重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19基因多態(tài)性分布*

范　超,張　燕,何建維,陳　鳴,鄧少麗

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科,重慶 400042)

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重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19基因多態(tài)性分布*

范超,張燕,何建維,陳鳴,鄧少麗△

(第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所檢驗(yàn)科,重慶 400042)

[摘要]目的研究重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19 基因多態(tài)性的分布。方法選取該院2015年第1季度心血管內(nèi)科住院，明確診斷為冠心病，同意行冠狀動(dòng)脈支架術(shù)(PCI)并使用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板治療的患者共152例。抽取其外周血并通過(guò)提取基因組DNA，檢測(cè)CYP2C19的基因型，了解其代謝型的分布。結(jié)果在152例檢測(cè)標(biāo)本中，檢測(cè)出CYP2C19的6種基因型，*1/*1型(636GG，681GG)57例(37.5%)，*1/*2型(636GG，681GA)60例(39.5%)，*1/*3型(636GA，681GG)11例(7.2%)，*2/*2型(636GG，681AA)17例(11.2%)，*3/*3型(636AA，681GG)2例(1.3%)，*2/*3型(636GA，681GA)5例(3.3%)。檢測(cè)出CYP2C19的3種代謝型，所占比例分別為：快代謝型57例(37．5%)，中間代謝型71例(46.7%)，慢代謝型24例(15.8%)。重慶地區(qū)冠心病介入治療患者CYP2C19位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，弱代謝型的發(fā)生率與我國(guó)漢族人群幾乎一致，高于重慶地區(qū)健康漢族人群。結(jié)論該地區(qū)進(jìn)行治療時(shí)要重視該酶的基因分型，在條件允許的情況下進(jìn)行CYP2C19基因分型的檢測(cè)，以降低術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生概率。

[關(guān)鍵詞]冠心?。唤槿胫委?CYP2C19；基因型;代謝型；氯吡格雷

細(xì)胞色素P450(CYP450)是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶系，主要存在于肝臟微粒體中,其中CYP2C19酶是CYP450超家族中非常重要的代謝酶。通過(guò)CYP2C19代謝的藥物主要有：質(zhì)子泵抑制劑、氯吡咯雷、伏立康唑、抗抑郁藥及抗癲癇藥等。相關(guān)研究證明，藥物洗脫支架內(nèi)血栓[1]是冠狀動(dòng)脈支架術(shù)(PCI)后患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，為了降低冠心病患者該并發(fā)癥的發(fā)生率，目前臨床使用最廣泛的藥物是氯吡咯雷[2]，它是一種前體型藥物，需要經(jīng)過(guò)CYP2C19酶的代謝才會(huì)發(fā)揮其活性。但近年來(lái)研究結(jié)果表明，應(yīng)用氯吡格雷治療的部分患者存在氯吡格雷抵抗現(xiàn)象[3]。有研究認(rèn)為氯吡格雷抵抗主要與CYP2C19基因突變有關(guān)[4-5]，CYP2C19基因存在多態(tài)性，在我國(guó)漢族人群中，主要的突變位點(diǎn)為CYP2C19*2(681G-A)和CYP2C19*3(636G-A)，而攜帶CYP2C19*2/CYP2C19*3基因的患者與氯吡格雷抵抗的發(fā)生呈正相關(guān)[6]。根據(jù)個(gè)體對(duì)藥物代謝速率的不同，又可將個(gè)體分為快代謝(EM)型、中間代謝(IM)型及慢代謝(PM)型，因?yàn)椴煌x表型的個(gè)體間存在代謝速度上的差異，從而導(dǎo)致了血藥濃度的個(gè)體化差異。本研究采用基因芯片方法對(duì)重慶地區(qū)152例氯吡格雷治療的冠心病支架術(shù)患者進(jìn)行CYP2C19基因位點(diǎn)分型，旨在了解重慶地區(qū)冠心病患者的CYP2C19基因多態(tài)性的分布情況，進(jìn)而了解代謝表型的分布情況，并與重慶地區(qū)漢族健康人群的3種代謝表型的發(fā)生率進(jìn)行比較，為重慶地區(qū)氯吡格雷治療患者的臨床個(gè)體化用藥方案提供資料，減少不良心血管事件的發(fā)生。

1資料與方法

1.1一般資料選取2015年第1季度在本院心內(nèi)科住院，并確診為冠心病，已行PCI，并且使用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板治療的患者152例，其中男99例，女53例。所有患者為無(wú)血緣關(guān)系的重慶漢族人。

1.2儀器與試劑全血基因組DNA提取試劑盒(上海百傲科技有限公司)，含蛋白酶K，緩沖液BL、BW1、BW2、BH1、BH2、BE。CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒(上海百傲科技有限公司)，含CYP2C19擴(kuò)增液1、2，反應(yīng)液A、B，基因芯片、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及雜交顯色試劑盒，顯色試劑盒含預(yù)雜交液，雜交緩沖液，洗液1、2、3，抗體及抗體稀釋液，顯色液。e-Hyb全自動(dòng)雜交儀(上海百傲科技有限公司)，BE-2．0生物芯片識(shí)讀儀(上海百傲科技有限公司)，PCR儀，干式恒溫器，離心機(jī)，渦旋振蕩器。

1.3方法

1.3.1DNA提取所有患者在首次服用氯吡格雷前用紫頭管靜脈采血2 mL，按照血液基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書操作提取基因組DNA。DNA樣本-20 ℃保存，凍融不超過(guò)3次。

1.3.2PCR擴(kuò)增將CYP2C19擴(kuò)增液1和擴(kuò)增液2分裝到0.2 mL PCR反應(yīng)管中，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL，包括：CYP2C19擴(kuò)增液19 μL、反應(yīng)液A 1 μL、DNA模板5 μL。擴(kuò)增條件為：50 ℃ 5 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min終止反應(yīng)。將擴(kuò)增產(chǎn)物1和擴(kuò)增產(chǎn)物2置于2～8 ℃保存。

1.3.3雜交顯色取出雜交顯色試劑盒，將反應(yīng)液B低速離心，吸取10 μL加入雜交緩沖液瓶中混勻。臨用前，取出1支抗體，低速離心，加入1 mL抗體稀釋液，振蕩混勻，制成抗體使用液。取出基因芯片，做好標(biāo)記，將CYP2C19基因芯片放入雜交儀片架中，旋緊雜交艙蓋。將各試劑按要求分裝到2 mL離心管中，插入試管架中。取180 μL雜交緩沖液于離心管中，再分別加入10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物1和擴(kuò)增產(chǎn)物2，混勻，放入試管架中。將試管架放入雜交儀中，運(yùn)行雜交程序。取出芯片，放入生物芯片識(shí)讀儀中，用百傲基因芯片圖像分析軟件進(jìn)行圖像掃描和數(shù)據(jù)分析，輸出檢測(cè)結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。用頻數(shù)計(jì)數(shù)法計(jì)算各基因型及等位基因頻率。用χ2檢驗(yàn)比較各基因型頻率在性別間的差異及與健康人群代謝型頻率之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果CYP2C19擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)基因芯片分析后各種基因型生物芯片識(shí)別圖，見(jiàn)圖1。各基因型所占比例分別為:*1/*1型(636GG，681GG)57例(37.5%)，*1/*2型(636GG，681GA)60例(39.5%)，*1/*3型(636GA，681GG)11例(7.2%)，*2/*2型(636GG，681AA)17例(11.2%)，*3/*3型(636AA，681GG)2例(1.3%)，*2/*3型(636GA，681GA)5例(3.3%)。EM型57例(37.5%)，IM型71例(46.7%)，PM型24例(15.8%)。男性和女性的CYP2C19基因型及代謝型在CYP2C19的分布上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1　基因型生物芯片圖

表1　重慶地區(qū)男、女冠心病患者CYP2C19基因多態(tài)性的分布[n(%)]

2.2CYP2C19基因多態(tài)性(代謝型)的比較CYP2C19基因PM型的發(fā)生率與我國(guó)漢族人群基本一致。略高于重慶地區(qū)健康漢族人群，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2　CYP2C19代謝型比較結(jié)果[n(%)]

3討論

據(jù)目前的研究現(xiàn)狀而言，個(gè)體化治療及用藥越來(lái)越受到各界的關(guān)注。而這種個(gè)體化差異主要源自于人類基因的變異，單核苷酸多態(tài)性(SNP)是人類基因中最常見(jiàn)的變異形式，也是體現(xiàn)人群個(gè)體差異的最基本的基因變異。CYP450是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶系，主要存在于肝臟微粒體中,其中CYP2C19酶是CYP450超家族中非常重要的代謝酶。通過(guò)CYP2C19代謝的藥物很多，主要有質(zhì)子泵抑制劑、氯吡咯雷、伏立康唑、抗抑郁藥及抗癲癇藥等，其中有些藥物如伏立康唑可以直接經(jīng)過(guò)CYP2C19酶進(jìn)行代謝，如果此酶對(duì)該類藥物代謝速度過(guò)快，易造成患者體內(nèi)血藥濃度過(guò)低，從而導(dǎo)致療效不佳；反之，如果該酶代謝藥物速度過(guò)慢，易造成患者體內(nèi)血藥濃度過(guò)高，從而增加藥物的毒副作用。然而，另一類常用藥物氯吡咯雷，它是一種前體型藥物，需要經(jīng)過(guò)CYP2C19酶的代謝才會(huì)發(fā)揮其活性，如果此酶對(duì)該類藥物代謝速度過(guò)快，易造成患者體內(nèi)血藥濃度過(guò)高，從而增加藥物毒副作用，如果該酶代謝藥物速度過(guò)慢，則易造成患者體內(nèi)血藥濃度過(guò)低，直接影響療效。所以為了避免藥物的毒副作用，同時(shí)提高藥物的治療效果，臨床應(yīng)該根據(jù)不同患者基因型及代謝型的差異，酌情調(diào)整用藥的劑量，以提高效率[7-8]。

目前已有很多文獻(xiàn)報(bào)道不同地區(qū)、種族CYP2C19基因型的多態(tài)性分布情況，但重慶地區(qū)針對(duì)疾病人群的研究還不多，故本研究主要研究重慶地區(qū)冠心病支架介入治療患者CYP2C19基因型的多態(tài)性分布。研究結(jié)果顯示，重慶地區(qū)冠心病支架介入治療患者CYP2C19基因型所占比例分別為:*1/*1型37.5%、*1/*2型39.5%、*1/*3型7.2%、*2/*2型11.2%、*3/*3型1.3%、*2/*3型3.3%，并且各個(gè)基因型在不同性別間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這與文獻(xiàn)[1,6,9]報(bào)道的其他地區(qū)該基因多態(tài)性的分布幾乎一致。EM型占37.5%，IM型46.7%，PM型15.8%,這說(shuō)明約62.5%的患者對(duì)氯吡格雷會(huì)出現(xiàn)或重或輕的藥物抵抗作用，這與文獻(xiàn)[1]報(bào)道的60%基本一致，PM型15.8%與我國(guó)漢族人總體發(fā)生率14.1%幾乎一致，但高于文獻(xiàn)[1，9]報(bào)道的9.3%和10%。所以建議重慶地區(qū)的醫(yī)生和冠心病患者在進(jìn)行治療時(shí)要重視該酶的基因分型，在條件允許的情況下進(jìn)行CYP2C19基因分型的檢測(cè)，參考檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行治療用藥的選擇和劑量的增減，從而達(dá)到個(gè)體化用藥的目的，以降低術(shù)后心血管不良事件的發(fā)生概率。

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doi:·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.032

* 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81101199)；國(guó)家傳染病重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2013ZX10003006-003-002)。

作者簡(jiǎn)介：范超(1989-)，初級(jí)技師，本科，主要從事分子生物研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:dengshaoli@tmmu.edu。

[中圖分類號(hào)]R34

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]B

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1549-03

(收稿日期：2015-10-15修回日期：2015-12-20)