miR-302a對(duì)葉酸缺乏小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的影響

陽(yáng)　倩，石　偉

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院兒科，成都 610017)

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miR-302a對(duì)葉酸缺乏小鼠胚胎干細(xì)胞增殖和凋亡的影響

陽(yáng)倩，石偉△

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院兒科，成都 610017)

[摘要]目的探討miR-302a對(duì)葉酸缺乏小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)增殖和凋亡的影響。方法mESC分為完全培養(yǎng)基組(對(duì)照組)，無(wú)葉酸培養(yǎng)基組(無(wú)葉酸組)，無(wú)葉酸培養(yǎng)基+miR-302a mimic組(miR-302a組)，通過RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)miR-302a在完全培養(yǎng)基及無(wú)葉酸培養(yǎng)基中的表達(dá)。構(gòu)建miR-302a mimic，后轉(zhuǎn)染到無(wú)葉酸培養(yǎng)基mESC中，采用MTT法檢測(cè)miR-302a mimic對(duì)mESC活力的影響，Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-302a mimic對(duì)mESC細(xì)胞凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-302a mimic對(duì)mESC細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測(cè)及磷脂酰肌醇3羥激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路激活情況，以及下游分子細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、p27表達(dá)的影響。結(jié)果RT-PCR證實(shí)無(wú)葉酸組中miR-302a表達(dá)量下降(P<0.01)。與完全培養(yǎng)基比較，無(wú)葉酸培養(yǎng)基中，mESC 細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期阻滯在G1期，Akt及mTOR磷酸化水平下降，CyclinD1表達(dá)下調(diào)，p21及p27表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與無(wú)葉酸組比較，miR-302a組中，mESC 細(xì)胞活力上升，凋亡下降，G1期縮短，AKT及mTOR磷酸化水平提高，CyclinD1表達(dá)上調(diào)，p21及p27表達(dá)下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論miR-302a類似物能顯著抑制缺乏葉酸mESC凋亡，能促進(jìn)其增值，與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]葉酸；小鼠；胚胎干細(xì)胞；增殖；凋亡；miR-302a

胚胎生長(zhǎng)發(fā)育涉及胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、死亡及至器官形成等過程，受環(huán)境因素、遺傳基因及信號(hào)通路等的影響。一些微量必需元素的缺乏會(huì)導(dǎo)致胚胎生長(zhǎng)畸形，如葉酸，是一種水溶性B族維生素，只能從食物中攝取，人體內(nèi)不能合成，以其代謝物四氫葉酸來(lái)參與一碳單位和DNA合成，間接參與DNA甲基化過程[1]。目前已證實(shí)在外周血淋巴細(xì)胞系，我國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞等中，葉酸缺乏會(huì)引起全基因組不穩(wěn)定性和低甲基化，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖緩慢及凋亡率上升，并細(xì)胞周期阻滯在G1期[2]。梁燕等[3]也證實(shí)葉酸缺乏會(huì)抑制小鼠胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cell，mESC)增殖，與葉酸缺乏誘導(dǎo)的細(xì)胞周期特異性凋亡有關(guān)。

MicroRNA(miRNAs)是一類進(jìn)化上高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，它能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3′-UTR區(qū)域，使靶基因降解或阻遏靶基因翻譯，從而抑制靶基因表達(dá)，具有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。miRNA可調(diào)控胚胎干細(xì)胞命運(yùn)，參與一系列胚胎發(fā)育重要進(jìn)程，如早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等[4]。在胚胎發(fā)育過程中，如果miRNA加工過程或Dicer酶發(fā)生突變，導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化異常，使胚胎不能形成正常器官形態(tài)，嚴(yán)重影響胚胎發(fā)育早期。miR-302家族是胚胎干細(xì)胞特異miRNA家族，可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)化[5]。因而推測(cè)miR-302能通過促使G1到S期轉(zhuǎn)化，從而抑制葉酸缺乏引起的胚胎干細(xì)胞損傷。胚胎干細(xì)胞是從早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和原始生殖細(xì)胞中分離出來(lái)的全能干細(xì)胞，可在體外培養(yǎng)，且具有自我更新及多向分化的特點(diǎn)。mESC的體外培養(yǎng)目前應(yīng)用廣泛，操作技術(shù)成熟，是研究胚胎發(fā)育、遺傳疾病等的理想模型。因此本文在此基礎(chǔ)上探討miR-302a對(duì)于葉酸缺乏胚胎干細(xì)胞增殖及凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器MTT(Sigma公司)；兔抗CyclinD1、p27、p21抗體(Epitmics公司)；兔抗Akt、p-Akt、mTOR抗體(Cell Signaling Techonology)；GADPH、Annexin V/PI雙染檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基(含葉酸)、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(不含葉酸)(北京思賽因公司)；葉酸(Sigma公司)。CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific公司)；生物安全柜(Thermo Scientific公司)；倒置顯微鏡(Nikon公司)；流式細(xì)胞儀(BD 公司)；迷你雙垂直電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印電泳儀、ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)mESC R1細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，貨號(hào)：SCSP-223。飼養(yǎng)層細(xì)胞為小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，此細(xì)胞經(jīng)過伽馬射線輻射后失去分裂能力，接種在含0.1%明膠處理過的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待24 h完全貼壁后，將mESC細(xì)胞接種到此飼養(yǎng)層細(xì)胞上，2～3 d后傳代到無(wú)0.1%明膠的皿中，以除去MEF。mESC細(xì)胞培養(yǎng)基需再加入1 mL/L β巰基乙醇，10 μg/L重組人白血病抑制因子等。

1.2.2miRNA合成與轉(zhuǎn)染在廣州市銳博生物科技有限公司訂購(gòu)合成miR-302a mimic及對(duì)照negative control。miR-302a mimics:sense 5′-UAA GUG CUU CCA UGU UUU GGY GA-3′，anti-sense 5′-ACC AAA ACA CAU GGA AGC ACU UAU U-3′。negative control：sense 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，anti-sense 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.2.3RT-PCR檢測(cè)miR-302在mESC及葉酸缺乏mESC中的表達(dá)總RNA的提取參考trizol試劑盒 (Invitrogen) 使用說(shuō)明書，引物設(shè)計(jì)如下。miR-302a基因引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC TCA CCA A-3′，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參標(biāo)記物，引物序列：5′-TGA CTT CAA CAG CGA CAC CCA-3′。通過一步法RT-PCR試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用于下一步2%的瓊脂糖膠進(jìn)行檢測(cè)。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)電泳條帶并拍照。

1.2.4MTT法測(cè)mESC增殖率96孔板中MEF作為飼養(yǎng)層，mESC接種于飼養(yǎng)層上，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-302a mimic和negative control，轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nmol、200 nmol，轉(zhuǎn)染達(dá)到72 h后，加入20 μL 5 mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測(cè)A值，以630 nm作為參比波長(zhǎng)計(jì)算相對(duì)增殖率。

1.2.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)6孔板中MEF作為飼養(yǎng)層，mESC接種于飼養(yǎng)層上，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-302a mimic、negative control，轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nmol、200 nmol，24 h后消化收集細(xì)胞，避光染色30 min上機(jī)檢測(cè)。按照Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書的方法，用0.25%的胰蛋白酶(不含EDTA)消化，PBS洗滌，2 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；加入Binding Buffer 500 μL懸浮細(xì)胞，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL，混勻，于室溫避光反應(yīng)5～15 min，在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6細(xì)胞周期檢測(cè)6孔板中MEF作為飼養(yǎng)層，mESC接種于飼養(yǎng)層上，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-302a mimic、negative control，轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nmol、200 nmol，24 h后消化收集細(xì)胞，避光染色30 min上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7Western blot6孔板中MEF作為飼養(yǎng)層，mESC接種于飼養(yǎng)層上，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染miR-302a mimic、negative control，轉(zhuǎn)染濃度分別為50 nmol、200 nmol，24 h后消化收集細(xì)胞，離心，后加入適量的RIPA裂解液，每隔10 min置于渦旋儀中振蕩30 s，40 min后，4 ℃，10 000 r/min離心10 min，小心吸取上清液，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法磚膜。將膜浸入一抗溶液孵育，4 ℃過夜；漂洗后，浸入二抗溶液中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在膜上滴加ECL曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對(duì)各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2結(jié)果

2.1miR-302a在mESC及缺乏葉酸mESC中的表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示，無(wú)葉酸組中miR-302a表達(dá)量顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2miR-302a對(duì)mESC活力影響與對(duì)照組比較，無(wú)葉酸組細(xì)胞活力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無(wú)葉酸組比較，miR-302a組能顯著提高細(xì)胞活力，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

2.3miR-302a對(duì)mESC細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，無(wú)葉酸組中細(xì)胞凋亡增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無(wú)葉酸組比較，miR-302a組細(xì)胞凋亡減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.4miR-302a對(duì)mESC細(xì)胞周期的影響與對(duì)照組比較，無(wú)葉酸組細(xì)胞周期阻滯在G1期，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無(wú)葉酸組比較，miR-302a組中G1期縮短，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1　miR-302a在mESC及缺乏葉酸mESC中的表達(dá)

圖2　miR-302a對(duì)mESC活力影響

表1　miR-302a對(duì)mESC細(xì)胞凋亡的影響

表2　miR-302a對(duì)缺乏葉酸mESC細(xì)胞周期的影響，%)

2.5miR-302a對(duì)mESC細(xì)胞中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，無(wú)葉酸組Akt和mTOR磷酸化水平下降，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無(wú)葉酸組比較，miR-302a組能提高Akt和mTOR磷酸化水平，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.6miR-302a對(duì)mESC中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組比較，無(wú)葉酸組中CyclinD1表達(dá)下調(diào)，p21、p27表達(dá)上調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與無(wú)葉酸組比較，miR-302a組能上調(diào)CyclinD1表達(dá)，下調(diào)p21、p27表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖3　miR-302a對(duì)mESC細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖4　miR-302a對(duì)缺乏葉酸mESC中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3討論

miR-302家族是胚胎干細(xì)胞特異性miRNA，能通過調(diào)控CyclinD1和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，促進(jìn)G1期向S期進(jìn)展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，保持胚胎干細(xì)胞的特性[5]。miR-302首先在mESC中克隆得到，在其他的成年細(xì)胞中均未克隆到，且發(fā)現(xiàn)miR-302只特異性的高表達(dá)于未分化的人胚胎干細(xì)胞、mESC、犬胚胎干細(xì)胞中，一旦進(jìn)入分化階段，其表達(dá)量下降[5-6]。miR-302在ESC中表達(dá)量較高[6]。miR-302在未分化ESC中表達(dá)量較高，分化后表達(dá)量下降[7]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在無(wú)葉酸組中，miR-302a表達(dá)量下降。

細(xì)胞增殖分裂是細(xì)胞重要生命特征之一。胚胎干細(xì)胞細(xì)胞周期G1期較短，與腫瘤細(xì)胞相似，一個(gè)細(xì)胞周期為11 h，G1期只有2 h，整個(gè)細(xì)胞周期活躍，細(xì)胞增殖快速。CyclinD1是G1期關(guān)鍵蛋白，最先在G1期被合成，并且在G0/G1期到S期的進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CyclinD1和細(xì)胞周期依賴蛋白激酶(CDK4)結(jié)合，形成CyclinDa-CDK復(fù)合物，導(dǎo)致CDK的蛋白激酶活化，通過一系列調(diào)控作用，使細(xì)胞通過限制點(diǎn)進(jìn)入S期，引起細(xì)胞分裂。p21和p27是細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑，與CyclinD1競(jìng)爭(zhēng)可Cyclin-CDK復(fù)合物或細(xì)胞增殖抗原的活性，使細(xì)胞不能通過G1期。miR-294/miR-302通過快速調(diào)節(jié)G1期限制點(diǎn)促進(jìn)ESC細(xì)胞增殖，而抑制其分化[8]。在hESCs，miR-302a提高CyclinD1表達(dá)，從而加快G1期，延長(zhǎng)S期[5]。p21是miR-302的已知報(bào)道的靶基因[9]。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，miR-302a mimics可使缺乏葉酸的mESC細(xì)胞CyclinD1表達(dá)量提高，p21和p27表達(dá)量下降，G1期縮短。

已有文獻(xiàn)報(bào)道，未分化狀態(tài)下hESCs的增殖與PI3K/Akt/mTOR的高磷酸化水平有關(guān)[10]。PI3K屬于磷脂酰肌醇依賴激酶家族，可通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以此激活A(yù)kt，而被描述為癌基因的Akt，參與了包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、遷移等在內(nèi)許多基本的細(xì)胞過程。Akt活化后可以促進(jìn)mTOR磷酸化，使其產(chǎn)生應(yīng)答效應(yīng)，調(diào)節(jié)下游通路，使與細(xì)胞周期有關(guān)的蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)細(xì)胞周期跨越G1期，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)及大小[11]。激活PI3K/Akt信號(hào)通路，可明顯抑制細(xì)胞凋亡，并下調(diào)G0/G1期比例，從而維持hESC的存活和增殖[12]。miR-302-367簇通過PI3K/Akt信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[13]。miR-302-367簇通過降低Akt1磷酸化水平，下調(diào)CyclinD1表達(dá)，上調(diào)p27及p21表達(dá)，從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-302a mimics能使缺乏葉酸的mESC中Akt和mTOR磷酸化水平提高，并抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在缺乏葉酸的mESC中miR-302a表達(dá)量下降，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期阻滯在G1期，CyclinD1表達(dá)量下降，p21和p27表達(dá)量上升，Akt/mTOR磷酸化水平下降，當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-302a mimics后，細(xì)胞凋亡率下降，G1期縮短，CyclinD1表達(dá)量上升，p21和p27表達(dá)量下降，Akt/mTOR磷酸化水平提高，說(shuō)明miR-302a可通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。

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Effect of miR-302a on proliferation and apoptosis in folate deficient mouse embryonic stem cell

Yang Qian，Shi Wei△

(Department of Pediatrics,Sichuan Academy of Medical Sciences/SichuanProvincial People′s Hospital,Chengdu,Sichuan 610017,China)

[Abstract]ObjectiveTo explore effect of miR-302a on proliferation and apoptosis in folate deficiency mouse embryonic stem cell (mESC).MethodsThe cases were divided into complete culture medium group (control group),folate-deficient culture medium group (folate-deficient group),folate-deficient culture medium plus miR-302a mimic group (miR-302a group).The expression of miR-302a was examed by RT-PCR in control group and folate-deficient group.To construct miR-302a mimic and then was transfected into the folate-deficient culture medium mESC.Effect of miR-302a mimic on mESC viability was detected by MTT assay，the effect of miR-302a mimic on mESC apoptosis was examed by Annexin V-FITC/PI flow dual-staining method,the effect of miR-302a mimic on mESC cycle was examed by flow cytometry.The activation of phosphatidylinositol 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (AKT)/mammalian target of rapamycin (mTOR) and expression of CyclinD1,p21 and p27 was assayed by Western blot.ResultsThe expression of miR-302a was lower in folate-deficient group(P<0.01).Compared with control group,the viability of mESC was lower,the apoptosis of mESC was higher,the cell cycle was arrested in G1 phase,the level of phosphorylation of AKT and mTOR was lower,the expression of CyclinD1 was lower,the expression of p21 and p27 was higher in folate-deficient group,with statistical significance (P<0.01).Compared with folate-deficient group,the viability of mESC was higher,the apoptosis of mESC was lower,G1 phase was shortened,the level of phosphorylation of AKT and mTOR was higher,the expression of CyclinD1 was higher,the expression of p21 and p27 was lower in miR-302a group with statistical significance (P<0.01).ConclusionThese results suggested miR-302a exerted anti-apoptosis and promote cell proliferation in folate-deficient culture medium,which might be related to PI3K/AKT/mTOR signal pathway.

[Key words]folic acid;mice;embryonic stem cells;proliferaion;apoptosis;miR-302a

doi:論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.11.011

作者簡(jiǎn)介：陽(yáng)倩(1976-),主治醫(yī)師，碩士,主要從事兒科新生兒學(xué)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:shiw200888@126.com。

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1671-8348(2016)11-1477-04

(收稿日期：2015-10-23修回日期：2015-12-20)