糖尿病腎病尿毒癥患者成纖維細(xì)胞生長因子23和骨保護(hù)素與橈動(dòng)脈血管鈣化的相關(guān)性

劉靜靜,任偉,王科,蘭雷,王冬梅

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院腎臟內(nèi)科，合肥 230001)

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·論著·

糖尿病腎病尿毒癥患者成纖維細(xì)胞生長因子23和骨保護(hù)素與橈動(dòng)脈血管鈣化的相關(guān)性

劉靜靜,任偉,王科,蘭雷,王冬梅

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院腎臟內(nèi)科，合肥 230001)

[摘要]目的檢測糖尿病腎病尿毒癥患者血清及橈動(dòng)脈成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)和骨保護(hù)素(OPG)的表達(dá)，探討其與橈動(dòng)脈血管鈣化(VC)的相關(guān)性。方法選取36例糖尿病腎病尿毒癥且尚未開始血液透析的患者為研究對象,并選取年齡、性別與之相匹配的健康人群40例作為對照組。在病例組建立自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺吻合手術(shù)時(shí)留取修剪下的橈動(dòng)脈，行von kossa 染色檢測有無鈣化,并計(jì)算鈣化積分；免疫組織化學(xué)檢測橈動(dòng)脈FGF-23和OPG的表達(dá)。測定兩組血清FGF-23、OPG、血紅蛋白濃度(Hb)、白蛋白(ALB)、鈣(Ca)、磷(P)、全段PTH (iPTH)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C反應(yīng)蛋白(CRP)的水平。結(jié)果病例組血清FGF-23、OPG水平明顯高于對照組(P<0.05)。隨著血管鈣化程度加重，F(xiàn)GF-23和OPG在血清的水平升高，并且在血管壁免疫組織化學(xué)染色陽性表達(dá)吸光度值升高，病例組血P、FGF-23、OPG與橈動(dòng)脈血管鈣化有相關(guān)性。結(jié)論糖尿病腎病尿毒癥患者普遍存在橈動(dòng)脈血管鈣化，F(xiàn)GF-23和OPG與橈動(dòng)脈血管鈣化呈正相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]糖尿病腎??；尿毒癥；成纖維細(xì)胞生長因子;骨保護(hù)素；血管鈣化

血管鈣化(VC)是在糖尿病、腎臟損害等疾病中常見的血管病變。尿毒癥患者血管鈣化為動(dòng)脈中膜鈣化[1],有部分學(xué)者認(rèn)為，腎動(dòng)脈鈣化的程度是糖尿病患者進(jìn)展為尿毒癥的獨(dú)立預(yù)測因素[2]。隨著分子生物學(xué)和免疫組織化學(xué)等科研技術(shù)的發(fā)展，尿毒癥患者血管鈣化，被證實(shí)為一多因素參與的類似骨和軟骨發(fā)育的主動(dòng)調(diào)節(jié)過程，是主動(dòng)的、可預(yù)防的，并且可以逆轉(zhuǎn)的高度可調(diào)控的復(fù)雜的生物學(xué)過程[3]。發(fā)生機(jī)制可能為，血液循環(huán)中抑制鈣化的因子如：骨保護(hù)素(OPG)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)、胎球蛋白A等的缺乏；以及隨著腎小球?yàn)V過率下降，促進(jìn)鈣化的因子如：成纖維細(xì)胞生長因子-23(FGF-23)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (BMP-2)、胰島素樣生長因素-1(IGF-1)等的增加，導(dǎo)致血管鈣化的發(fā)生發(fā)展。FGF-23和OPG，是新近研究發(fā)現(xiàn)的由骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的與動(dòng)脈血管鈣化相關(guān)的蛋白因子，本文就其在糖尿病腎病尿毒癥患者血清和橈動(dòng)脈血管壁的表達(dá)水平與橈動(dòng)脈血管鈣化程度的相關(guān)性作一分析。

1對象與方法

1.1研究對象病例組：選取36例(男19例，女17例)于2014年1月至2015年1月在安徽省立醫(yī)院腎臟內(nèi)科住院的尚未開始血液透析治療的糖尿病腎病尿毒癥患者，平均年齡(60.3±7.5)歲。收入標(biāo)準(zhǔn)為：①有較長時(shí)間的糖尿病病史，臨床上出現(xiàn)蛋白尿，低白蛋白血癥，腎功能異常，糖尿病眼底改變，根據(jù)美國腎臟病基金會(huì)慢性腎臟病的分期：GFR水平<15 mL/min，病程大于3個(gè)月；② 完善相關(guān)檢查已排除結(jié)締組織病、乙型肝炎、甲狀腺、腫瘤、遺傳性疾病(多囊腎、遺傳性腎炎)、梗阻性、藥物等繼發(fā)腎臟損害。主要排除標(biāo)準(zhǔn)：肝功能損害、嚴(yán)重感染性疾病、營養(yǎng)不良等。對照組：選取同一時(shí)間我院健康體檢中心的40例(男21例，女19例)體檢人群，平均年齡(63.3±10.4)歲，尿常規(guī)檢查無異常，肝腎功能正常，無高血壓、糖尿病等慢性病史。兩組研究對象年齡、性別匹配，具有可比性。本研究所有研究對象均簽署知情同意書，研究方案經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2血常規(guī)及生化檢查所有研究人群，空腹8 h以上，于次日清晨抽取靜脈血3 mL,在我院檢驗(yàn)科生化實(shí)驗(yàn)室協(xié)助下測定血紅蛋白(Hb)、白蛋白(ALB)、鈣(Ca)、磷(P)、全段PTH (iPTH)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、C反應(yīng)蛋白(CRP)。血清FGF-23、OPG水平測定采用酶聯(lián)免疫復(fù)合物法(ELISA法)，嚴(yán)格按照試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測，試劑盒為上海源葉分裝美國R&D公司。

1.3病例組血管處理在病例組建立自體動(dòng)靜脈內(nèi)瘺吻合手術(shù)時(shí)，留取修剪后廢棄的橈動(dòng)脈0.5～1 cm，經(jīng)0.9%氯化鈉注射溶液充分沖洗后，置于4%甲醛中固定48 h，標(biāo)本常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。von kossa染色：切片經(jīng)二甲苯脫蠟后，于10% 硝酸銀避光浸染30 min，紫外線燈下照射30 min，經(jīng)伊紅-蘇木素溶液中依次染色。結(jié)果判定：切片背景為紅色，棕黑色為鈣鹽沉積。血管免疫組織化學(xué)：切片脫蠟后置于盛有枸櫞酸鈉緩沖液的高壓鍋中，煮沸2 min。冷卻后，0.01%PBS緩沖液沖洗。滴加I抗，37 ℃保溫箱中孵育30 min，滴加檢測試劑PV-6000山羊抗兔IgG/HRP聚合物后，放置于37 ℃保溫箱中孵育20 min,應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。沖洗水沖洗、蘇木素復(fù)染、脫水、中性樹脂封片觀察。FGF-23、OPG I抗體購買于美國Bioworld Technology公司。II抗購買于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)結(jié)果：陽性反應(yīng)細(xì)胞呈棕黃色，陰性對照無色。

1.4血管鈣化程度判定von kossa染色讀片標(biāo)準(zhǔn)[3]：背景為紅色，鈣鹽沉積為棕黑色。0分，無鈣鹽沉積；1分，點(diǎn)狀沉積；2分，單個(gè)片狀沉積；3分，多個(gè)片狀沉積；4分，彌漫性圍繞管腔沉積。根據(jù)評分結(jié)果，將病例組血管分為無鈣化組(0分)、輕度鈣化組(1～2分)、重度鈣化組(3～4分)，三組間年齡、性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5血管免疫組織化學(xué)結(jié)果 每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野觀察。依照細(xì)胞陽性著色程度分級，弱陽性1分；中等強(qiáng)度2分；強(qiáng)陽性3分。依照陽性細(xì)胞總數(shù)分級為：<25%，≥25%且<49%，≥50%。采用積分綜合計(jì)量對每個(gè)標(biāo)本進(jìn)行評分分級。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料比較采用兩樣本比較t檢驗(yàn)及單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法，血管鈣化程度與各血清指標(biāo)之間的關(guān)系采用Spearman 相關(guān)分析，F(xiàn)GF-23和OPG與各指標(biāo)之間的相關(guān)性采用Pearson 相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組生化指標(biāo)分析病例組血清FGF-23、OPG、P、iPTH、 CRP水平均明顯高于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。病例組血清Hb、ALB、Ca均明顯低于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

2.2病例組血管鈣化情況36例糖尿病腎病尿毒癥患者橈動(dòng)脈標(biāo)本中，有16例發(fā)生鈣化(44.4%)，鈣化均發(fā)生在動(dòng)脈中膜,其中輕度鈣化4例(11.1%)，中度鈣化8例(22.2%)，重度鈣化4例(11.1%),見圖1。在三組間比較，血P、FGF-23、OPG水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LED法組間比較重度鈣化組與輕度鈣化組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1　兩組各項(xiàng)生化指標(biāo)的比較±s)

表2　不同橈動(dòng)脈鈣化積分組的血清學(xué)指標(biāo)比較±s)

2.3免疫組織化學(xué)分析在所有鈣化組標(biāo)本中，橈動(dòng)脈均可見FGF-23、OPG的表達(dá)，見圖2，3。重度鈣化組與輕度鈣化組陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4相關(guān)性分析Spearman 相關(guān)分析提示血清P、iPTH、CRP水平與血管鈣化呈正相關(guān)。Pearson 相關(guān)分析提示血清FGF-23、OPG水平與血P水平呈正相關(guān)，見表3。

表3　橈動(dòng)脈鈣化積分與其他血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性分析

3討論

糖尿病導(dǎo)致的腎臟疾病是西方國家尿毒癥發(fā)病的最重要的病因。流行病學(xué)研究表明，糖尿病的患病率正逐年增加,在我國因糖尿病導(dǎo)致的腎臟病的發(fā)病率僅次于原發(fā)性慢性腎小球腎炎之后[4]。動(dòng)脈血管中膜鈣化是慢性腎臟病患者最常見的并發(fā)癥，亦是尿毒癥患者因心血管疾病(CVD)死亡的主要預(yù)測因子[5]。超過50%的尿毒癥患者死于心血管意外[6]。糖尿病腎病尿毒癥患者因高血糖、高血脂、高血磷等復(fù)雜因素致血管內(nèi)皮功能障礙，其血管鈣化發(fā)生率較慢性腎小球腎炎等導(dǎo)致的尿毒癥更早期、更常見[7]。

FGF-23是主要由骨細(xì)胞分泌的重要的血清磷調(diào)控蛋白，在腎臟的無機(jī)磷代謝中發(fā)揮重要作用，而血磷是導(dǎo)致血管鈣化的重要病理生理基礎(chǔ)。已有國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-23是影響尿毒癥患者血管鈣化的獨(dú)立影響因素，是尿毒癥患者死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立預(yù)測因子[8]。我們通過對糖尿病腎病尿毒癥患者橈動(dòng)脈血管鈣化和血清FGF-23水平變化的研究，進(jìn)一步探討糖尿病腎病尿毒癥患者FGF-23與血管鈣化的關(guān)系。

FGF-23可以通過抑制近端腎小管對磷的重吸收，并促進(jìn)尿磷的排泄；同時(shí)抑制1α-羥化酶的活性，減少1,25(OH)2D3的合成，以減少腸道磷的吸收，從而調(diào)節(jié)血清中磷的動(dòng)態(tài)平衡[9]。在正常人及有殘余腎功能的患者，尿中可發(fā)現(xiàn)有FGF-23的C肽片段，但在尿毒癥患者，隨著殘余腎功能的喪失，F(xiàn)GF-23的排泄率降低，其在血清水平逐漸升高，但此時(shí)即使較高濃度的血FGF-23水平，磷的清除也不會(huì)增加，導(dǎo)致高磷血癥。高磷血癥進(jìn)一步刺激FGF-23明顯升高，升高的FGF-23使1,25(OH)2D3的合成減少，導(dǎo)致繼發(fā)性甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥。本研究結(jié)果顯示，糖尿病腎病尿毒癥患者的血清FGF-23明顯升高，與國外大量研究結(jié)果一致。

國外多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者血清OPG水平與血管鈣化程度呈正相關(guān)，是尿毒癥患者心血管病死率的獨(dú)立預(yù)測因子[10]。Moe等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者血管鈣化程度與血清OPG濃度呈正相關(guān)。OPG可由骨骼細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，其可抑制破骨細(xì)胞生成，還抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能?，F(xiàn)在越來越多的研究指向OPG的血管內(nèi)皮功能維持和保護(hù)方面。其發(fā)揮作用可能是通過OPG-OPGL-RANK信號途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)的。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明[12]，敲除小鼠OPG基因，使小鼠體內(nèi)缺乏OPG。小鼠即表現(xiàn)出現(xiàn)嚴(yán)重的動(dòng)脈血管鈣化及骨質(zhì)疏松。但是在動(dòng)物試驗(yàn)中，予以重組骨保護(hù)素治療妊娠中期骨保護(hù)素基因缺乏小鼠治療可逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松，而且這種基因型小鼠鈣化則被顯著抑制，血管鈣化發(fā)生率大大降低。故有學(xué)者認(rèn)為[13]，OPG是血管保護(hù)因子，其通過防止血管鈣化起作用。但是有研究[14]發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者及急性心肌梗死伴發(fā)心力衰竭患者血清OPG濃度升高，與本文研究結(jié)果相符，然而這似乎與OPG的血管保護(hù)作用相反。有研究[15]結(jié)果顯示，給以缺乏低密度脂蛋白(LDL)受體的小鼠高脂飲食，并檢測小鼠體內(nèi)的OPG，發(fā)現(xiàn)其水平較前明顯升高，若再予以O(shè)PG治療，這些小鼠動(dòng)脈鈣化水平較前明顯減輕。因此證實(shí)在血管鈣化、粥樣硬化及其他形式的血管受損的疾病中，OPG水平升高是機(jī)體對抗血管損害進(jìn)一步進(jìn)展的自我保護(hù)的代償機(jī)制，即OPG水平升高，不是導(dǎo)致動(dòng)脈鈣化的原因，而是防止血管損害加重的保護(hù)機(jī)制[16]。在本實(shí)驗(yàn)研究中，病例組血清OPG水平明顯高于對照組，且隨著橈動(dòng)脈血管鈣化程度加重，血清OPG水平升高。本研究結(jié)果顯示，血清FGF-23、OPG水平與血管鈣化存在正相關(guān)關(guān)系，血清FGF-23、OPG參與了糖尿病腎病尿毒癥患者血管鈣化的發(fā)生發(fā)展，其是否是糖尿病腎病尿毒癥患者發(fā)生血管鈣化的預(yù)警指標(biāo)值得我們進(jìn)一步研究。

(本文圖1～3見插圖2-3)

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(收稿日期2015-11-17)

Correlation between FGF-23 and OPG,calcification of radial artery in patients with diabetic nephropathy with uremic

LiuJingjing,RenWei,WangKe,LanLei,WangDongmei

(DepartmentofNephrology，theAffiliatedProvincialHospitalofAnhuiMedicalUniversity，Hefei230001,China)Correspondingauthor:RenWei,Email:renweisn@163.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the correlation between serum fibroblast growth factor-23 (FGF-23) and osteoprotegerin (OPG),calcification of radial artery in patients with diabetic nephropathy patients with uremia.MethodsThirty-six diabetic nephropathy with uremia (experimental group) who did not made dialytic were recruited in nephrology department of our hospital,and 40 healthy subjects (control group) were slected as control.Radial arteries tissue were saved in experimental group in arteriovenous fistula operation，and von kossa-staining was used to detect the degree of calcification.The level of serum FGF-23 and OPG was measured by enzyme-linked immunlsorbent assay.Serum concentrations of Hb,ALB,Ca,P,iPTH,HbA1c and CRP was measured.ResultsThe experimental group′s FGF-23 and OPG were significantly higher than those of the control group.FGF-23,OPG and their expression in radial artery were increased with vascular calcification .FGF-23 and OPG were associated with advanced vascular calcification in diabetic nephropathy with uremia.ConclusionRadial artery vascular calcification is almost universal in diabetic nephropathy with uremia,there is a positive relationship between serum FGF-23,OPG and vascular calcification.

[Key words]Diabetic nephropathies;Uremia;Osteoprotegerin;Vascular calcification

基金項(xiàng)目：安徽省年度重點(diǎn)科研項(xiàng)目(12070403059)；安徽省衛(wèi)生廳立項(xiàng)課題(2010C040)

作者簡介：劉靜靜，碩士，Email:924675631@qq.com通訊作者：任偉，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師，Email:renweisn@163.com

中圖分類號:R587.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.02.021