1）分析 BC1總共擴(kuò)增出488條帶，其中甘藍(lán)型油菜特異性帶132條、占總帶型的27.05%，菜心特異性帶43條、占總帶型的8.81%，甘藍(lán)型油菜和菜心共有的帶型274條、占總帶型的56.15%，雙親均沒有的新增帶39條、占總帶型的7.99%，母本特異帶缺失62條、占總帶型的12.70%。

2.2.3 回交二代（BC2）分析 BC2總共擴(kuò)增出431條帶，其中甘藍(lán)型油菜特異性帶68條、占總帶型的15.78%，菜心特異性帶68條、占總帶型的15.78%，甘藍(lán)型油菜和菜心共有的帶型為278條、占總帶型的64.50%，雙親均沒有的新增帶型17條、占總帶型的3.94%，母本特異帶缺失108條、占總帶型的25.06%。

2.2.4 回交三代（BC3）分析 BC3總共擴(kuò)增出384條帶，其中甘藍(lán)型油菜特異性帶34條、占總帶型的8.85%，菜心特異性帶62條、占總帶型的16.15%，甘藍(lán)型油菜和菜心共有的帶型為265條、占總帶型的69.01%，雙親均沒有的新增帶型23條、占總帶型的5.99%，母本特異性帶缺失159條、占總帶型的41.41%。

2.2.5 回交四代（BC4）分析 BC4總共擴(kuò)增出361條帶，其中甘藍(lán)型油菜特異性帶15條、占總帶型的4.16%，菜心特異性帶76條、占總帶型的21.05%，甘藍(lán)型油菜和菜心共有的帶型為260條、占總帶型的72.02%，雙親均沒有的新增帶型10條、占總帶型的2.11%。母本特異性帶缺失182條、占總帶型的50.42%。

2.3 菜心不育系花藥敗育特征

2.3.1 菜心保持系花藥的發(fā)育 顯微觀察顯示，花藥形態(tài)從最早的花藥原基分化至花藥各層細(xì)胞出現(xiàn)，花粉母細(xì)胞被四層體細(xì)胞包圍：外表皮、內(nèi)表皮、中層和絨氈層（圖3A，封三），花藥呈蝴蝶狀，4個藥隔出現(xiàn)?；ǚ勰讣?xì)胞經(jīng)過減數(shù)分裂形成四分體，隨著包裹四分體的胼胝質(zhì)降解，小孢子被釋放出來形成了單核小孢子（圖3B，封三）。隨著絨氈層和中層細(xì)胞的降解，單核小孢子經(jīng)過兩輪有絲分裂形成一個包含兩個精子和1個營養(yǎng)細(xì)胞的的成熟花藥，隨后花藥開裂，成熟花粉粒從藥隔中釋放出來（圖3C，封三）。

2.3.2 菜心不育系花藥的發(fā)育 菜心不育系7-2A花藥發(fā)育受阻于孢原細(xì)胞分化期，孢原細(xì)胞不分裂形成造孢細(xì)胞和壁細(xì)胞（圖3D，封三），后期花藥向邊緣生長并最終發(fā)育成由表皮、基本組織和維管束組成的無花粉囊型花藥（圖3E，封三）。

3　結(jié)論與討論

甘藍(lán)型油菜與菜心遠(yuǎn)緣雜交，其親和性良好，人工授粉后不需經(jīng)過特殊處理即可在田間得到少量種子?？赡苁且驗椴诵?（AA=20）與甘藍(lán)型油菜（AACC=38）有一組相同的染色體組AA，這與前人研究的芥菜型油菜（AABB）、甘藍(lán)型油菜（AACC）和白菜（AA）雜交容易得到雜種的結(jié)論是一致的。甘藍(lán)型油菜（AACC）是源于蕓薹（AA）和甘藍(lán)（CC）的自然復(fù)合種。A、C基因組間高度同源，已知功能的編碼蛋白質(zhì)的基因在本質(zhì)上完全共線性，大約95%的序列是一致的［8-9］。在甘藍(lán)型油菜中，A和C基因組均保留了其完整性，并與它們的二倍體親本（白菜和甘藍(lán)）非常接近。在進(jìn)行白菜與甘藍(lán)型油菜的比較作圖時，發(fā)現(xiàn)兩個物種中的多數(shù)A基因組上的位點(diǎn)都是保守的［10］。SRAP標(biāo)記對F1和回交世代遺傳變異的分析結(jié)果也證實了這一點(diǎn)，雜種和回交世代父母本共有的條帶比率占50%以上，BC4群體父母本共有的條帶比率為72.02%。F1和回交世代父母本都沒有的新增條帶比率維持在5%左右，說明在甘藍(lán)型油菜（AACC）和菜心（CC）遠(yuǎn)緣雜交和回交過程中發(fā)生了染色體交換重組。BC3母本特異性條帶占總帶型的8.85%，材料的田間表型較整齊一致，基本與輪回親本的性狀相同，這表明AACC染色體組物種與AA染色體物種遠(yuǎn)緣雜交經(jīng)少數(shù)幾代回交即可迅速獲得后代性狀相對穩(wěn)定的材料。

關(guān)于蕓薹屬作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的花藥發(fā)育，前人做了很多研究，Pol CMS的花藥發(fā)育受阻于孢原細(xì)胞分化期，沒有花粉囊形成；Ogu CMS的敗育發(fā)生在四分體至單核花粉時期，小孢子難以從四分體中釋放出來［11］；白菜Hau CMS不育系6w-9605A的花藥敗育有兩種方式，2/3的花藥發(fā)育受阻于孢原分化時期，不形成花粉囊，1/3的敗育花藥可形成花粉囊，小孢子受阻于單核靠邊期［11］；本研究菜心Hau CMS不育系7-2 A的敗育時期為孢原細(xì)胞分化期，沒有造孢細(xì)胞和壁細(xì)胞的分化，屬于無花粉囊型，這與芥菜Hau CMS不育系0912A的敗育方式類似［12］。而芥菜型油菜不育系00-6-102A的花藥敗育發(fā)生在雄蕊原基分化期，典型特征是雄蕊原基偏離正常的分化軌道，形成花瓣原基，無孢原細(xì)胞及花粉囊的形成，6枚雄蕊發(fā)育成小花瓣［13］。說明Hau CMS不育胞質(zhì)在不同的核背景下，其花藥敗育方式會發(fā)生改變，這與王濤濤等［14］的研究結(jié)果一致，原因可能是不同的核基因?qū)au CMS的調(diào)控作用不同。

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（責(zé)任編輯白雪娜）

Trans-breeding Hau cytoplasmic male sterile line in Chinese flowering cabbage

ZHANG Yan，CHEN Han-cai，LI Gui-hua，LI Ting-yao
（Vegetable Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables，Guangzhou 510640，China）

Abstract：Using the Hau cytoplasmic male sterile line of Brassica napus as sterile material，interspecific cross and successive backcrossing with 7-2B were conducted to transfer the Hau CMS to Chinese flowering cabbage.In the course of acquiring cytoplasmic male sterility lines，the morphology，molecular biology and cytology in various backcross generations were studied.The results showed that，the morphological characteristics of F1plants were segregated and more like the female parent，the progeny became stable and more similar to Chinese flowering cabbage by BC3.Analysis by SRAP indicated that 2.3% to 50.42% of the total bands eliminated from F1to BC4 were female parent specific，and 4.16% of female parent were remained in the BC4 plants.The dissection of anther development indicated that the anther abortion occurred at the early stage of stamen sporogonium differentiation，and no butterfly anther appeared.

Key words：Chinese flowering cabbage；Hau cytoplasmic male sterile line； interspecific hybridization；sequence-related amplified polymorphism（SRAP）； anther development

中圖分類號：S634.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1004-874X（2016）01-0030-04

收稿日期；2015-10-02

基金項目：廣東省科技計劃項目（2012A020100006，2012B020303004，2014A020208144）；廣東省自然科學(xué)基金項目（2014A030313565）

作者簡介：張艷（1981-），女，博士，助理研究員，E-mail:18520164058@163.com

通訊作者 ：陳漢才（1962-），男，研究員，E-mail: chen6206@21cn.com