產(chǎn)纖維素酶真菌菌株的分離篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

魏姣，萬(wàn)學(xué)瑞，吳潤(rùn)，暢通，馬亞茹，劉磊，張小麗，張?zhí)炝?，楊?rùn)霞，賈曉蕊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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產(chǎn)纖維素酶真菌菌株的分離篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

魏姣，萬(wàn)學(xué)瑞，吳潤(rùn)，暢通，馬亞茹，劉磊，張小麗，張?zhí)炝?，楊?rùn)霞，賈曉蕊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 由于真菌的纖維素酶系較全，且可分泌至胞外，易分離，所以試驗(yàn)致力于篩選高產(chǎn)纖維素酶真菌菌株.【方法】 利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)法、剛果紅染色法、纖維素酶活性測(cè)定法從樣品中分離篩選出產(chǎn)纖維素酶菌株，同時(shí)結(jié)合菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察和ITS序列同源性分析進(jìn)行鑒定.【結(jié)果】 通過(guò)初篩，篩選出15株Hc值較大的產(chǎn)纖維素酶真菌菌株，再經(jīng)過(guò)液體發(fā)酵復(fù)測(cè)羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活，篩選出一株產(chǎn)纖維素酶活最高的菌株B-2-3，經(jīng)鑒定B-2-3為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)，其羧甲基纖維素酶活為2 341.76 U/mL，濾紙酶活為398.18 U/mL.經(jīng)過(guò)產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定其最適產(chǎn)酶條件為溫度25 ℃、接種量4 μL、蛋白胨0.5～0.6 g/L、CMC-Na 0.3～0.35 g/L、pH 6.5.【結(jié)論】 篩選出一株產(chǎn)纖維素酶活較高的煙曲霉菌株B-2-3.

關(guān)鍵詞：纖維素酶；篩選；鑒定；煙曲霉

能源短缺、糧食匱乏以及環(huán)境污染等許多與人類(lèi)生存息息相關(guān)的問(wèn)題逐漸成為國(guó)內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)，為保證人類(lèi)社會(huì)的安定繁榮，促進(jìn)可持續(xù)發(fā)展，通過(guò)新的途徑尋求可替代資源以緩解能源和環(huán)境等問(wèn)題已刻不容緩[1].纖維素是木質(zhì)纖維中含量最高的組分，也是全球最大的可再生有機(jī)物資源[2]，我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，纖維素資源更是取之不盡，然而纖維素本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以分解，這給纖維素的利用帶來(lái)了極大地阻礙.高活力的纖維素酶可以很好地將纖維素分解為可溶性的單分子葡萄糖，可作為動(dòng)物飼料添加劑，或進(jìn)一步通過(guò)各種途徑轉(zhuǎn)化成可被人類(lèi)利用的生物燃料乙醇并逐漸代替化石燃料.目前，世界各國(guó)雖已篩選分離出一定數(shù)量的產(chǎn)纖維素酶菌株，并被廣泛用于食品、飼料、制藥、紡織品、衣物、紙漿和造紙工業(yè)[3]，但高產(chǎn)纖維素酶菌株較少、酶活較低等因素極大限制了纖維素工業(yè)化利用的發(fā)展，造成資源浪費(fèi).因此，選育高產(chǎn)纖維素酶菌種是關(guān)鍵所在[4-6]，進(jìn)一步對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行合理優(yōu)化，探究產(chǎn)纖維素酶的最佳條件以用于工業(yè)化生產(chǎn)具有極大的現(xiàn)實(shí)意義.

纖維素酶是可降解纖維素的一類(lèi)復(fù)雜酶系的總稱(chēng)，自然界中很多真菌都能分泌纖維素酶.由于真菌的纖維素酶系較全，且可分泌至胞外，易分離，因此本研究著重從自然界中分離篩選高產(chǎn)纖維素酶真菌菌株，探索選育纖維素酶高產(chǎn)真菌的有效途徑，對(duì)篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定與分子生物學(xué)鑒定以確定其種屬，并通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)酶條件，為將來(lái)更有效地利用產(chǎn)酶菌株，篩選表達(dá)優(yōu)良纖維素酶基因以及構(gòu)建高酶活工程菌奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)樣品纖維素分解菌分離材料采自蘭州市安寧區(qū)黃家灘附近的腐敗植物、秸稈、碎木屑及牛羊糞、枯枝落葉、土壤等共35份.

1.1.2培養(yǎng)基羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基、復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基及馬鈴薯斜面培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基、真菌增值培養(yǎng)基，按文獻(xiàn)[7]所述配制.

1.1.3試劑及藥品羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、碳酸鈣(CaCO3)、碳酸鈉(Na2CO3)、氯化銨(NH4Cl)、硝酸銨(NH4NO3)、硫酸銨[(NH4)2SO4]、尿素、瓊脂糖、葡萄糖、三氯甲烷、氯仿、異戊醇、異丙醇、RNaseA、無(wú)水乙醇、檸檬酸、檸檬酸鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭唤湍柑崛∥?Yeast extract)、胰蛋白胨(Tryptone)、瓊脂粉(Agar)均為OXOID公司產(chǎn)品；真菌DNA提取試劑盒、DNA DL2000 Marker、2×PCR Master Mix、IPTG(異丙基硫代-β-半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷)、氨芐青霉素(Amp)購(gòu)自上海Invitrogen公司.

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)纖維素酶菌株分離與初篩參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶菌株的分離篩選，挑選羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上水解圈與菌落直徑比值(Hc)較大者作為纖維素酶產(chǎn)生菌初選菌株.操作流程：采樣→富集培養(yǎng)→劃線分離→CMC剛果紅平板初篩→初選目的菌株.

1.2.1.1樣品處理準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品25 g，加入到一個(gè)盛有225 mL無(wú)菌生理鹽水帶有玻璃珠的三角瓶中，將樣品充分打散混勻，于37 ℃恒溫?fù)u床搖動(dòng)2 d備用.

1.2.1.2菌株分離和初篩①用無(wú)菌生理鹽水稀釋樣品溶液，取10-1、10-2、10-33個(gè)稀釋度.②將配制好的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基滅菌后乘熱倒入平皿中，培養(yǎng)基厚度約0.5 cm放至培養(yǎng)基冷卻凝固.③取稀釋度為10-2和10-3的樣液0.1 mL涂布到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上.涂布均勻，待培養(yǎng)基上水分稍干，就將培養(yǎng)基倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)4～5 d.④選擇一些生長(zhǎng)旺盛的菌落，在初篩培養(yǎng)基上劃線分離，得到純培養(yǎng)，再將純培養(yǎng)后的單個(gè)菌落點(diǎn)種到初篩培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)4 d.將點(diǎn)種生長(zhǎng)的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，做短期保存.⑤用配制好的1 mg/mL的剛果紅染色液染色點(diǎn)種菌株30 min，棄去染液.再用1 mol/mL NaCl剛果紅脫色液脫色30 min，棄去脫色液，觀察.若菌株產(chǎn)生纖維素酶，就會(huì)在菌落四周出現(xiàn)清晰的透明水解圈，依據(jù)透明水解圈的直徑與菌落直徑的比值(Hc)大小選擇產(chǎn)纖維素酶活性較高的菌株.

1.2.2產(chǎn)纖維素酶菌株的羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活測(cè)定及其復(fù)篩參考文獻(xiàn)[9]的方法，進(jìn)行分離菌株的羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase activity，CMCA)及濾紙酶活(filter paper enzyme activity，F(xiàn)PA)測(cè)定.將初選菌株接種于復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基中經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)酶后，測(cè)其粗酶液的酶活，測(cè)3次取平均值，以酶活值為復(fù)篩標(biāo)準(zhǔn)，篩選出CMCA和FPA同時(shí)較高的菌株.

1.2.2.1羧甲基纖維素酶活測(cè)定取0.5 mL粗酶液，加1 mL CMC-Na檸檬酸緩沖液，混勻后，于50 ℃水浴30 min，然后加入DNS顯色液3 mL，沸水浴10 min，冷卻，540 nm處測(cè)吸光度.同時(shí)使用100 ℃煮沸10 min后失活的酶液做對(duì)照，其他步驟相同.

1.2.2.2濾紙酶活測(cè)定取0.5 mL稀釋的粗酶液，加入pH4.8 0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液1 mL，加入一條濾紙(1 cm×6 cm)于帶塞試管中，50 ℃水浴1 h，然后加入DNS顯色液3 mL，沸水浴10 min顯色，冷卻至室溫，加蒸餾水定容至10 mL，混勻，靜置20 min，540 nm處測(cè)吸光度.同時(shí)用100 ℃煮沸10 min后失活的酶液做對(duì)照，其他步驟相同.

1.2.3產(chǎn)纖維素酶菌株的形態(tài)學(xué)鑒定將復(fù)篩出的產(chǎn)纖維素酶菌株劃線接種于馬鈴薯平板培養(yǎng)基，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)2～3 d后觀察菌落形態(tài)，鏡檢菌絲及分生孢子梗、孢子鏈、孢子形態(tài)，并結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》[10]對(duì)復(fù)篩產(chǎn)纖維素酶菌株進(jìn)行初步鑒定.

1.2.4產(chǎn)纖維素酶菌株的ITS區(qū)序列鑒定

1.2.4.1基因組DNA的提取應(yīng)用真菌DNA提取試劑盒提取酶源菌株基因組DNA，操作步驟詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明.

1.2.4.2ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增與測(cè)序參考文獻(xiàn)[11]中真菌ITS區(qū)序列擴(kuò)增通用引物，進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶分離菌株ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增.正向引物 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，反向引物 5′-TCCTCCGC- TTATTGATATGC-3′，引物由上海Invitrogen公司合成.

擴(kuò)增體系：上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板DNA 2 μL、rTAP預(yù)混酶25 μL、滅菌ddH2O 19 μL，總體積50 μL.反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃ 1 min、51 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)及凝膠回收試劑盒純化，克隆到pMD18-T vector，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，劃線接種在含有氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)的LB瓊脂平板上培養(yǎng)后，挑選白色菌落并接種在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng).將篩選的疑似陽(yáng)性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序.

1.2.4.3ITS序列分析與菌株鑒定將分離菌株的ITS區(qū)序列測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析，利用BLAST軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索相關(guān)菌株的ITS相應(yīng)序列，進(jìn)行分離菌株種的鑒定.

1.2.5產(chǎn)纖維素酶菌株的產(chǎn)酶條件優(yōu)化分析產(chǎn)纖維素酶真菌菌株液態(tài)發(fā)酵條件下產(chǎn)纖維素酶的影響因素，應(yīng)用復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基，保持培養(yǎng)基中其他成分不變，在培養(yǎng)溫度為25 ℃的條件下，比較碳源(CMC-Na、葡萄糖、麩皮、CaCO3、Na2CO3)、氮源[NH4Cl、NH4NO3、尿素、蛋白胨、(NH4)2SO4]、pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)、接種量(1、2、3、4、5 μL)及在保持培養(yǎng)基中其他成分不變，改變培養(yǎng)溫度(15、25、35、45、55 ℃)這5個(gè)單因素，篩選出影響分離菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳單因素.以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)，探究碳源、氮源和pH值3種因素對(duì)羧甲基纖維素酶活和濾紙酶活的影響，探究最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件組合.

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)纖維素酶菌株的分離與初篩

將樣品稀釋液依次涂布于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)至第7天，用剛果紅染色法觀察水解圈，有200多個(gè)菌落周?chē)a(chǎn)生了清晰水解圈，菌落有透明、粉紅、乳白、墨綠、青綠、灰綠、黃綠、黃褐、桔黃等.挑選水解圈與菌落直徑比值Hc較大的纖維素酶產(chǎn)生菌為初選菌株.經(jīng)形態(tài)觀察，初選菌株以真菌為主，還有較多細(xì)菌和個(gè)別放線菌，真菌中以霉菌為主(圖1).

由于CMC屬于大分子多糖衍生物，纖維素分解菌能分泌纖維素酶而將CMC平板培養(yǎng)基中的纖維素降解成小分子的低聚糖及纖維二糖、葡萄糖等.剛果紅能將CMC染成紅色，但對(duì)CMC降解后產(chǎn)生的小分子低聚糖類(lèi)物質(zhì)無(wú)染色作用，因此在產(chǎn)生CMC酶的菌落周?chē)鷷?huì)形成清晰的水解圈.剛果紅纖維素平板培養(yǎng)是較好的分離篩選培養(yǎng)基，其水解圈直徑/菌落比值大致反映酶活力高低.

圖1　菌株B-2-3在CMC-Na平板上產(chǎn)生的水解圈Fig.1　Hydrolysis circle on CMC-Na flat of strain B-2-3

2.2分離菌株濾紙酶活和羧甲基纖維素酶活的測(cè)定

經(jīng)初選菌株的濾紙酶活和羧甲基纖維素酶活測(cè)定，復(fù)篩出濾紙酶活和羧甲基纖維素酶活同時(shí)較高的分離菌15株.由表1可知，菌株B-2-3酶活最高，其羧甲基纖維素酶活為2 341.76 U/mL、濾紙酶活為398.18 U/mL.羧甲基纖維素酶活主要代表了外切-β-1-4葡聚糖苷酶和內(nèi)切酶的活力總和，濾紙酶活所反映的是纖維素酶的總活力，二者酶活的高低基本可以反應(yīng)出一個(gè)菌株產(chǎn)纖維素酶能力的大小.

表1　纖維素酶產(chǎn)生菌酶活

同列數(shù)字肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05).

2.3產(chǎn)纖維素酶菌株的形態(tài)學(xué)特征

將菌株B-2-3接種于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落生長(zhǎng)非?？欤藁?，開(kāi)始為白色，2～3 d后轉(zhuǎn)為綠色，數(shù)日后變?yōu)橹虚g深綠色，菌落邊緣白色，呈粉末狀(圖2).初期，菌絲體產(chǎn)生大量的分生孢子梗.然后頂端膨大成為頂囊，一般呈球形，頂囊表面長(zhǎng)滿一層或兩層輻射狀小梗(初生小梗與次生小梗)，最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形.然后頂端膨大成為頂囊，一般呈球形，頂囊表面長(zhǎng)滿一層或兩層輻射狀小梗(初生小梗與次生小梗)，最上層小梗瓶狀，頂端著生成串的球形分生孢子(圖3).據(jù)菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果，同時(shí)對(duì)比《真菌鑒手冊(cè)》[10]，初步鑒定此菌株為真菌門(mén)、曲霉屬(Aspergillus).

2.4產(chǎn)纖維素酶菌株的ITS區(qū)序列鑒定

2.4.1ITS區(qū)序列的PCR擴(kuò)增經(jīng)菌株B-2-3基因組DNA的PCR擴(kuò)增，獲得到大約650 bp的擴(kuò)增條帶，與預(yù)期ITS區(qū)序列擴(kuò)增片段大小相符(圖4).

圖2　菌株B-2-3的菌落形態(tài)Fig.2　Colony morphology of the strain B-2-3

圖3　菌株B-2-3的菌絲形態(tài)Fig.3　Mycelium morphology of the strain B-2-3

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2 000；1：ITS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.圖4　 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4　The results of PCR amplification

2.4.2ITS序列分析與菌株鑒定將菌株B-2-3的ITS區(qū)序列擴(kuò)增片段測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析及相關(guān)菌株的ITS序列搜索，其與煙曲霉(Aspergillusfumigatus)登錄號(hào)為KF841561.1菌株的ITS序列相似度為99%，因此鑒定菌株B-2-3為曲霉屬的煙曲霉.

分析真菌ITS區(qū)序列作為種屬鑒定的依據(jù)，主要是因?yàn)镮TS區(qū)不含成熟核糖體，承受的選擇性壓力較小，可以允許更多的變異，而且ITS區(qū)片段較小，易于分析.ITS片段進(jìn)化速率是18S rDNA的10倍.因此，ITS區(qū)更適合對(duì)真菌種屬鑒定的研究.

2.5菌株B-2-3的產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1碳源對(duì)酶活的影響 如圖5所示，在其他條件恒定的情況下，菌株B-2-3以CMC-Na為碳源時(shí)的羧甲基纖維素酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他碳源時(shí)的酶活，濾紙酶活也較高，其次是麩皮和葡萄糖，Na2CO3作用最差，表明以CMC-Na為碳源時(shí)菌株B-2-3產(chǎn)酶性能最高，可作為最佳碳源考慮.纖維素酶是一種誘導(dǎo)酶，碳源是纖維素酶合成的主要誘導(dǎo)因素.CMC-Na是可溶性碳源，沒(méi)有結(jié)晶區(qū)，發(fā)酵期間更易被菌株分解、利用，誘導(dǎo)期相對(duì)較短，纖維素酶對(duì)其分解也更為容易，所以能獲得相對(duì)較大的酶活.

圖5　 碳源對(duì)菌株B-2-3酶活的影響Fig.5　Effects of carbon sources on enzyme activity of strain B-2-3

2.5.2氮源對(duì)酶活的影響如圖6所示，在其他條件恒定的情況下，菌株B-2-3產(chǎn)酶最佳氮源是蛋白胨，相比其他氮源更符合該菌株產(chǎn)酶性能發(fā)揮的營(yíng)養(yǎng)需求.這可能是由于蛋白胨作為有機(jī)氮源，營(yíng)養(yǎng)豐富，因而微生物在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中常表現(xiàn)出生長(zhǎng)旺盛、菌體濃度增長(zhǎng)迅速等特點(diǎn).

2.5.3pH對(duì)酶活的影響如圖7所示，在其他條件恒定的情況下，菌株B-2-3在pH6.5時(shí)的纖維素酶活遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他pH時(shí)的酶活，pH高于6.5以后酶活急劇降低，在pH 6.5時(shí)濾紙酶活也最高，表明初始培養(yǎng)基合適的pH值有利于真菌發(fā)酵產(chǎn)酶，菌株B-2-3的最適產(chǎn)酶初始培養(yǎng)基pH為6.5，與歐陽(yáng)蒲月等[12]篩選出來(lái)的煙曲霉最適pH差不多.微生物要進(jìn)行正常的生長(zhǎng)代謝，就要求培養(yǎng)基有適宜的pH值，但由于他們的代謝活動(dòng)又會(huì)改變培養(yǎng)基的pH值.所以在培養(yǎng)基的配制過(guò)程中，要適當(dāng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其符合微生物生長(zhǎng)的同時(shí)，也要考慮到培養(yǎng)基的pH緩沖能力.

圖6　氮源對(duì)菌株B-2-3酶活的影響Fig.6　Effect of nitrogen sources on enzyme activity of strain B-2-3

圖7　pH對(duì)菌株B-2-3酶活的影響Fig.7　Effect of pH on enzyme activity of strain B-2-3

2.5.4接種量對(duì)酶活的影響如圖8所示，在其他條件恒定的情況下，接種量為4 μL時(shí)(即12%)，菌株B-2-3的纖維素酶活與濾紙酶活均達(dá)到最高，表明該菌株的產(chǎn)酶最佳接種量為12%(4 μL/33μL)時(shí)為最佳接種量.接種量的大小一般受限于生產(chǎn)菌株在發(fā)酵體系內(nèi)的生長(zhǎng)、代謝、繁殖的速度.接種量過(guò)大或者過(guò)小，均會(huì)影響發(fā)酵.過(guò)大會(huì)引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成；而且會(huì)過(guò)多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟(jì)；過(guò)小會(huì)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，降低酶活產(chǎn)生效率.根據(jù)實(shí)際需求，要在營(yíng)養(yǎng)物利用、菌體密度及代謝產(chǎn)物之間建立一個(gè)平衡.

圖8　接種量對(duì)菌株B-2-3酶活的影響Fig.8　Effect of inoculation amount on enzyme activity of strain B-2-3

2.5.5培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響如圖9所示，其他條件恒定的情況下，菌株B-2-3在溫度為25 ℃時(shí)的羧甲基纖維素酶活與濾紙酶活均達(dá)到最大值，超過(guò)25 ℃時(shí)羧甲基纖維素酶活迅速降低，而濾紙酶活變化較小，曲線比較平穩(wěn)，說(shuō)明B-2-3的最適發(fā)酵溫度均為25 ℃.溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖及其生理代謝有重要影響.在發(fā)酵過(guò)程中，溫度的影響主要表現(xiàn)在微生物生長(zhǎng)繁殖、代謝合成、發(fā)酵液理化性質(zhì)等方面.因此，在篩選纖維素酶菌株的培養(yǎng)過(guò)程中，要選擇合適的培養(yǎng)溫度，以已達(dá)到酶活最高的目的.

圖9　培養(yǎng)溫度對(duì)菌株B-2-3酶活的影響Fig.9　Effect of culture temperature on enzyme activity of strain B-2-3

2.5.6菌株B-2-3最佳產(chǎn)酶條件的正交試驗(yàn)由表2可知，對(duì)于煙曲霉菌株B-2-3而言，比較極差R，當(dāng)以羧甲基纖維素酶活作為判別標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，碳源、氮源和pH值3個(gè)影響因子的主次順序?yàn)镃>B>A，最佳組合為A1B3C1，即pH6.5、蛋白胨0.6 g/L、CMC-Na 0.3 g/L；當(dāng)以濾紙酶活作為判別標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，3個(gè)影響因子的主次順序?yàn)锽>A>C，最佳組合為A2B1C1，即蛋白胨0.5 g/L、CMC-Na 0.35 g/L、pH6.5.以上結(jié)果表明，不同的纖維素酶活性之間存在差異，對(duì)各自影響最大的因素是不完全相同的.從表3中可知，各影響因素對(duì)兩種酶活影響的差異顯著性.綜合分析可知，當(dāng)培養(yǎng)基含蛋白胨為0.5～0.6 g/L、CMC-Na 為0.3～0.35 g/L、pH6.5時(shí)為煙曲霉菌株B-2-3發(fā)酵產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)條件組合.

表2　菌株B-2-3產(chǎn)酶最佳培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)

表3　方差分析結(jié)果

3討論

在西北地區(qū)，由于氣候和氣溫、土壤、濕度等條件比較特殊，再加上有機(jī)質(zhì)豐富多樣，微生物的種類(lèi)很多，有利于分離篩選多種產(chǎn)纖維素酶菌株.本試驗(yàn)利用羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)法、剛果紅染色法、纖維素酶活性測(cè)定法篩選出產(chǎn)纖維素酶真菌菌株B-2-3，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察和ITS序列同源性分析，與煙曲霉(Aspergillusfumigatus)菌株(登錄號(hào)KF841561.1)ITS序列的相似度為99%，確定該菌株為曲霉屬的煙曲霉.微生物的代謝是由一系列的生化反應(yīng)組成，影響微生物生長(zhǎng)代謝的因素包括營(yíng)養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件，具體表現(xiàn)為培養(yǎng)基的組成、接種量、培養(yǎng)溫度、pH等.分析菌株B-2-3在復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基上的產(chǎn)纖維素酶的影響因素，比較碳源、氮源、接種量、培養(yǎng)溫度、pH等在單因素條件下對(duì)纖維素酶活的影響及通過(guò)L9(33)正交試驗(yàn)顯示，煙曲霉菌株B-2-3的最適產(chǎn)酶條件為溫度25 ℃、接種量4 μL、蛋白胨0.5～0.6 g/L、CMC-Na 0.3～0.35 g/L、pH 6.5.

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶，影響因素很多，培養(yǎng)基的成分和添加比例對(duì)微生物的生長(zhǎng)、代謝及產(chǎn)物積累都有很大的影響，因而，微生物培養(yǎng)基成分和配比的優(yōu)化極其重要.本試驗(yàn)篩選出來(lái)的煙曲霉菌株B-2-3，在產(chǎn)酶條件上和文獻(xiàn)中報(bào)道的已經(jīng)篩選出來(lái)的煙曲霉菌株的產(chǎn)酶條件在碳源、氮源、pH、培養(yǎng)溫度等方面都不太相同，如金偉等[13]從武漢市和廈門(mén)市周邊地區(qū)土壤中分離和篩選到一株產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的耐熱煙曲霉E4，該菌株的最佳產(chǎn)纖維素酶的基質(zhì)為稻草，其最適產(chǎn)酶pH值為5.0，最適產(chǎn)酶溫度為42 ℃，50 ℃搖瓶培養(yǎng)72 h時(shí)可達(dá)到產(chǎn)酶最高峰，其羧甲基纖維素酶(CMCase)活和濾紙酶(FPA)活分別達(dá)到3.5 U/mL和3.2 U/mL；歐陽(yáng)蒲月等[12]從廣州近郊腐爛樹(shù)葉中分離獲得一株纖維素降解能力較強(qiáng)的煙曲霉菌株OY-01，該菌株最適生長(zhǎng)溫度和pH分別為35 ℃和6.0～7.0，氮源為硫酸銨，體積分?jǐn)?shù)0.15%，培養(yǎng)48～60 h，其最高酶活達(dá)1.75 U/mL；封曄等[14]對(duì)煙曲霉FG10的產(chǎn)酶條件優(yōu)化得出，F(xiàn)G10的最適產(chǎn)酶條件為豆粕0.3 g/kg、pH4.8、35 ℃培養(yǎng)48 h；陳紅漫等[15]從溫泉熱源地中篩出一株煙曲霉菌株，其產(chǎn)酶最適初始pH6.5，最適反應(yīng)溫度65 ℃，碳、氮源分別為結(jié)晶纖維素、牛肉膏時(shí)有利于產(chǎn)酶.本試驗(yàn)篩選出來(lái)的煙曲霉菌株B-2-3除了與歐陽(yáng)蒲月等[12]，陳紅漫等[13]篩選出來(lái)的煙曲霉菌株在pH值上相似外，其他條件均不相同.推測(cè)可能是由于試驗(yàn)操作方法等方面存在區(qū)別或者菌株來(lái)源的不同造成的.本試驗(yàn)篩選出來(lái)的煙曲霉菌株B-2-3與以上菌株相比，產(chǎn)酶活力較高，如果再通過(guò)適當(dāng)改造[16]，使煙曲霉菌株B-2-3的酶活穩(wěn)定，同時(shí)使酶的產(chǎn)量提高和酶的活性增強(qiáng)，提高煙曲霉菌株的利用率，具有很好的研究意義及發(fā)展前景.

目前，國(guó)內(nèi)雖然有了大量篩選纖維素酶的研究，來(lái)自自然界中的土壤、水體、腐殖質(zhì)及生物體內(nèi)等環(huán)境條件下纖維素酶不斷被發(fā)掘，但迄今為止，我國(guó)仍未很好地解決規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶的難題.長(zhǎng)期以來(lái)，酶的產(chǎn)量、比活力低一直是制約纖維素酶實(shí)際應(yīng)用的一個(gè)重要原因.因此，不斷地篩選高產(chǎn)纖維素酶菌株，對(duì)纖維素資源的利用有著重要的意義.

4結(jié)論

本試驗(yàn)篩選出一株產(chǎn)纖維素酶真菌菌株B-2-3，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、顯微鏡觀察和ITS序列同源性分析，確定該菌株為曲霉屬的煙曲霉.通過(guò)產(chǎn)酶條件優(yōu)化得出，煙曲霉菌株B-2-3的最適產(chǎn)酶條件為溫度25 ℃、接種量4 μL、蛋白胨0.5～0.6 g/L、CMC-Na 0.3～0.35 g/L、pH6.5.試驗(yàn)為下一步進(jìn)行纖維素酶相關(guān)研究打下一定的基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)

[1]陳燕,王小芬,金偉,等.產(chǎn)纖維素酶霉菌的篩選及初步鑒定[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,30(3):6-8

[2]陸晨,陳介南,王義強(qiáng),等.一株產(chǎn)纖維素酶真菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(6):118-122

[3]Geng A L,Zou G,Yan X,et al.Expression and characterization of a novel metagenome-derived cellulase Exo2b and its application to improve cellulase activity in Trichoderma reesei[J].Appl Microbiol Biotechnol,2012,96(4):951-962

[4]李?lèi)?李世俊,薛橋麗,等.大圍山森林土壤中高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及鑒定[J].Innovadion and knowledge Transfer,2014,33(6):128-131

[5]武香玉,徐海燕,辛國(guó)芹,等.纖維素酶及其研究進(jìn)展[J].飼料博覽,2013(10):27-29

[6]胡格華,蘇香萍,潘虹,等.纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件的研究[J].三峽大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2013,35(4):100-102

[7]Wang D,Sun J,Yu H L,et al.Maximum saccharification of cellulose complex by an enzyme cocktail supplemented with cellulase from newly isolated Aspergillus fumigatus ECU0811[J].Appl Biochem Biotechnol,2012,166(1):176-186

[8]Xu C,Long M N,Wu X B,et al.Screening and characterization of the high-cellulase-producing strainAspergillusglaucusXC9[J].Frontiers of Biology in China，2006,1(1):35-40

[9]Nathan V K,Rani M E,Rathinasamy G,et al.Process optimization and production kinetics for cellulase production by Trichoderma viride VKF3[J].Archives of Disease in Childhood,2014,17(3):92-95

[10]金萍,徐爾尼,史立康,等.高產(chǎn)纖維素酶生產(chǎn)方法的研究[J].食品科技,2007(2):73-76

[11]燕勇,李衛(wèi)平,高雯潔,等.rDNA-ITS序列分析在真菌鑒定中的應(yīng)用[J].2008,18(10):1958-1961

[12]歐陽(yáng)蒲月,郭成栓,黃智璇,等.一株纖維素降解菌的分離,鑒定及產(chǎn)酶條件初步研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,9(18):3447-3450

[13]金偉,陳文靜,姚斌,等.一株產(chǎn)纖維素酶的耐熱煙曲霉篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].中國(guó)釀造,2012,31(6):61-64

[14]封曄,來(lái)航線,鄭真,等.高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及其產(chǎn)酶條件研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版,2007,35(10):133-138

[15]陳紅漫,孫玉輝,闞國(guó)仕,等.產(chǎn)耐熱纖維素酶菌株的分子鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2011,37(7):28-33

[16]唐嘉徽,楊富民,王曙陽(yáng),等.重離子輻照誘變黑曲霉產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(3):143-148

(責(zé)任編輯趙曉倩)

Isolation and screening of fungi strains producing cellulase and optimization of conditions for enzyme production

WEI Jiao，WAN Xue-rui，WU Run，CHANG Tong，MA Ya-ru，LIU Lei，ZHANG Xiao-li，ZHANG Tian-liang，YANG Run-xia，JIA Xiao-rui

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 Using fungi to screen fungal strains with high cellulases activity because it has large cellulase enzymes,can be secreted into the extracellular and easily be separated.【Method】 Sodium carboxymethyl cellulose culture,Congo red staining,cellulase activity assays were used to isolate and screen strains producing cellulose from samples,and identification was conducted combining with colony morphology,microscopic characteristics and ITS sequence homology analysis.【Result】 15 fungal strains producing cellulases with higher Hc value was screened,through liquid fermentation retest CMC activity and filter paper activity,screening a strain B-2-3 producing the highest cellulase activity,and it was identified as Aspergillus fumigatus with the CMC activity of 2 341.76 U/mL and filter paper activity of 398.18 U/mL.The optimum conditions for enzyme production were as follows:temperature of 25 ℃,inoculation of 4 μL,peptone of 0.5～0.6 g/L,CMC-Na of 0.3～0.35 g/L,pH of 6.5.【Conclusion】 Aspergillus strains B-2-3 was screened with higher production of cellulase activity.

Key words：cellulase;screening;identification;Aspergillus fumigatus

通信作者：吳潤(rùn)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué).E-mail：wurun@gsau.edu.cn

基金項(xiàng)目：甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(1204NKCA103)；甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)盛彤笙科技創(chuàng)新基金(GSAU-STS-1232)；甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(GNSW-2012-25).

收稿日期：2015-01-12；修回日期：2015-03-25

中圖分類(lèi)號(hào)：Q 556

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1003-4315(2016)02-0008-08

第一作者：魏姣(1989-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué).E-mail：306310799@qq.com