祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化模型的影響及機(jī)制探討

穆冰瑤,程永靜,陳穎娟,王錢(qián),周榮偉,黃慈波

(北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100730)

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·基礎(chǔ)研究·

祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化模型的影響及機(jī)制探討

穆冰瑤,程永靜,陳穎娟,王錢(qián),周榮偉,黃慈波

(北京醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，北京 100730)

[摘要]目的初步探討祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)博來(lái)霉素導(dǎo)致的小鼠肺纖維化模型的影響及機(jī)制。方法將54只C57BL/6小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分3組，即正常組、模型組、祛風(fēng)組，每組18只。1組作為正常對(duì)照，2和3組小鼠使用博來(lái)霉素誘導(dǎo)肺纖維化模型。分別對(duì)2和3組予以0.9%氯化鈉注射溶液、祛風(fēng)止痛膠囊藥液灌胃處理，對(duì)照組予等量0.9%氯化鈉注射溶液灌胃。然后于第7、14、28天分批處死小鼠，每次每組隨機(jī)抽取6只小鼠，留取血樣測(cè)定細(xì)胞因子，并取小鼠肺作病理觀察。結(jié)果(1)2組、3組小鼠活動(dòng)減少，進(jìn)食，飲水情況亦減少，體質(zhì)量較1組小鼠減輕。(2)光鏡下觀察1組未見(jiàn)明顯的炎癥、纖維化等病理變化，僅于大氣道和血管壁周?chē)梢?jiàn)少量藍(lán)色的基質(zhì)膠原纖維；2組博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型成功。3組較2組輕，組間病理評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。(3)2組、3組血干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A(IL-17A)水平較1組升高(P<0.05)，3組炎性因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A水平較2組降低(P<0.05)。結(jié)論祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型的肺泡炎和肺纖維化有抑制作用；祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)炎性因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A有抑制作用。

[關(guān)鍵詞]肺疾病，間質(zhì)性；纖維化；博來(lái)霉素；模型,動(dòng)物；中草藥

肺間質(zhì)纖維化的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，常有多個(gè)病理生理過(guò)程及信號(hào)通路參與，是免疫紊亂、炎癥、纖維化相互交織發(fā)展的過(guò)程。糖皮質(zhì)激素作為首選藥物被用于臨床，但結(jié)果表明激素對(duì)肺間質(zhì)纖維化的療效是有限的[1-2]。有研究使用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)抗體或抗血清可阻抑TGF-β致纖維化中關(guān)鍵的下游因子-Smad家族，但也僅僅是部分緩解纖維化的進(jìn)展[3-4]。眾多醫(yī)家嘗試用血府逐瘀湯[5]、 復(fù)方鱉甲湯[6]等這些有名的活血化瘀方劑甚至單味活血藥川芎來(lái)治療肺纖維化，均取得不錯(cuò)療效。而祛風(fēng)止痛膠囊可舒筋活血，常用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等癥。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化的影響，以探討其機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)，C57BL/6，雄性小鼠，購(gòu)于北京維通利華公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001]，年齡：5周齡。

1.2藥物與試劑博來(lái)霉素A5(BLM)(15 mg/支，日本化藥株式會(huì)社產(chǎn))；艾拉莫德片(先聲藥業(yè)有限公司產(chǎn))；小鼠細(xì)胞因子/趨化因子磁珠檢測(cè)試劑盒(購(gòu)于上海升聯(lián)醫(yī)療器械有限公司)；Masson染色試劑盒(購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。

1.3動(dòng)物模型制作小鼠在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，采用4%水合氯醛0.1 mL腹腔注射麻醉，無(wú)菌條件下作氣管切開(kāi)，模型組和藥物組氣管內(nèi)一次性給予博來(lái)霉素(5 mg/kg)，對(duì)照組給予0.9%氯化鈉注射溶液0.2 mL。給藥后，小鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥物充滿(mǎn)肺部。

1.4動(dòng)物分組及給藥模型制作成功后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、祛風(fēng)組。每天分別給予0.9%氯化鈉注射溶液2 mL、祛風(fēng)止痛膠囊0.6g/kg灌胃。即對(duì)照組為1組，模型組為2組，祛風(fēng)組為3組。

1.5標(biāo)本收集方法三組小鼠分別于術(shù)后第7、14、28天各處死6只。開(kāi)胸取肺并稱(chēng)重，取左下肺葉固定于10%的甲醛溶液中，待HE染色、Masson染色；摘眼球取血行細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.6細(xì)胞因子測(cè)定檢測(cè)步驟根據(jù)上海升聯(lián)醫(yī)療器械有限公司提供的Mouse Luminex Screening Assay試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，方法為ELISA檢測(cè)法。

1.7結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)病理學(xué)評(píng)分參照Szapiel等[7]的方法對(duì)肺組織的肺泡炎及纖維化程度進(jìn)行評(píng)分：1級(jí)：1分，無(wú)肺泡炎。2級(jí)：2分，輕度肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化，單核細(xì)胞浸潤(rùn)使肺泡間隔增寬僅限于局部，面積不到全肺的20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常。3級(jí)：3分，中度肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化，面積占全肺的20%～50%。4級(jí)：4分，重度肺泡炎和肺間質(zhì)纖維化，面積超過(guò)全肺的50%，偶見(jiàn)肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞及出血造成實(shí)變。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)良好，除體質(zhì)量自然增長(zhǎng)外，無(wú)異常改變；模型組小鼠死亡1只，有體質(zhì)量減輕、脫毛、行為異常等反應(yīng)。祛風(fēng)組無(wú)死亡，較模型組情況好。

2.2 肺部病理光鏡下觀察1組未見(jiàn)明顯的炎癥、纖維化等病理變化，僅于大氣道和血管壁周?chē)梢?jiàn)少量藍(lán)色的基質(zhì)膠原纖維；2組小鼠第7天肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔可見(jiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺部可見(jiàn)形態(tài)扭曲、分布異常的毛細(xì)血管增生，成纖維細(xì)胞增生，表現(xiàn)為肺泡間隔明顯增寬。第14天時(shí)可見(jiàn)肺泡腔及間隔內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及中性粒細(xì)胞較前減少，而巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增多，肺泡壁較前增厚明顯，而肺泡炎較前減輕，部分肺泡結(jié)構(gòu)消失，成纖維細(xì)胞明顯增多，可見(jiàn)呈小灶樣的染為藍(lán)色的膠原纖維，肺組織新生血管明顯增多，且排列紊亂，血管壁較厚。到第28天時(shí)肺泡炎癥基本消失，肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺泡腔消失，大量的纖維組織增生且呈彌漫性分布，并為條索瘢痕樣改變，在肺組織間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量藍(lán)色呈束狀或者片狀的膠原纖維，并伴有肺泡的融合。3組均有上述表現(xiàn)但均較輕。

2.3肺泡炎評(píng)分2組、3組各時(shí)間段肺泡炎評(píng)分均明顯高于1組(P<0.05)；3組隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，肺泡炎評(píng)分呈下降趨勢(shì)，第7、14天評(píng)分明顯低于2組(P<0.05)，第28天肺泡炎評(píng)分與2組比較有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1　三組小鼠肺組織病變HE染色評(píng)分比較±s，分)

注：與1組比較，aP<0.01；與2組比較，bP<0.01,cP>0.05

2.4肺纖維化評(píng)分比較2組、3組不同時(shí)間肺纖維化評(píng)分均明顯高于1組(P<0.05)；3組第14、28天肺纖維化評(píng)分均明顯低于2組(P<0.05)；3組在第7天時(shí)與2組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2　肺組織病變Masson染色評(píng)分比較，分)

注：與1組比較，aP<0.01；與2組比較，bP>0.05,cP<0.01

2.5細(xì)胞因子測(cè)定IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A分別于造模后第7、14、28天留取血清檢測(cè)，見(jiàn)表3。

3討論

祛風(fēng)止痛膠囊的成分主要為老鸛草、槲寄生、續(xù)斷、威靈仙、獨(dú)活、制草烏、紅花，常用于類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者，具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，而RA患者罹患肺間質(zhì)纖維化的比例為10%～50%，也有報(bào)道[8]類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者隨著年齡的增長(zhǎng),其肺功能水平顯著下降,表現(xiàn)為小氣道功能的嚴(yán)重?fù)p傷,并伴有混合性通氣功能障礙，且國(guó)內(nèi)尚未有祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)于肺間質(zhì)纖維化的影響的報(bào)道。另有研究發(fā)現(xiàn)[9]新風(fēng)膠囊通過(guò)誘導(dǎo)免疫抗炎、提高肺組織細(xì)胞代謝、激活TGF-β/Smads信號(hào)通路及調(diào)控Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可明顯改善RA肺功能損傷。祛風(fēng)止痛膠囊有活血化瘀的作用，其中威靈仙屬于化纖湯成分，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NADH(+)和ATP的水平，從而影響肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)。也有研究[10]顯示紅花黃色素輔助治療對(duì)于特發(fā)性肺纖維化患者的生活質(zhì)量有改善作用，且使用安全。而我們的研究中對(duì)祛風(fēng)止痛膠囊治療肺纖維化的效果進(jìn)行了觀察，尤其是在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用的干擾素-γ(IFN-γ)、白介素-6(IL-6)、白介素-17A(IL-17A)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子。

在本研究中，不同時(shí)間點(diǎn)出現(xiàn)2組和3組的小鼠的IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A較1組明顯升高，亦表明IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A參與了博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的致病過(guò)程，而3組小鼠的IL-6和TNF-α于第7天、IFN-γ于第14天、IL-17A全程出現(xiàn)較2組明顯降低的現(xiàn)象，這證明祛風(fēng)止痛膠囊對(duì)炎癥反應(yīng)有抑制作用?，F(xiàn)分析如下：IL-6對(duì)機(jī)體維持內(nèi)部自穩(wěn)態(tài)、免疫應(yīng)答及在炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起重要作用，但I(xiàn)L-6過(guò)度增高也可造成機(jī)體損傷[11]；Ojeda等[12]研究顯示IL-6可調(diào)節(jié)黏附分子及其它細(xì)胞因子如TNF-α的表達(dá)，以促進(jìn)炎癥反應(yīng)。IFN-γ在調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞活性的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起一個(gè)復(fù)雜的作用，可以抑制由TNF-α和IL-1，IL-4和TNF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的膠原合成[13]，提高纖維連接蛋白的產(chǎn)生。而TNF-α主要通過(guò)直接或間接的刺激TGF-β、IL-1、IL-6、CXCL8、CCL2、PDGF 等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。Camara等[14]的研究表明，TNF-α可以顯著提高TGF-β對(duì)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過(guò)程的促進(jìn)作用。而 Sullivan等[15]發(fā)現(xiàn)TNF-α在增加TGF-β1mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄兩方面都能夠促進(jìn)TGF-β1 的表達(dá)。近年來(lái)抑制TNF-α的生物制劑也是治療肺纖維化的研究熱點(diǎn)之一。IL-17屬于促炎因子，與許多炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、哮喘、狼瘡以及在移植排斥反應(yīng)中IL-17的表達(dá)均增加。有人通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)滑液中IL-17和IL-23的含量明顯高于骨性關(guān)節(jié)炎患者滑液中的含量[17]，提示體內(nèi)高水平的IL-17可能在疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，有可能作為療效判定的指標(biāo)之一，并有可能監(jiān)測(cè)疾病的活動(dòng)性。

表3　三組各細(xì)胞因子水平不同時(shí)間比較±s,ng/L)

注：與1組比較，aP<0.05；與2組比較，bP<0.05

細(xì)胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17A在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用，祛風(fēng)止痛膠囊可祛風(fēng)止痛、活血化瘀、減少炎性細(xì)胞因子的釋放，對(duì)肺纖維化相關(guān)的炎性因子起到了明顯的抑制作用，從而達(dá)到防止博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的作用。

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Effects and mechanisms of Qufeng Zhitong capsule on mice model of bleomycin-induced Pulmonary fibrosis

MuBingyao，ChengYongjing，ChenYingjuan，WangQian，ZhouRongwei，HuangCibo

(DepartmentofImmunologyandRheumatology,BeijingHospital,Beijing100730,China)Correspondingauthor:HuangCibo,Email:huangcibo1208@139.com

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of Qufeng Zhitong capsule in mice model of bleomycin-induced Pulmonary fibrosis.Methods54 C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups after feeding adaptively for 1 week,and the normal group was the group numbered 1,model group was 2,and Qufeng group was 3,with 18 mice every group.The mice of group 2-3 were induced into the pulmonary fibrosis model using bleomycin.The mice of group 2-3 were respectively received the same amount of normal saline and the liquid of Qufeng Zhitong capsule with the gavage way.Then on the 7th,14th and 28th day,6 mice were sacrificed srandomly in each group every time.Collect blood.The blood specimens were used to measure the cytokines and the lung was used for the pathological observation.Results(1)The mice activity ,eating and drinking decreased in group 2 and group 3 and the body weight was also less than the group 1.There was no abnormal situation about activities,eating and drinking of the mice in group 1.(2)There was no significant pathological changes of inflammation and fibrosis observed under light microscope in group 1,a small amount of blue collagen matrix was showed only around airways and blood vessel wall.In group 2 the mice model of bleomycin-induced Pulmonary fibrosis was successful.There were significant differences (P<0.05) between the group 2 and group 3 about the pathological scores with the score of group 3 less than the group 2.(3)IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17A levels of group 2 and group 3 were higher than those of the group 1,with statistical significance (P<0.05).IL-6,IFN-γ,TNF-α,IL-17A levels of group 3 were lower than those of the group 2 with significant differences (P<0.05).ConclusionsQufeng Zhitong capsule has a inhibition effect on the alveolitis and pulmonary fibrosis of mice models bleomycin-induced pulmonary fibrosis,which may be related its inhibition on the cytokine IL-6,IFN-γ,TNF-α and IL-17A.

[Key words]Lung diseases,interstitial;Fibrosis;Bleomycin;Models,animal;Drugs,Chinese herbal

基金項(xiàng)目：首都衛(wèi)生發(fā)展科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(首發(fā)2014-1-4051)

作者簡(jiǎn)介：穆冰瑤,醫(yī)師,Email:Mubingyao_v@163.com通信作者：黃慈波，主任醫(yī)師,Email:huangcibo1208@139.com

中圖分類(lèi)號(hào):R563

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.025

(收稿日期：2016-01-17)