重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)短暫性缺氧新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

張梅梅，閆方方，蔣　超，孟　顏

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院兒童康復(fù)醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052

重組人促紅細(xì)胞生成素對(duì)短暫性缺氧新生大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

張梅梅△，閆方方，蔣超，孟顏

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院兒童康復(fù)醫(yī)學(xué)科 鄭州 450052

△女，1960年9月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向：小兒神經(jīng)病學(xué)，E-mail：mmzhang@zzu.edu.cn

關(guān)鍵詞促紅細(xì)胞生成素；缺氧缺血性腦??；新生大鼠；神經(jīng)保護(hù)作用

摘要目的：探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦病(HIE)的神經(jīng)保護(hù)作用。方法：將7日齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、單純?nèi)毖踅M和治療組。對(duì)照組不做缺氧處理，治療組先建立短暫性腦缺氧大鼠模型，后經(jīng)腹腔注射法給予rhEPO 治療，對(duì)照組和單純?nèi)毖踅M于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。采用干-濕重法測(cè)量腦組織含水量，尼氏染色觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化，Western bolt檢測(cè)海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-3、Bcl-2、Bax的表達(dá)情況。Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的神經(jīng)行為學(xué)變化。結(jié)果：與對(duì)照組相比，單純?nèi)毖踅M大鼠腦組織含水量增加，海馬CA1區(qū)退行變性神經(jīng)元數(shù)目增多(P<0.001)，細(xì)胞核固縮、深染明顯；cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax表達(dá)增加(P<0.001)。治療組與單純?nèi)毖踅M相比，腦組織含水量及海馬CA1區(qū)變性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，cleaved-Caspase-3、Bax表達(dá)減少而Bcl-2表達(dá)增加(P<0.05)。單純?nèi)毖踅M大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力較對(duì)照組明顯下降，而治療組的學(xué)習(xí)記憶能力較單純?nèi)毖踅M有顯著改善(P<0.001)。結(jié)論：rhEPO對(duì)HIE新生大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠減輕急性期腦水腫及海馬神經(jīng)元損傷，改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒期最常見的腦病，其病情重、病死率高，并可導(dǎo)致永久性神經(jīng)功能缺陷，已成為嚴(yán)重危害新生兒健康的重要因素[1]。亞低溫治療是目前惟一有效的臨床治療方法，但其遠(yuǎn)期神經(jīng)保護(hù)效果并不明顯，因此神經(jīng)保護(hù)療法仍為目前研究的熱點(diǎn)[2]。促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)的神經(jīng)保護(hù)作用已在腦損傷模型得到證實(shí)[3]，但其對(duì)HIE的神經(jīng)保護(hù)作用鮮有報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)旨在探討EPO對(duì)HIE的神經(jīng)保護(hù)作用，為臨床EPO的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1對(duì)象與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與藥品健康雄性7日齡SD大鼠120只，清潔級(jí)，體重10～13 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；在光照、黑暗12 h交替、恒溫恒濕環(huán)境中由母鼠自由喂養(yǎng)。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinant human erythropoietin，rhEPO)(沈陽(yáng)三生制藥有限公司)，兔抗鼠cleaved-Caspase-3、 Bcl-2、Bax及GAPDH抗體(美國(guó)加州圣克魯茲生物技術(shù)公司)，羊抗兔辣根過氧化物酶二抗、Western bolt試劑盒(上海生工生物工程有限公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒及超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司)，甲酚紫染色液(德國(guó)Sigma生物技術(shù)公司)，其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2模型建立及實(shí)驗(yàn)分組參照Samaiya等[4]的方法建立新生大鼠窒息模型，具體如下：將7 日齡SD大鼠置于37 ℃恒溫密閉缺氧裝置中，以2.5 L/min的流量從進(jìn)氣口持續(xù)輸入100%氮?dú)?0 min，然后將大鼠置于常氧環(huán)境中恢復(fù)至蘇醒后送回母鼠身邊喂養(yǎng)。按隨機(jī)數(shù)表法將建模成功大鼠隨機(jī)分為單純?nèi)毖踅M(n=40)、治療組(n=40)，另設(shè)對(duì)照組(n=40)不給予缺氧處理。治療組于缺氧后0、24和48 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別經(jīng)腹腔注射rhEPO 5 000 U/kg，對(duì)照組和單純?nèi)毖踅M于相同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。

1.33組大鼠腦組織含水量測(cè)定缺氧后48及72 h，每組隨機(jī)選取8只大鼠，斷頭取腦后去除腦干和小腦，用靈敏度為0.001 g的數(shù)字天平測(cè)量其濕重，后置于58 ℃烤箱中烤至恒重，用腦含水量公式計(jì)算腦組織含水量[5]：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.43組大鼠海馬CA1區(qū)退行變性神經(jīng)元數(shù)目的尼氏染色法檢測(cè)缺氧后第7 天，每組取6只大鼠灌注取腦，將腦組織修塊后置于40 g/L多聚甲醛固定液中4 ℃過夜；梯度蔗糖脫水，冰凍切片機(jī)制備包含海馬組織的20 μm腦組織冠狀切片。切片經(jīng)干燥、水洗后，置于焦油紫染色液中37 ℃染色10 min，后行分化、脫水、透明、封片等處理，于光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)變化。每只大鼠挑選3張腦片，每張腦片挑選3個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)退行變性神經(jīng)元數(shù)目并計(jì)算其百分比。

1.63組大鼠行為學(xué)檢測(cè)術(shù)后4周，每組取12只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。①參考記憶實(shí)驗(yàn)：共4 d，每d每只大鼠進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)讓大鼠分別從不同象限面朝池壁入水，大鼠找到隱藏平臺(tái)所用時(shí)間為逃避潛伏期，如果大鼠在60 s內(nèi)未找到平臺(tái)，則逃避潛伏期記錄為60 s；每輪實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，允許大鼠在平臺(tái)停留10 s；每?jī)纱螌?shí)驗(yàn)間隔為30 min。②探索實(shí)驗(yàn)：于實(shí)驗(yàn)第5天撤走平臺(tái)，隨機(jī)挑選一個(gè)入水點(diǎn)入水，觀察大鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)的次數(shù)。在上述2個(gè)實(shí)驗(yàn)中，大鼠的游泳速度被記錄，作為評(píng)判大鼠運(yùn)動(dòng)能力的基線。數(shù)據(jù)由Morris水迷宮自動(dòng)監(jiān)視系統(tǒng)生成。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠腦組織含水量、海馬CA1區(qū)退行變性神經(jīng)元數(shù)目、海馬組織中cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)的差異，應(yīng)用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析比較3組大鼠行為學(xué)的變化，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)3組大鼠腦組織含水量比較見表1 。

表1　缺氧后不同時(shí)間點(diǎn)

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與單純?nèi)毖踅M相比，P<0.05。

2.23組大鼠海馬CA1區(qū)退行變性神經(jīng)元數(shù)目尼氏染色結(jié)果見圖1。對(duì)照組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，核固縮少見；單純?nèi)毖踅M細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)異常，核固縮、深染明顯，神經(jīng)細(xì)胞變性嚴(yán)重；治療組海馬CA1區(qū)細(xì)胞核固縮、深染情況較單純?nèi)毖踅M顯著改善。單純?nèi)毖踅M海馬CA1區(qū)變性神經(jīng)元所占百分比(56.32%±5.27%)較對(duì)照組(6.97%±1.04%)明顯增加，治療組變性神經(jīng)元所占百分比(25.20%±3.05%)較單純?nèi)毖踅M顯著減少(F=293.626，P<0.001)。

A：對(duì)照組；B：?jiǎn)渭內(nèi)毖踅M；C:治療組。圖1　各組大鼠海馬CA1區(qū)尼氏染色結(jié)果(×400)

2.33組大鼠海馬組織中cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)見圖2、表2。

圖2　3組大鼠海馬組織中cleaved-Caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表達(dá)

組別nclaved-Caspase-3Bcl-2BaxBcl-2/Bax對(duì)照組60.097±0.0401.440±0.0790.505±0.0923.800±0.898單純?nèi)毖踅M61.310±0.079*3.374±0.225*4.631±0.786*0.746±0.135*治療組60.340±0.076#5.680±0.256#0.960±0.043#6.418±0.466#F525.748663.72137.906139.283P<0.001<0.001<0.001<0.001

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與單純?nèi)毖踅M相比，P<0.05。

2.43組大鼠行為學(xué)檢測(cè)結(jié)果見表3、4。與對(duì)照

組相比，單純?nèi)毖踅M的逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，平臺(tái)象限停留時(shí)間及穿越原始平臺(tái)次數(shù)減少，表現(xiàn)出顯著的認(rèn)知功能缺損；而與單純?nèi)毖踅M相比，治療組的逃避潛伏期明顯縮短，平臺(tái)象限停留時(shí)間及穿越原始平臺(tái)次數(shù)增加，認(rèn)知功能明顯改善。各組間游泳速度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3　Morris水迷宮

逃避潛伏期：F組間=205.795，P<0.001；F時(shí)間=279.989，P<0.001；F交互=3.653，P=0.003。*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與單純?nèi)毖踅M相比，P<0.05。游泳速度：F組間=1.170，P=0.323；F時(shí)間=2.925，P=0.097；F交互=0.180，P=0.836。

表4　Morris水迷宮探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果

*：與對(duì)照組相比，P<0.05；#：與單純?nèi)毖踅M相比，P<0.05。

3討論

HIE的發(fā)病率及死亡率高，其中約25%的存活患兒可產(chǎn)生智力障礙、癲癇、腦性癱瘓等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥[2]。EPO是一種活性糖蛋白，因其促紅細(xì)胞生成作用被應(yīng)用于貧血的治療。近二十年來，EPO的非造血作用逐漸被闡明[3,6-7]。研究[8-9]表明，EPO受體在皮質(zhì)、海馬等腦組織、膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)，且表達(dá)量受缺氧刺激調(diào)控。

EPO的神經(jīng)保護(hù)作用雖已在腦損傷模型中得到證實(shí)[10-11]，但仍缺乏EPO對(duì)于HIE保護(hù)作用的研究。故作者選用Samaiya等[4]的方法，造成新生大鼠全腦彌漫性損傷，模擬臨床HIE的病理變化過程，探究EPO的神經(jīng)保護(hù)作用。

高劑量EPO全身應(yīng)用可通過未成熟及缺氧損傷腦組織的血腦屏障發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，該實(shí)驗(yàn)采用一種有效的給藥方法[12]，即高劑量rhEPO(5 000 U/kg)連續(xù)3 d腹腔給藥，以提高通過血腦屏障的EPO含量。腦組織含水量測(cè)定結(jié)果證實(shí)rhEPO應(yīng)用能顯著減輕缺氧后急性期腦水腫。

HIE的主要病理改變?yōu)槿毖踉斐傻募?、慢性腦損傷，故該實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)缺氧敏感且與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)的海馬作為研究對(duì)象。尼氏染色結(jié)果顯示rhEPO能夠減輕缺氧對(duì)神經(jīng)元造成的損傷。Morris水迷宮結(jié)果表明rhEPO治療可明顯改善后期大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2和Bax的比值是決定細(xì)胞存亡的關(guān)鍵。半胱天冬酶家族(Caspases)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，其中Caspase-3是凋亡執(zhí)行者中最關(guān)鍵的蛋白酶，而Caspase-3的激活是Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的必經(jīng)步驟[13-14]。該研究通過Western blot檢測(cè)表明：缺氧處理能夠增加促凋亡蛋白的表達(dá)；而rhEPO干預(yù)后，抗凋亡蛋白表達(dá)顯著增加而促凋亡蛋白表達(dá)減少，從蛋白水平證明了rhEPO具有一定的抗凋亡作用。

總之，該實(shí)驗(yàn)通過對(duì)缺氧損傷急性期腦組織含水量、病理學(xué)改變、凋亡相關(guān)蛋白及后期行為學(xué)表現(xiàn)的研究，證實(shí)了EPO的神經(jīng)保護(hù)作用，為EPO神經(jīng)保護(hù)研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而有關(guān)合適的臨床給藥途徑、給藥劑量及全身大劑量應(yīng)用后的并發(fā)癥等問題仍有待進(jìn)一步探究。

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(2015-10-12收稿責(zé)任編輯趙秋民)

Neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin for transient cerebral hypoxia neonatal rats

ZHANGMeimei，YANFangfang，JIANGChao，MENGYan

DepartmentofPediatricNeurology，theFifthAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

Key wordserythropoietin；hypoxic-ischemia encephalopathy；neonatal rat；neuroprotective effect

AbstractAim: To explore the neuroprotective effect of recombinant human erythropoietin (rhEPO) for hypoxic-ischemic encephalopathy(HIE) in neonatal rats.Methods: Seven-day-old SD neonatal rats were randomly allocated into three groups: control group, anoxia group and rhEPO treatment group. The control group did not undergo anoxia. After the establishment of anoxia model, the rhEPO treatment group received rhEPO by intraperitoneal injection. Neonatal rats in control group and anoxia group received the treatment with the same volume of normal saline at the same time point. Brain water content(BWC) was estimated by dry-wet method；morphological changes in neurons of hippocampus CA1 area were observed by Nissl staining；apoptosis-related proteins such as cleaved-Caspase-3, Bcl-2 and Bax were measured by Western bolt. Neurological behavior was assessed by Morris water maze test(MWM).Results: Compared with control group, the BWC as well as the number of denatured neurons of hippocampus CA1 area in anoxia group was significantly increased(P<0.001); the nucleus pycnosis and hyperchromasia were evidently seen. In addition, the expressions of cleaved-Caspase-3, Bcl-2 and Bax in anoxia group were significantly increased compared with those of control group(P<0.001). Compared with anoxia group, the BWC, the number of denatured neurons of hippocampus CA1 area and expressions of cleaved-Caspase-3 and Bax in rhEPO treatment group were significantly decreased, while the expression of Bcl-2 was significantly increased (P<0.05). The ability of learning and memory in anoxia group was significantly decreased compared with control group, while the ability of learning and memory in rhEPO treatment group was significantly improved compared with anoxia group(P<0.001).Conclusion: RhEPO has neuroprotective effect by reducing acute brain edema, alleviating injury of neurons in hippocampus and improving the neurological behavior of neonatal rats with HIE.

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.03.025

中圖分類號(hào)R722