牛支原體武威株脂蛋白P48基因的克隆、原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位

胡國明，邢小勇，李娜，蘇煒德，溫峰琴，項(xiàng)海濤，胡永浩，包世俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州　730070)

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牛支原體武威株脂蛋白P48基因的克隆、原核表達(dá)及亞細(xì)胞定位

胡國明，邢小勇，李娜，蘇煒德，溫峰琴，項(xiàng)海濤，胡永浩，包世俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730070)

摘要：【目的】 驗(yàn)證牛支原體P48蛋白在細(xì)胞中的位置，并為后續(xù)功能的研究奠定基礎(chǔ).【方法】 運(yùn)用Overlap PCR擴(kuò)增獲得點(diǎn)突變后的牛支原體武威分離株P(guān)48基因，并將其克隆至pGEM-T Easy，將測序正確的質(zhì)?？寺≈帘磉_(dá)載體pET-28a中，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-P48，表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，并在IPTG誘導(dǎo)下成功獲得融合蛋白表達(dá)產(chǎn)物rMbP48，大小約為51 ku.重組蛋白純化后免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體.在分離牛支原體膜蛋白的基礎(chǔ)上應(yīng)用Western -blot及間接ELISA對P48蛋白在細(xì)胞中的分布進(jìn)行分析.【結(jié)果】P48蛋白主要存在于牛支原體的膜分離相.全菌免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)脂蛋白P48位于牛支原體的膜表面.【結(jié)論】 牛支原體P48蛋白是存在于牛支原體表面的一種具有免疫原性的脂蛋白.本研究為進(jìn)一步研究P48蛋白的生物學(xué)特性及建立高效的牛支原體診斷方法奠定了基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：牛支原體；P48；基因克??；原核表達(dá)；亞細(xì)胞定位

牛支原體(Mycoplasmabovis，Mb)是牛呼吸道疾病的重要病原體之一，于1961年被Hale等[1]從美國乳房炎病牛中首次分離，并于1976年證實(shí)其與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān).現(xiàn)已證實(shí)，牛支原體不僅可引起牛的肺炎、耳炎、流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎、奶牛乳房炎和生殖道炎癥等疾病，而且可與多殺性巴氏桿菌、牛呼吸道合胞體病毒、牛副流感病毒3型等病原微生物混合感染，加之目前尚無用于防治牛支原體感染的有效藥物，因此在所有牛呼吸系統(tǒng)病原感染中，牛支原體感染率居高不下[2-3].支原體感染羊主要會(huì)引起肺間質(zhì)增生性炎癥為特征的病理變化[4].近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展和牛群的大范圍遷移，牛支原體感染亦迅速擴(kuò)散和蔓延[5]，目前其感染已呈世界性分布.2008年，辛慶九等[6]首次從我國患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，之后在甘肅、貴州、重慶、內(nèi)蒙、青島等多個(gè)省市均出現(xiàn)牛支原體病例的報(bào)道[7]，給我國養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此，開展牛支原體相關(guān)的研究，將會(huì)為牛支原體感染的預(yù)防及控制奠定基礎(chǔ).

脂蛋白是一類由富含甘油三酯、固醇酯組成的疏水性內(nèi)核和由磷脂、蛋白質(zhì)、膽固醇等組成外殼的球狀微粒[8]，對于細(xì)胞外脂質(zhì)的包裝、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和代謝起重要作用.脂蛋白中的蛋白質(zhì)組分又被稱為載脂蛋白，主要參與脂質(zhì)的運(yùn)輸和代謝，具有免疫應(yīng)答、補(bǔ)體激活、蛋白酶抑制劑、炎癥反應(yīng)等功能[9].牛支原體脂蛋白在其定殖及激發(fā)免疫反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用.近年來，越來越多的牛支原體脂蛋白被證實(shí)與牛支原體對宿主細(xì)胞的粘附有關(guān)，例如Pmb67、P26抗原、P33蛋白、P81蛋白等[10-12].用兔抗無乳支原體P48抗血清檢測到在所有牛支原體中都存在一個(gè)特定的識別位點(diǎn)，證明P48蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上都比較保守[13]；無乳支原體P48蛋白在免疫應(yīng)答中扮演重要角色[14]，可以作為感染宿主的一個(gè)重要標(biāo)志來對支原體進(jìn)行診斷.牛支原體P48蛋白亦是牛支原體的一種脂蛋白成分，是牛支原體侵入牛機(jī)體后的特異性血清標(biāo)志，因此可將P48蛋白作為診斷牛支原體的一種特異性靶標(biāo)抗原[15]，但是由于相應(yīng)抗體獲取有一定難度，因此關(guān)于牛支原體P48蛋白及其他功能的研究目前還鮮有報(bào)道.

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

牛支原體武威分離株為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pET-28a(+)為甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室保存.

1.2試驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔購自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.3主要試劑

EXTaqDNA聚合酶、T4 DNA Ligase、限制性內(nèi)切酶BamHI與XhoIⅠ、DL2000Marker、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、TMB底物顯色液購自天根生化科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自北京凱瑞力楓科貿(mào)有限公司；支原體培養(yǎng)基購于青島海博生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品.

1.4引物的設(shè)計(jì)與合成

參照Genebank中牛支原體P48基因序列(登錄號：CP002513.1)，序列全長1 458 bp，編碼區(qū)總共1 407 bp，其中第86位、238位、255位、447位、461位氨基酸為編碼色氨酸的密碼子TGA，在大腸桿菌中為終止密碼子，因此設(shè)計(jì)5對引物對上述5個(gè)氨基酸進(jìn)行等義突變(TGA→TGG)，引物序列如表1所示，并委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成.

表1　引物序列

1.5牛支原體基因組的粗提

將牛支原體按10%接種于含10%馬血清、800 IU/mL青霉素的液體培養(yǎng)基內(nèi)，在5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)40 h后收集菌液，取1 mL菌液離心棄去上清，PBS懸浮洗滌3次，加入50 μL ddH2O煮沸10 min，12 000 r/min離心取上清即為粗提基因組.粗提物可直接用于PCR擴(kuò)增或置-20 ℃凍存?zhèn)溆?

1.6基因的擴(kuò)增

以粗提的牛支原體基因組為模板，用引物對F1和R2擴(kuò)增得到片段A；引物對F2和R3擴(kuò)增獲得片段B；引物對F3和R4擴(kuò)增獲得片段C；引物對F4和R5擴(kuò)增獲得片段D；引物對F5和R1擴(kuò)增獲得片段E；再以A、B、C、D、E為模板，F(xiàn)1和R1為引物擴(kuò)增得到P48基因全長.PCR反應(yīng)體系為(50 μL)：模板3 μL、上下游引物各1 μL、Mix 25 μL、ddH2O 20 μL.反應(yīng)條件見表2.

1.7序列測定及分析

將擴(kuò)增獲得的P48基因全長進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與牛支原體其他菌株序列及無乳支原體相關(guān)基因序列進(jìn)行同源性分析.

表2　PCR反應(yīng)條件

引物模板反應(yīng)條件產(chǎn)物F1+R2M.bovis基因組94℃5min,94℃1min,60℃45s,72℃1min,30×AF2+R3M.bovis基因組94℃5min,94℃1min,60℃45s,72℃1min,30×BF3+R4M.bovis基因組94℃5min,94℃1min,59℃45s,72℃1min,30×CF4+R5M.bovis基因組94℃5min,94℃1min,56℃45s,72℃1min,30×DF5+R1M.bovis基因組94℃5min,94℃1min,60℃45s,72℃1min,30×EF1+R1A+B+C+D+E94℃5min,94℃1min,60℃45s,72℃1min40s,30×全長

1.8原核表達(dá)載體的構(gòu)建

上述PCR產(chǎn)物回收，并用BamHI與XhoI對回收產(chǎn)物與原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a分別進(jìn)行酶切，取酶切后回收產(chǎn)物6 μL、載體2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、10×T4 DNA Buffer 1 μL，輕輕吹打混勻后于16 ℃過夜連接，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，陽性重組質(zhì)粒命名為pET-P48，并送金唯智生物有限公司進(jìn)行測序.

1.9重組蛋白的表達(dá)

將測序正確的重組質(zhì)粒pET-P48轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落過夜培養(yǎng)后按照1∶100比例轉(zhuǎn)接入200 mL 2YT(Kan+)培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)2～3 h至菌液D值(600 nm)達(dá)到0.4～0.6，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，26 ℃誘導(dǎo)6 h后，菌體經(jīng)超聲裂解后收集上清用His·Tag蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化，具體步驟見試劑盒說明書.取50 μL純化的重組蛋白與等量2×上樣緩沖液混勻沸水浴10 min后迅速置冰上冷卻2 min，然后12 000 r/min離心10 min，收集上清，取5 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳，首先在電壓60 V下進(jìn)行，待溴酚藍(lán)跑至分離膠界面時(shí)將電壓調(diào)至120 V，直到電泳結(jié)束.

1.10多抗制備

純化后的重組蛋白免疫新西蘭大白兔以制備多克隆抗體.首免劑量為800 μg/只，將稀釋好的抗原與等量弗氏完全佐劑混勻，充分乳化后多點(diǎn)注射.兩周后進(jìn)行二免，以400 μg/劑量，將抗原與等量弗氏不完全佐劑混勻，充分乳化后多點(diǎn)注射.此后間隔一周強(qiáng)化免疫一次，免疫劑量同第二次免疫.四免后第5天采血分離血清，并經(jīng)間接ELISA法檢測效價(jià)后，分別置-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.11牛支原體膜蛋白的提取

將牛支原體按10%接種到支原體液體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期， 12 000 r/min離心10 min，菌體沉淀用PBS懸浮洗滌3次后，用適量PBS懸浮菌體使之150倍濃縮，依次加入50 μL蛋白酶抑制劑及等量的2% Triton-114，混勻后4 ℃靜置30 min，37 ℃作用10 min后，12 000 r/min離心15 min，將上層水相(胞漿蛋白)和下層油相(膜蛋白)中分別移入干凈的離心管中，并分別加入3倍體積的預(yù)冷丙酮中，-20 ℃作用4 h后，12 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄上清，沉淀自然風(fēng)干后溶解于等量的相應(yīng)溶劑中直接用于ELISA及Western-blot或置-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.12P48在牛支原體中的初步定位

牛支原體全菌蛋白提?。喝∨囵B(yǎng)至對數(shù)生長中后期牛支原體5 mL，12 000 r/min離心5 min后棄上清，沉淀用PBS懸浮后洗滌3次，棄上清后沉淀懸浮于50 μL PBS中，加入等量2×上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min， 12 000 r/min離心10 min，分離上清，直接用于Western-blot或置-80 ℃保存?zhèn)溆?

取等體積純化后蛋白、牛支原體全菌蛋白、膜蛋白、胞漿蛋白，分別加入等體積2×上樣緩沖液，混勻后沸水浴10 min， 12 000 r/min離心10 min，分離上清，等體積上樣，經(jīng)10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先在60 V電壓下進(jìn)行，待溴酚藍(lán)跑至分離膠界面時(shí)，將電壓調(diào)至120 V至電泳結(jié)束，電泳完成后用半干轉(zhuǎn)印儀于15 V電壓下轉(zhuǎn)印30 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜上.NC膜經(jīng)5%脫脂乳中室溫封閉2 h后，用TBST漂洗3次，每次10 min.洗滌后的膜于兔抗rMbF48抗血清(1∶3 000)中，37 ℃孵育2 h，經(jīng)TBST漂洗3次后用HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶8 000) 37 ℃孵育2 h，TBST漂洗3次后用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色.

分別取50 μL膜蛋白和胞漿蛋白懸液與等體積包被液混勻后4 ℃過夜包被，用TBST洗滌3次，每次5 min，拍干后每孔加入200 μL 5%脫脂乳37 ℃封閉2 h，TBST洗滌3次后每孔加入100 μL兔抗rMbF48抗血清(1∶5 000)，37 ℃孵育1 h后用TBST洗滌3次，每孔加入100 μL HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶8 000)，37 ℃孵育1 h后洗滌3次，每孔加入100 μL底物顯色液，室溫避光孵育10 min后加入50 μL 2 mol H2SO4終止反應(yīng)，并在450 nm處檢測D值.

1.13免疫熒光檢測

取培養(yǎng)至對數(shù)生長中期支原體1 mL，離心后PBS懸浮洗滌3次后懸浮于100 μL PBS中，取適量涂布于蓋玻片上，待自然干燥后，用中性甲醛室溫固定30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，用5%脫脂乳封閉1 h后洗滌3次，取適量兔抗rMbF48抗血清(1∶5 000)滴加于載玻片上，濕盒內(nèi)37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，滴加FITC標(biāo)記的鼠抗兔IgG(1∶200)，濕盒內(nèi)37 ℃避光孵育1h，PBS洗滌3次后封片，于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察.

2結(jié)果與分析

2.1基因的PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒的酶切鑒定

通過Overlap PCR擴(kuò)增獲得牛支原體Wuwei株F48基因序列，其大小約為1 407 bp，與預(yù)期大小相一致(圖1).PCR產(chǎn)物回收后與表達(dá)質(zhì)粒pET-28a分別經(jīng)BamHI與XhoI雙酶切，回收酶切產(chǎn)物并連接轉(zhuǎn)化，陽性質(zhì)粒酶切鑒定并測序，鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pET -P48(圖2).

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：牛支原體武威株P(guān)48基因.圖1　牛支原體P48基因的PCR鑒定Fig.1　PCR identification of P48 gene from mycoplasma bovis

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET -P48酶切鑒定.圖2　重組質(zhì)粒pET -P48的酶切鑒定Fig.2　Restriction analysis of recombinant plasmid pET -P48

2.2序列分析

牛支原體武威分離株P(guān)48基因在NCBI中的BLAST檢測結(jié)果顯示，該基因在牛支原體HB0801株、Hubei-1株、PG45株及CQ-W70株中均存在，且所有分離株的P48基因序列同源性為100%.P48基因與無乳支原體的某些基因亦有很高的同源性，其中與M.agalactiaePG2(ID：CU179680.1)、M.agalactiaep48andp59 genes(ID：AJ132423.1)、M.agalactiae5632(ID：FP671138.1)，同源性均達(dá)到80%(表3)，且上述3個(gè)基因與牛支原體P48基因相比均存在兩處共9個(gè)堿基的缺失.雖然牛支原體P48基因與無乳支原體上述3個(gè)基因具有較高的同源性，但與無乳支原體其他菌株序列具有較大差異，遺傳距離較遠(yuǎn)(圖3).除此之外，在其他種屬支原體基因組中均未發(fā)現(xiàn)牛支原體P48基因的同源序列.

表3P48基因核苷酸序列分析

Tab.3Sequence analysis of the nucleotide

sequence ofP48 gene

1:Ma strain VP 20 L-15/02P48 gene;2:CQ-W07;3:HB0801;4:Hubei-1;5:Ma 5632;6:MaP48 andP59;7:Ma PG2;8:Ma strain PK01ARP48 gene;9:Ma strain RL 14/95-96P48 gene;10:P48 gene;11:Ma strain 17/95-95P48 gene;12:Ma strain VP 12/05P48 gene.

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET -P48酶切鑒定.圖3　P48 基因核苷酸進(jìn)化樹分析Fig.3　Phylogenetic analysis of P48 gene

2.3重組蛋白的表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET-P48轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，獲得重組蛋白的可溶性表達(dá)產(chǎn)物與預(yù)期一致，其分子量大小約為51 ku(圖4).

2.4兔抗rMbF8多抗的制備及P48的亞細(xì)胞定位

采集P48重組蛋白4免后的新西蘭大白兔血液分離血清，所得多克隆抗體效價(jià)高達(dá)1∶25 600.牛支原體胞漿蛋白、膜蛋白Western-blot檢測結(jié)果顯示，牛支原體P48蛋白絕大部分存在于外膜(圖5).ELISA結(jié)果進(jìn)一步證明牛支原體P48蛋白在膜表面所占比例遠(yuǎn)大于胞漿蛋白(圖6).

免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗rMbF48重組蛋白多克隆抗體處理的支原體表面可結(jié)合熒光標(biāo)記的二抗，從而可見明顯的熒光，而陰性血清處理的牛支原體則不結(jié)合熒光標(biāo)記二抗，從而無熒光出現(xiàn)，此結(jié)果進(jìn)一步說明牛支原體P48蛋白主要存在于支原體細(xì)胞膜表面(圖7).

M：預(yù)染的蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-P48未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；2：pET-P48經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；3：pET-P48裂解后上清；4：pET-P48裂解后沉淀；5：純化后蛋白.圖4　SDS-PAGE 電泳鑒定Fig.4　The identification of SDS-PAGE

M：預(yù)染的蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：牛支原體全菌蛋白；2：牛支原體胞漿蛋白；3：牛支原體膜蛋白；4：牛支原體P48重組蛋白.圖5　Western-blot 檢測Fig.5　Western-blot test

圖6　P48亞定位ELISA檢測Fig.6　P48 sublocalization ELISA test

7-A：陽性；7-B：陰性對照.圖7　熒光抗體檢測Fig.7　 Fluorescent antibody test

3討論

細(xì)菌脂蛋白是細(xì)胞外膜含量最為豐富的蛋白成分，研究表明，細(xì)菌脂多糖、脂蛋白及細(xì)菌DNA不僅自身存在致病能力，而且三者存在明顯的協(xié)同作用[16].牛支原體對宿主細(xì)胞的粘附作用是其致病的關(guān)鍵，通過這種粘附作用，病原體侵入宿主細(xì)胞后，降低機(jī)體抵抗力，進(jìn)而導(dǎo)致其他病原體的混合感染.粘附主要依靠支原體表面的眾多脂蛋白.本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出了牛支原體武威分離株的P48蛋白，并制備出了兔抗P48多克隆抗體，效價(jià)高達(dá)256 000，通過對制備出的多克隆抗體進(jìn)行ELISA效價(jià)測定，結(jié)果證明該重組蛋白具有良好的免疫原性，能刺激新西蘭兔產(chǎn)生特異性抗體且能夠特異性結(jié)合P48蛋白.在此基礎(chǔ)上，提取牛支原體膜蛋白，并運(yùn)用Western-blot及ELISA對P48蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，證明P48蛋白主要存在于牛支原體表面，胞漿中含量較少，全菌免疫熒光試驗(yàn)進(jìn)一步證明P48蛋白是一種存在于牛支原體細(xì)胞膜表面的具有免疫原性的脂蛋白.

對牛支原體P48基因進(jìn)行測序分析發(fā)現(xiàn)其與牛支原體其他菌株P(guān)48基因序列相似性達(dá)100%，無任何堿基突變，說明本試驗(yàn)所用支原體菌株具有穩(wěn)定的遺傳性以及該基因具有高度的保守性，提示P48蛋白基因?qū)τ谂Ｖгw的生存可能具有非常重要的意義.目前關(guān)于P48蛋白的粘附與免疫功能的報(bào)道較少，而P48蛋白作為一種存在于支原體膜表面的具有免疫原性的脂蛋白，可以作為牛支原體感染宿主的一個(gè)重要標(biāo)志，在牛支原體檢測方面具有很大的研究空間[12]，且我國目前尚無商品化產(chǎn)品來對牛支原體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，因此，本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究P48蛋白的生物學(xué)特性及建立高效的牛支原體診斷方法奠定了基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯胡文忠)

Gene cloning,prokaryotic expression and subcellular iocalization of lipoproteinP48 of mycoplsama bovis Wuwei strain

HU Guo-ming,XING Xiao-yong,LI Na,SU Wei-de,WEN Feng-qin,XIANG Hai-tao,HU Yong-hao,BAO Shi-jun

(College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Abstract：【Objective】 To verify the location of Mycoplasma bovis P48 protein in the cell,and to lay the foundation for the follow-up study its function .【Method】 The P48 gene from M.bovis Wuwei strain was amplified by Overlap PCR.Sequencing and analyzing were accomplished after P48 gene was cloned into pGEM-T Easy.Then the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a (+) and the recombinant expression plasmid pET-P48 was transformed into E.coli BL21 (DE3). After induction by IPTG,the recombinant protein rMbP48 was expressed,which the relative molecular weight was about 51ku.Then the rabbit was immunized with purified recombinant protein and the polyclonal antibodies against rMbF48 were prepared.Subsequently,the subcellular localization of P48 was accomplished using Western-blot and ELISA on the basis of the separation of the membrane proteins.【Result】 The results showed that P48 protein mainly distributed in the cytomembrane.That was further confirmed by whole cell immunofluorescence test.【Conclusion】 M.bovis P48 protein is a lipoprotein that has immunogenic and present in the surface of M.bovis,which laid the foundation for the future study of the biological characteristics and establish an efficient diagnostic methods of P48 protein of M.bovis

Key words：Mycoplasma bovis;P48;gene clone;prokaryotic expression;subcellular localization

通信作者：包世俊，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病與流行病學(xué)、動(dòng)物病原分子生物學(xué)及基因工程.E-mail：bsjdy@126.com

基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“新生犢牛傳染性肺炎病原的分離、鑒定及快速診斷方法研究”(1308RTZA235).

收稿日期：2015-04-07；修回日期：2015-04-23

中圖分類號：Q 7

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1003-4315(2016)02-0001-07

第一作者：胡國明(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)閭魅静∨c病原分子生物學(xué).E-mail：hgm900915@126.com