PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)氣腹預(yù)處理大鼠肝臟的保護(hù)作用*

蔣天盛， 李春來， 袁洪濤

(貴陽市第一人民醫(yī)院, 貴州 貴陽　550001)

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PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)氣腹預(yù)處理大鼠肝臟的保護(hù)作用*

蔣天盛， 李春來， 袁洪濤

(貴陽市第一人民醫(yī)院, 貴州 貴陽550001)

[摘要]目的： 觀察氣腹預(yù)處理后大鼠肝組織中磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路的變化。方法： 健康SD大鼠30只，隨機(jī)均分為假氣腹組、氣腹組和氣腹預(yù)處理組；氣腹組大鼠臍旁插入氣腹針并連接SN/REF氣腹機(jī)充入二氧化碳(CO2)建立氣腹模型(腹壓保持在15 mmHg，持續(xù)90 min后解除氣腹)，氣腹預(yù)處理組在建立氣腹前先進(jìn)行預(yù)處理(充氣5 min，放氣5 min，重復(fù)2次)，其余同氣腹組；假氣腹組大鼠臍旁插入氣腹針但不充入CO2氣體；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠；取同一部位肝組織，采用Western Blot檢測(cè)肝臟中Akt、p-Akt蛋白的表達(dá)，采用TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡。 結(jié)果： 與假氣腹組比較，氣腹組大鼠肝臟中Akt及p-Akt的表達(dá)顯著減少，而肝細(xì)胞凋亡率則顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與氣腹組比較，氣腹預(yù)處理組大鼠肝臟中Akt及p-Akt的表達(dá)顯著增高，而肝細(xì)胞凋亡率則明顯較少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 結(jié)論： PI3K/Akt信號(hào)通路可能參與了氣腹預(yù)處理對(duì)大鼠肝組織的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]模型,動(dòng)物； 氣腹,人工； 預(yù)處理； 蛋白激酶B； 大鼠,Sprague-Dawley

近年來，腹腔鏡手術(shù)過程中建立二氧化碳(CO2)氣腹所導(dǎo)致的腹腔臟器病理生理改變及其對(duì)臟器功能的影響正日益引起關(guān)注[1]。CO2氣腹自身的壓力會(huì)造成腹腔臟器組織缺血損傷，氣腹缺血預(yù)處理對(duì)提高組織缺血耐受性的作用雖受到重視，但其保護(hù)作用的具體機(jī)制尚不清楚[2]。磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路是體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路之一，PI3K可通過激活其下游效應(yīng)分子Akt，抑制促凋亡蛋白Bad、Bax和caspase的形成，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的[3-4]。本研究通過模擬臨床腹腔鏡手術(shù)的操作環(huán)境，通過建立CO2氣腹及氣腹預(yù)處理動(dòng)物模型，初步探討CO2氣腹預(yù)處理對(duì)大鼠肝組織中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響及其對(duì)肝組織的保護(hù)作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、儀器與試劑

健康成年雄性SD大鼠30只，8～12周齡體，質(zhì)量220～260 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SN/REF氣腹機(jī)(美國Stryker公司)；戊巴比妥鈉購自上海西塘生物科技有限公司；兔抗大鼠Akt、p-Akt抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司； PVDF膜及ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國Millipore公司；十二烷基硫酸鈉、甘氨酸、丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷及過硫酸銨購自北京鼎國公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1分組及模型復(fù)制30只SD大鼠隨機(jī)分為假氣腹組、氣腹組和氣腹預(yù)處理組，每組各10只。采用1%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 體重腹腔注射麻醉后，取仰臥位固定。臍周采用75%酒精消毒滅菌，參照文獻(xiàn)[5]建立氣腹模型。氣腹組大鼠在臍旁插入氣腹針并連接SN/REF氣腹機(jī)充入CO2建立氣腹動(dòng)物模型，腹壓維持在15 mmHg，持續(xù)90 min后解除氣腹；氣腹預(yù)處理組在建立氣腹前先進(jìn)行預(yù)處理(CO2充氣5 min、腹壓維持在15 mmHg、放氣5 min，重復(fù)2次)后建立CO2氣腹，方法同氣腹組；假氣腹組僅在臍旁插入針頭但不充入CO2。手術(shù)結(jié)束后24 h(再灌注24 h后)處死大鼠，每只大鼠取相同部位肝組織于4%中性甲醛溶液中固定48 h，剩余肝組織儲(chǔ)存在-80 ℃低溫冰箱，統(tǒng)一進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.2.2肝組織Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表達(dá)采用Western Blot法檢測(cè)，取0.1 g肝組織提取總蛋白，經(jīng)垂直電泳分離蛋白質(zhì)后，采用全濕電轉(zhuǎn)移進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于封閉緩沖液中2 h。洗膜緩沖液洗膜3次，將PVDF膜與一抗稀釋液(Akt 1∶1 000，p-Akt 1∶500)4 ℃孵育過夜。次日用洗膜緩沖液洗膜3次，PVDF膜與二抗稀釋液(1∶3 000)在室溫下孵育1 h, 洗膜緩沖液洗膜3次。加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，暗室中反應(yīng)1 min后將PVDF膜迅速封入保鮮膜中，Kodak膠片進(jìn)行顯影、定影，并用清水沖洗晾干。

1.2.3肝細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用 TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡， 嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1肝臟組織中Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

各組大鼠肝臟組織中Akt、p-Akt蛋白表達(dá)如表1、圖1所示，與假氣腹組比較，氣腹組大鼠肝組織中Akt、p-Akt的表達(dá)均顯著減少(P<0.01)；與氣腹組比較，氣腹預(yù)處理組大鼠肝臟組織中Akt、p-Akt的表達(dá)均顯著增加(P<0.05)。

2.2肝細(xì)胞凋亡

TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡結(jié)果如表1、圖2所示，假氣腹組大鼠肝臟內(nèi)僅有少量肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，而氣腹組大鼠肝細(xì)胞凋亡率較假氣腹組明顯增加(P<0.01)；經(jīng)氣腹預(yù)處理組大鼠肝組織中細(xì)胞凋亡率較氣腹組顯著減少(P<0.05)。

表1　大鼠肝臟組織中總Akt、p-Akt水平及

(1)與假氣腹組比較，P<0.01；(2)與氣腹組比較，P<0.05

注：1 假氣腹組; 2 氣腹組; 3 氣腹預(yù)處理組圖1　3組大鼠肝臟組織中Akt、p-Akt表達(dá)(Western Blot)Fig.1　Expression of Akt and p-Akt in liver tissue of 3 groups of rats(Western Blot)

3討論

腹腔鏡手術(shù)過程中通常采用CO2氣腹技術(shù)來獲得充分的操作空間。在建立CO2氣腹的過程中，由于腹腔壓力快速增加，壓迫內(nèi)臟血管，使肝動(dòng)脈、門靜脈等血管阻力增加，血液灌流不足，從而導(dǎo)致肝臟的缺血損傷[6]；當(dāng)手術(shù)結(jié)束解除氣腹后由于腹腔內(nèi)壓驟降，內(nèi)臟血管阻力消除，肝臟血液灌流得以恢復(fù)。因此氣腹過程實(shí)質(zhì)上相當(dāng)于肝臟缺血再灌注過程，其所引起的肝臟損傷已被大量研究所證實(shí)[7]。近年來有研究表明，氣腹預(yù)處理有類似缺血預(yù)處理的作用，能有效減輕腹腔鏡術(shù)中氣腹所致的肝臟損傷。Ates等[8]報(bào)道在建立大鼠CO2氣腹前，給予5 min的充氣(15 mmHg)和5 min的放氣可顯著改善術(shù)中長時(shí)間氣腹產(chǎn)生的缺血/再灌注損傷。PI3k/Akt信號(hào)通路中的PI3K是生長因子受體超家族中的重要成員，而其下游效應(yīng)分子Akt為PKA和PKC家族成員[9]。PI3k活化后使Akt轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，催化其自身的Ser124和Thr450發(fā)生磷酸化而激活；此外Akt和PDK-1同時(shí)定位在細(xì)胞膜上，PDK-1能進(jìn)一步催化Akt的Ser473和Thr308發(fā)生磷酸化，從而使Akt完全活化[10]。磷酸化的Akt(p-Akt)可以傳遞抗凋亡信號(hào)到其下游的效應(yīng)分子，從而發(fā)揮對(duì)抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞生長增殖的作用[11]。

假氣腹組　　　　　　　　　　　氣腹組　　　　　　　　　　　氣腹預(yù)處理組圖2　3組大鼠肝細(xì)胞凋亡(TUNEL，×200) Fig.2　Hepatocytes apoptosis of 3 groups of rats

本研究通過模擬臨床腹腔鏡手術(shù)的操作環(huán)境，建立CO2氣腹及氣腹預(yù)處理動(dòng)物模型，觀察各組大鼠肝臟組織中總Akt及p-Akt的表達(dá)情況。結(jié)果表明，氣腹組大鼠肝組織中總Akt及p-Akt的表達(dá)較假氣腹組顯著減少，同時(shí)肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率顯著增加，提示PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制可能參與了CO2充氣和放氣造成的肝組織缺血/再灌注損傷。而氣腹預(yù)處理組大鼠肝組織中總Akt及p-Akt的表達(dá)較氣腹組明顯增多，同時(shí)肝組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率較氣腹組有所減少，這充分表明氣腹預(yù)處理能通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路減少肝細(xì)胞凋亡來發(fā)揮減輕肝組織缺血-再灌注損傷的作用。

4參考文獻(xiàn)

[1] 包延麗，黃中華，梁寧，等. 氣腹模型中預(yù)氣腹與谷氨酰胺干預(yù)對(duì)肺損傷保護(hù)作用的研究[J]. 廣西醫(yī)學(xué), 2011 (7):797-800.

[2] 于建宏，馬加海，丁永波，等. 氣腹預(yù)處理對(duì)氣腹所致大鼠腎臟損傷的保護(hù)作用[J]．山東醫(yī)藥， 2008(46)：41-42.

[3] 劉友平，嚴(yán)冬梅，陳川寧，等. PI3K/Akt調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)GRP78的誘導(dǎo)[J]. 中國病理生理雜志， 2011(4)：749-754.

[4] 張慧，姜詠梅，尹琳. PI3K/ AKT / GSK-3B信號(hào)在腦缺血預(yù)處理中的作用及對(duì)海馬細(xì)胞凋亡的影響[J]. 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版， 2011(4)：408-412.

[5] 稽武，陳訓(xùn)如，周正東，等. CO2氣腹對(duì)兔肝腎功能的影響機(jī)制[J]．世界華人消化雜志， 1999 (10) : 897-899.

[6] 朱以祥，王衛(wèi)星. 氣腹預(yù)處理對(duì)腹腔鏡手術(shù)大鼠肝臟保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 微循環(huán)學(xué)雜志， 2008 (1):11-12.

[7] 李平，李巍. 氣腹預(yù)處理對(duì)患者肝功能的保護(hù)作用[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)生， 2010 (2): 128.

[8] Ates E，Yilmaz S，Ihtiyar E，et al. Preconditioning-like amelioration of erythropoietin against laparoscopy-induced oxidative injury[J]．Surg Endosc， 2006 (5)：815-819.

[9] Rong R，Xijun X. Erythropoietin pretreatment suppresses inflammation by activating the PI3K/Akt signaling pathway in myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Exp Ther Med. 2015 (2):413-418.

[10]李娜，祝聰聰，肖永紅，等. PI3K抑制劑對(duì)四氯化碳刺激的肝星狀細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原表達(dá)的影響[J]. 西安交通大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版， 2013 (2) ：164-167.

[11]Jian J，Xuan F，Qin F，et al. Bauhinia championii flavone inhibits apoptosis and autophagy via the PI3K/Akt pathway in myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Drug Des Devel Ther, 2015(9):5933-5945.

(2016-01-10收稿，2016-04-22修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

Protective Effect of PI3K/Akt Signaling Pathway on Liver of Pneumoperitoneum Preconditioning Rats

JIANG Tiansheng, LI Chunlai, YUAN Hongtao

(TheFirstPeople'sHospitalofGuiyang,Guiyang550001,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To observe the change of PI3K/Akt signaling pathway in liver tissue of pneumoperitoneum preconditioning rats. Methods: 30 healthy SD rats were divided into sham pneumoperitoneum group, pneumoperitoneum group and pneumoperitoneum preconditioning group randomly, 10 rats in each group. Inserting the veress beside the navel of rats and connecting SN/REF pneumoperitoneum machine to insufflate CO2 for 90 minutes to establish the pneumoperitoneum model, abdominal pressure maintained at 15 mmHg. The pneumoperitoneum preconditioning group was subjected to 5 min of insufflation and 5 min of deflation, repeat for 2 times, then following the same practice as pneumoperitoneum group. The rats of sham pneumoperitoneum group were inserted needles but not filling CO2. Changes of PI3K/Akt signaling pathway were detected by western blot. The apoptosis of hepatocytes was detected by TUNEL. Results: Comparing with sham pneumoperitoneum group, the expression of total Akt and p-Akt of pneumoperitoneum group were significantly decreased(P<0.01), while the apoptosis of hepatocytes was increased; comparing with pneumoperitoneum group, the expression of total Akt and p-Akt of pneumoperitoneum preconditioning group were significantly increased(P<0.05), while the apoptosis of hepatocytes was decreased. Conclusion: PI3K/Akt signaling pathway may be involved in the protective effects of pneumoperitoneum preconditioning on liver tissue of rats.

[Key words]model,animal; pneumoperitoneum,artificial; preconditioning; protein kinase B; rats,Sprague-Dawley

*[基金項(xiàng)目]貴陽市衛(wèi)生局科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目[(2014)筑衛(wèi)科技合同字第2號(hào)]

[中圖分類號(hào)]R657.3

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0564-03

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.017

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2115.040.html