云南漢族人群CD6基因多態(tài)性與HCV慢性感染的關(guān)系*

劉城秀， 沈云松， 李桃意， 張　禹， 檀林萍， 姚月婷， 俞建昆， 姚宇峰， 史　荔**

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明　650118； 2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明　650118； 3.云南省第一人民醫(yī)院&昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院， 云南 昆明　650032)

?

云南漢族人群CD6基因多態(tài)性與HCV慢性感染的關(guān)系*

劉城秀1,2， 沈云松3， 李桃意1,2， 張禹1,2， 檀林萍1,2， 姚月婷1,2， 俞建昆1,2， 姚宇峰1,2， 史荔1,2**

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明650118； 2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南 昆明650118； 3.云南省第一人民醫(yī)院&昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院， 云南 昆明650032)

[摘要]目的： 探討云南漢族人群中CD6基因多態(tài)性與慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的關(guān)系。方法： 隨機(jī)抽取云南地區(qū)漢族人群HCV慢性感染患者434例，健康對(duì)照人群444例；采用TaqMan探針基因分型方法對(duì)2組人群的CD6基因3個(gè)SNPs(rs17824933、rs12360861、rs11230563)進(jìn)行基因分型，構(gòu)建CD6基因單倍型，評(píng)估上述3個(gè)SNPs與HCV慢性感染的關(guān)系。結(jié)果： 兩組人群CD6基因SNP-rs17824933 (C>G)、 SNP-rs12360861 (G>A)和SNP-rs11230563 (C>T)基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；2組人群的SNP-rs17824933 (C>G)、 SNP-rs12360861 (G>A)和SNP-rs11230563 (C>T)單倍型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論： 此次調(diào)查的云南漢族群體的CD6基因SNP-rs17824933 (C>G)、 SNP-rs12360861 (G>A)和SNP-rs11230563 (C>T)與HCV慢性感染無(wú)關(guān)。

[關(guān)鍵詞]肝炎，丙型，慢性； 多態(tài)性單核苷酸； 基因，CD6； 云南

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)屬黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.6 kb。我國(guó)HCV感染率約為3.2%，感染者已達(dá)3 800萬(wàn)人[1]。感染HCV后，約20%急性感染者可自發(fā)清除HCV，其余發(fā)展為慢性持續(xù)感染，繼而發(fā)展成肝纖維化、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[2]。因此，宿主免疫系統(tǒng)遺傳因素在HCV感染后的清除或持續(xù)感染中可能起到的作用研究一直是該方向的熱點(diǎn)之一。有研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)不同人群中的HLA-B與慢性HCV感染關(guān)系密切[3-6]。CD6在T細(xì)胞的活化和增殖過(guò)程中起著重要作用。CD6基因位于人類染色體11q13，編碼一個(gè)分子量為100～130 kDa跨膜糖蛋白，這個(gè)跨膜糖蛋白包含3個(gè)富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的清道夫受體(scavenger receptor cysteine-rich，SRCR)和1個(gè)活化白細(xì)胞黏附分子(activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM)的結(jié)合位點(diǎn)[7]。CD6主要表達(dá)在CD4+和CD8+T細(xì)胞，胸腺細(xì)胞，某些B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞亞群上以及腦的某些區(qū)域[8]。但是，目前國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)CD6基因多態(tài)性與HCV慢性感染的相關(guān)性研究并沒有得到明確結(jié)論。本研究對(duì)云南地區(qū)漢族人群CD6基因內(nèi)含子區(qū)域SNP-rs17824933 (C>G)和編碼區(qū)域SNP-rs12360861 (G>A)、SNP-rs11230563 (C>T)位點(diǎn)進(jìn)行分析，探討這3個(gè)位點(diǎn)多態(tài)性與HCV慢性感染的關(guān)系。

1對(duì)象與方法

1.1對(duì)象

隨機(jī)抽取云南省434名HCV慢性感染者為病例組，診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)2015年制定的《丙型肝炎防治指南》[9]，血清ALT、AST、抗HCV、HCV-RNA陽(yáng)性，排除其他肝炎的患者。隨機(jī)抽取同時(shí)期云南省正常健康個(gè)體444名為對(duì)照組，納入標(biāo)準(zhǔn)為受試者血清ALT、AST、抗HCV、HCV-RNA正常。所有受試者均為居住于云南地區(qū)的彼此無(wú)血緣關(guān)系漢族個(gè)體并簽署知情同意書，允許其樣本與臨床資料用于本次研究。病例組，年齡(43.27±10.23)歲，男性250(57.60%)例，女性184例(42.40%)；對(duì)照組，年齡(42.74±9.07)歲，男性227例(51.13%)，女性217例(48.87%)。兩組受試者基礎(chǔ)資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1樣本采集采集受試者空腹靜脈血5 mL，用EDTA抗凝，置-80 ℃保存，按照Qiagen血基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取外周血基因組DNA，置-20 ℃保存。1.2.2CD6基因SNP位點(diǎn)基因分型采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行SNP分型，由Applied Biosystems公司合成檢測(cè)rs17824933 (C>G)，rs12360861 (G>A)及rs11230563 (C>T)位點(diǎn)的引物及TaqMan探針。針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)所設(shè)計(jì)的兩條探針分別用VIC和FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記。羅氏LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)SNP位點(diǎn)，并用LCS480 1.5.1.62軟件進(jìn)行基因分型。PCR反應(yīng)體積為20 μL，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min預(yù)變性，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min(共40個(gè)循環(huán))，40 ℃延伸 5 min。以3個(gè)已知基因型(野生純合子、突變純合子、雜合子)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照(均為本課題組經(jīng)基因測(cè)序樣本驗(yàn)證，SNP-rs17824933(C>G)樣本其野生純合子、突變純合子、雜合子的基因型分別是CC、GG及CG，SNP-rs12360861(G>A)為GG、AA及AG；SNP-rs11230563 (C>T)為CC、TT及CT)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)基因型頻率的代表性。χ2檢驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照組與病例組3個(gè)SNP基因型、等位基因頻率差異。SHEsis軟件程序計(jì)算連鎖不平衡，根據(jù)連鎖不平衡(Linkage Disequilibrium , LD)結(jié)果構(gòu)建單倍型；兩位點(diǎn)間的LD關(guān)系用 D′表示，D′>0.8認(rèn)為位點(diǎn)間強(qiáng)連鎖[10-11]。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果2.1CD6多態(tài)性位點(diǎn)的等位基因頻率與基因型頻率

CD6基因3個(gè)SNP位點(diǎn)rs17824933 (C>G)、rs12360861 (G>A)及rs11230563 (C>T)的基因型分布在病例組和對(duì)照組中均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。CD6基因3個(gè)SNP位點(diǎn)rs17824933 (C>G)、rs12360861 (G>A)及rs11230563 (C>T)的等位基因頻率與基因型頻率在病例組和對(duì)照組中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1～3。

表1　CD6基因rs17824933位點(diǎn)的基因

表2　CD6基因rs12360861位點(diǎn)的基因

表3　CD6基因rs11230563位點(diǎn)的基因

2.2連鎖不平衡

CD6基因3個(gè)SNP位點(diǎn)rs17824933 (C>G)、rs12360861 (G>A)及rs11230563 (C>T)的連鎖不平衡分析結(jié)果顯示rs17824933 (C>G)、rs12360861 (G>A)及rs11230563 (C>T)位點(diǎn)之間存在強(qiáng)連鎖不平衡，見表4。

2.3CD6基因多態(tài)性位點(diǎn)的單倍型構(gòu)建及頻率

構(gòu)建CD6基因3個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型結(jié)果顯示，單倍型的頻率在病例組和對(duì)照組中的分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5。

表4　CD6基因3個(gè)SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析

表5　病例組和對(duì)照組CD6基因3個(gè)

(1)SHEsis軟件程序忽略分析頻率<0.03的單倍型，不作統(tǒng)計(jì)分析

3討論

感染HCV是引起丙型肝炎發(fā)生的主要因素之一。HCV感染的主要方式有輸血傳播、靜脈吸毒傳播、性傳播和母嬰傳播。近年來(lái)，新發(fā)感染與靜脈吸毒和不潔注射有關(guān)。在云南，靜脈用藥人群中的77.7%可以檢測(cè)到抗-HCV抗體[12]。因此本研究選取云南漢族人群研究對(duì)象。

CD6是富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的SRCR超家族的成員，參與T細(xì)胞的活化和增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞間磷蛋白的表達(dá)和前炎性細(xì)胞活素的產(chǎn)生[13-14]。CD6刺激在維持T細(xì)胞活化過(guò)程中起重要作用，因阻斷與其配體ALCAM的相互作用而導(dǎo)致T細(xì)胞增殖的減少[15]。而且，由于CD6與中央超分子活化簇(central supramolecular activation cluster，cSMAC)區(qū)域的結(jié)合，會(huì)使CD6參與到免疫突觸的突變[16]。有研究表明，CD6基因多態(tài)性可能影響CD6的表達(dá)和功能，從而改變免疫應(yīng)答水平而引起疾病的發(fā)生。De Jager等[17]發(fā)現(xiàn)，CD6基因多態(tài)性與多發(fā)性硬化癥(Multiple sclerosis，MS)有關(guān)。其中，CD6基因中的SNP-rs12360861 (G>A)位于第2富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的SRCR第5外顯子，編碼CD6與其配體ALCAM的結(jié)合位點(diǎn)；同時(shí)也處于叫做外顯子剪接增強(qiáng)子(exonic splicing enhancer，ESE)的順式作用元件中[18]，通過(guò)無(wú)義突變、錯(cuò)義突變或同義突變，ESE被破壞而影響mRNA的正確的持續(xù)合成能力[19]。因此，有學(xué)者提出假設(shè)認(rèn)為G取代A會(huì)導(dǎo)致ESE被破壞，ALCAM與CD6配體受體結(jié)合減少，可能引起限制自體反應(yīng)的T淋巴細(xì)胞通過(guò)血腦屏障的轉(zhuǎn)移，這樣對(duì)發(fā)生MS起保護(hù)作用[20]。Baratte等[21]的研究也表明第5 外顯子的選擇性剪接作用對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化起到重要作用。Wagner等[20]對(duì)波蘭人群的研究發(fā)現(xiàn)，攜帶AA基因型的個(gè)體患MS的的風(fēng)險(xiǎn)比攜帶GG基因型的低3倍。CD6基因的另一個(gè)SNP-rs11230563 (C>T)位點(diǎn)位于第2富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域的SRCR的第4 外顯子。Swaminathan等[8]對(duì)西班牙人群的研究發(fā)現(xiàn)，SRCR區(qū)域的非同義突變SNP-rs11230563可能引起CD6表達(dá)水平的改變以及與其配體結(jié)合能力或者信號(hào)傳導(dǎo)的改變；運(yùn)用流式細(xì)胞熒光分析技術(shù)對(duì)MS患者的淋巴細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)初始的CD4+和CD8+T細(xì)胞比效應(yīng)性和中心性記憶T細(xì)胞更容易受CD6單倍型的影響。CD6在胸腺細(xì)胞中的高表達(dá)并且認(rèn)為有助于陽(yáng)性選擇和抵抗細(xì)胞凋亡[22]。 SNP-rs17824933 (C>G)位于CD6基因第1內(nèi)含子。Swaminathan等[23]研究表明SNP-rs17824933 (C>G)位點(diǎn)的G等位基因可能是罹患MS的危險(xiǎn)因素。Kofler等[24]首次做了與疾病相關(guān)的CD6基因SNP 位點(diǎn)rs17824933與T細(xì)胞功能關(guān)系的研究，研究結(jié)果表明在CD6基因上的MS的風(fēng)險(xiǎn)等位基因與CD4+T細(xì)胞的異常增殖相關(guān)，并且證明了與疾病相關(guān)的等位基因在免疫學(xué)特性上的影響。rs12360861第1036位堿基G>A，引起第271個(gè)氨基酸由非極性脂肪族氨基酸突變?yōu)闃O性中性氨基酸，rs11230563第898位堿基C>T，引起第225個(gè)氨基酸由堿性氨基酸突變?yōu)榉枷阕灏被?，均為錯(cuò)義突變；rs17824933是在CD6基因非編碼區(qū)的第1內(nèi)含子中發(fā)生了堿基的顛換。

本研究選取云南省漢族人群，研究CD6基因內(nèi)含子區(qū)域SNP-rs17824933 (C>G)和編碼區(qū)域SNP-rs12360861 (G>A)、SNP-rs11230563 (C>T)3個(gè)位點(diǎn)與HCV慢性感染的關(guān)系，這些SNP與HCV慢性感染的無(wú)直接關(guān)聯(lián)。參照Ensembl網(wǎng)站SNP位點(diǎn)的基因頻率，在亞洲人群中rs17824933(C>G)等位基因G的基因頻率約為3%，而在歐洲人群中G的基因頻率高達(dá)23%；rs12360861(G>A)等位基因A在亞洲人群中頻率極低約為0.1%，本研究為0.3%，與此對(duì)比在歐洲人群中A的基因頻率為19%；rs11230563(C>T)的等位基因T在亞洲人群中的基因頻率約為17%，而在歐洲人群中該基因頻率為36%，但并未找到關(guān)于這3個(gè)SNP位點(diǎn)在亞洲、歐洲正常人群中和HCV感染者之間的關(guān)系研究。本研究未觀察到基于基因頻率的關(guān)聯(lián)性，需要在以后的研究中進(jìn)一步開展病例分層分析，同時(shí)增加其他多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)。

4參考文獻(xiàn)

[1] Zhang C, Wu N, Liu J. HCV subtype characterization among injection drug users: implication for a crucial role of Zhenjiang in HCV transmission in China [J]. PLoS One, 2011(6): e16817.

[2] Sebastiani G, Gkouvatsos K, Pantopoulos K. Chronic hepatitis C and liver fibrosis [J]. World J Gastroenterol, 2014(20): 11033-11053.

[3] Zuniga J, Romero V, Azocar J. Protective KIR-HLA interactions for HCV infection in intravenous drug users [J]. Mol Immunol, 2009(46): 2723-2727.

[4] Knapp S, Warshow U, Hegazy D. Consistent beneficial effects of killer cell immunoglobulin-like receptor 2DL3 and group 1 human leukocyte antigen-C following exposure to hepatitis C virus [J]. Hepatology, 2010(51): 1168-1175.

[5] 戎霞, 黃杰庭, 熊華平. 廣州獻(xiàn)血人群HLA多態(tài)性與慢性HCV感染的關(guān)聯(lián)研究 [J]. 中國(guó)輸血雜志, 2014(27):1116-1119.

[6] 劉錚, 康軼青, 張麗. 河南人群病毒性丙型肝炎與HLA多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究 [J]. 免疫學(xué)雜志, 2015(31):790-794.

[7] Bodian DL, Skonier JE, Bowen MA. Identification of residues in CD6 which are critical for ligand binding [J]. Biochemistry, 1997(36): 2637-2641.

[8] Swaminathan B, Cuapio A, Alloza I. Fine mapping and functional analysis of the multiple sclerosis risk gene CD6 [J]. PLoS One, 2013(8): e62376.

[9] 陳紅松, 竇曉光, 段鐘平. 丙型肝炎防治指南(2015年更新版) [J]. 臨床肝膽病雜志, 2015(31):1961-1979.

[10]Shi YY, He L， SHEsis.a powerful software platform for analyses of linkage disequilibrium, haplotype construction, and genetic association at polymorphism loci [J]. Cell Res, 2005(15): 97-98.

[11]Li Z, Zhang Z, He Z. A partition-ligation-combination-subdivision EM algorithm for haplotype inference with multiallelic markers: update of the SHEsis (http://analysis.bio-x.cn) [J]. Cell Res, 2009(19): 519-523.

[12]Zhou YH, Yao ZH, Liu FL. High prevalence of HIV, HCV, HBV and co-infection and associated risk factors among injecting drug users in Yunnan province, China [J]. PLoS One, 2012(7): e42937.

[13]Hassan NJ, Barclay AN, Brown MH. Frontline: Optimal T cell activation requires the engagement of CD6 and CD166 [J]. Eur J Immunol, 2004(34): 930-940.

[14]Oliveira MI, Goncalves CM, Pinto M. CD6 attenuates early and late signaling events, setting thresholds for T-cell activation [J]. Eur J Immunol, 2012(42): 195-205.

[15]Zimmerman AW, Joosten B, Torensma R. Long-term engagement of CD6 and ALCAM is essential for T-cell proliferation induced by dendritic cells [J]. Blood, 2006(107): 3212-3220.

[16]Castro MA, Oliveira MI, Nunes RJ. Extracellular isoforms of CD6 generated by alternative splicing regulate targeting of CD6 to the immunological synapse [J]. J Immunol, 2007(178): 4351-4361.

[17]De Jager PL, Jia X, Wang J. Meta-analysis of genome scans and replication identify CD6, IRF8 and TNFRSF1A as new multiple sclerosis susceptibility loci [J]. Nat Genet, 2009(41): 776-782.

[18]Desmet FO, Hamroun D, Lalande M. Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals [J]. Nucleic Acids Res, 2009(37): e67.

[19]Baralle D, Baralle M. Splicing in action: assessing disease causing sequence changes [J]. J Med Genet, 2005(42): 737-748.

[20]Wagner M, Bilinska M, Pokryszko-Dragan A. ALCAM and CD6-multiple sclerosis risk factors [J]. J Neuroimmunol, 2014(276): 98-103.

[21]da Gloria VG, Martins de Araujo M, Mafalda Santos A. T cell activation regulates CD6 alternative splicing by transcription dynamics and SRSF1 [J]. J Immunol, 2014(193): 391-399.

[22]Singer NG, Fox DA, Haqqi TM. CD6: expression during development, apoptosis and selection of human and mouse thymocytes [J]. Int Immunol, 2002(14): 585-597.

[23]Swaminathan B, Matesanz F, Cavanillas ML. Validation of the CD6 and TNFRSF1A loci as risk factors for multiple sclerosis in Spain [J]. J Neuroimmunol, 2010(223): 100-103.

[24]Kofler DM, Severson CA, Mousissian N. The CD6 multiple sclerosis susceptibility allele is associated with alterations in CD4+ T cell proliferation [J]. J Immunol, 2011(187): 3286-3291.

(2016-01-06收稿，2016-03-25修回)

中文編輯： 吳昌學(xué)； 英文編輯： 趙毅

The Association between CD6 Polymorphisms and Chronic HCV Infection of Han Population in Yunnan Province

LIU Chengxiu1,2, SHEN Yunsong3, LI Taoyi1,2, ZHANG Yu1,2, TAN Linping1,2,YAO Yueting1,2, YU Jiankun1,2, YAO Yufeng1,2, SHI Li1,2

(1.InstituteofMedicalBiology,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Kunming650118,>Yunnan,China; 2.YunnanKeyLaboratoryofVaccineResearch&DevelopmentonSevereInfectiousDisease,Kunming650118,Yunnan,China; 3.TheFirstPeople'sHospitalinYunnanProvince&theAffiliatedHospitalofKunmingScienceandTechnologyUniversity,Kunming650032,Yunnan,China)

[Abstract]Objective: To investigate the association between CD6 gene polymorphism and chronic HCV chronic infection of Han population in Yunnan province. Methods: 434 HCV chronic infectious patients and 444 healthy individuals of Han Chinese population in Yunnan province were recruited for this study. Three single nucleotide polymorphisms (SNPs) of SNP-rs17824933, SNP-rs12360861 and SNP-rs11230563 of CD6 gene were determined by real-time TaqMan polymerase chain reaction and the haplotypes were constructed. Then evaluating the association correlation of these SNPs and haplotypes with HCV chronic infection. Results: The comparison of frequencies of allele and genotype of both groups of SNP-rs17824933 (C>G) , SNP-rs12360861 (G>A) and SNP-rs11230563 (C>T) showed that differences were not statistically significant (P>0.05). The frequency of haplotypes constructed by SNP-rs17824933 (C>G), SNP-rs12360861 (G>A) and SNP-rs11230563 (C>T) showed no significant difference (P>0.05). Conclusion: SNP-rs17824933 (C>G), SNP-rs12360861 (G>A) and SNP-rs11230563 (C>T) in the CD6 were not associated with HCV chronic infection in the Han population in Yunnan province.

[Key words]hepatitis C，chronic; polymorphism,single nucleotide; gene,CD6; Yunnan

*[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81160197); 吳階平醫(yī)學(xué)基金(320.6750.13395)

[中圖分類號(hào)]R512.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1000-2707(2016)05-0527-05

DOI:10.19367/j.cnki.1000-2707.2016.05.008

**通信作者 E-mail:shili.imb@gmail.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-05-13網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160513.2015.006.html