• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    停流熒光法研究牛血清白蛋白和葉酸反應(yīng)動力學(xué)

    2016-06-15 16:36:05葉三仙羅云敬喬樹亮劉彩虹史建龍安學(xué)靜
    光譜學(xué)與光譜分析 2016年1期
    關(guān)鍵詞:葉酸常數(shù)白蛋白

    葉三仙, 羅云敬*, 喬樹亮, 李 莉, 劉彩虹, 史建龍,安學(xué)靜

    1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124 2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100123 3. 包頭出入境檢驗檢疫局,內(nèi)蒙古 包頭 014010

    停流熒光法研究牛血清白蛋白和葉酸反應(yīng)動力學(xué)

    葉三仙1, 羅云敬1*, 喬樹亮3, 李 莉2, 劉彩虹2, 史建龍1,安學(xué)靜1

    1. 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,北京 100124 2. 中國檢驗檢疫科學(xué)研究院,北京 100123 3. 包頭出入境檢驗檢疫局,內(nèi)蒙古 包頭 014010

    葉酸屬于B族維生素,作為生物體內(nèi)轉(zhuǎn)移一碳單位酶系中的輔酶,與其他維生素相互作用,共同維持體內(nèi)紅細(xì)胞的穩(wěn)定,對氨基酸之間的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞的分裂生長,蛋白質(zhì)合成的反應(yīng)都有重要意義。藥物半衰期、峰濃度和反應(yīng)速度常數(shù)是研究藥代動力學(xué)的重要參數(shù),實驗運(yùn)用熒光分光光度計和停流光譜分析儀研究了仿生環(huán)境下牛血清白蛋白和葉酸反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù),為葉酸相關(guān)的藥物代謝參數(shù)提供參考。結(jié)果表明:利用Stern-Volmer方程處理熒光猝滅實驗數(shù)據(jù),得到25, 30和37 ℃下葉酸對牛血清白蛋白內(nèi)源熒光的靜態(tài)猝滅常數(shù)分別為2.455×1010,4.900×1010和6.427×1010L·mol-1·s-1;動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)的計算結(jié)果表明不同溫度、pH值和緩沖介質(zhì)下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)都大于100 mol·L-1·s-1,闡明了BSA與葉酸之間的猝滅機(jī)理是通過形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程;生理溫度下,牛血清白蛋白濃度與其初始濃度滿足二級反應(yīng)公式,相關(guān)系數(shù)為0.998 7,藥代半衰期t1/2為0.059 s;反應(yīng)的表觀速率常數(shù)隨著葉酸濃度的增加呈線性增加趨勢,且葉酸催化牛血清白蛋白熒光猝滅的速率常數(shù)kcat=3.174×105mol·L-1·s-1。此外還測定了不同緩沖介質(zhì)下牛血清白蛋白與葉酸相互作用的表觀速率常數(shù)和反應(yīng)速率常數(shù),以此來探討生理介質(zhì)對于二者反應(yīng)的影響,為確定臨床用藥方案、預(yù)測藥物的療效和毒性以及合理用藥有著重要意義。

    牛血清白蛋白;葉酸;熒光光譜;動力學(xué)參數(shù)

    引 言

    葉酸是一種水溶性維生素,它能傳遞一碳基團(tuán)(甲基或甲酰)給脫氧尿苷酸,使之變?yōu)槊撗跣剀账幔M(jìn)而合成DNA。葉酸的缺少會增加未成熟細(xì)胞量,使白血球減少,從而導(dǎo)致紅血球的異常,引起貧血、心臟病、老年性癡呆及胎兒神經(jīng)軟管缺陷等疾病[1-3]。葉酸進(jìn)入機(jī)體后,和各種生物分子結(jié)合在體內(nèi)發(fā)揮作用,如氨基酸、蛋白質(zhì)、受體和核酸等[4]。自1995年Green等證實了葉酸與同型半胱氨酸代謝有著密切的聯(lián)系,以葉酸受體為治療藥物和分子探針方面的研究日益深入,已有部分葉酸的新藥前體進(jìn)入臨床研究階段,但對其作用時間和良好的生物利用度卻不甚明了[5-6]。

    血清白蛋白是血漿中含量最豐富和結(jié)合能力最廣泛的載體蛋白。研究藥物與血清白蛋白相互作用,對于了解藥物在體內(nèi)的存在狀態(tài)、吸收與代謝及藥理作用具有重要意義[7-8]。胡濤英等[9]將經(jīng)典光譜法與內(nèi)濾光校正和分子對接等技術(shù)相結(jié)合,探究了多西環(huán)素與人血清白蛋白的相互作用,為研究相關(guān)藥物小分子的藥理機(jī)制提供了理論依據(jù)。基于葉酸分子對血清白蛋白熒光的猝滅效應(yīng),白海鑫等[10-11]研究了葉酸和血清白蛋白相互作用時的結(jié)合方式、作用力類型和結(jié)合位點數(shù)。付彩霞等[12]研究了葉酸與牛血清白蛋白在含鐵(Ⅲ)環(huán)境中的相互作用。Niki等[13]利用熱力學(xué)原理研究牛血清白蛋白與葉酸相互作用的機(jī)制。尚未見有對血清白蛋白與葉酸反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的報道。在仿生環(huán)境下,運(yùn)用熒光分光光度計研究了葉酸和牛血清白蛋白相互作用時的三維熒光猝滅變化,同時運(yùn)用停流光譜分析儀考察了不同溫度、pH值和緩沖介質(zhì)下牛血清白蛋白的熒光強(qiáng)度隨葉酸濃度的動力學(xué)變化,計算出反應(yīng)的表觀動力學(xué)常數(shù)及速率常數(shù),對葉酸新藥的設(shè)計、篩選提供理論依據(jù)。

    1 實驗部分

    1.1 儀器與試劑

    F-4500熒光分光光度計(日本Hitachi公司),SFM-300/MOS-250停流動力學(xué)裝置與光譜分析系統(tǒng)(法國比奧羅杰公司),Bio-Kine32V4.27動力學(xué)曲線模擬軟件(法國比奧羅杰公司),PHS-25數(shù)顯酸度計(上海精密科學(xué)儀器公司),ER-182A電子天平(上海天平儀器廠),TB-85水浴循環(huán)裝置(日本島津公司),PR020XXM1純水機(jī)(北京PALL純水公司)。

    牛血清白蛋白(BSA)購自美國Sigma公司,葉酸(FA)購自Aladdin公司,低溫避光保存。實驗用水均為二次蒸餾水,實驗測定所用緩沖液為磷酸緩沖液(PBS),其他試劑均為分析純。

    1.2 方法

    1.2.1 熒光分光光度計實驗

    2 μmol·L-1的BSA和2 μmol·L-1的葉酸和一定量的緩沖液按不同比例混合置于水浴中充分反應(yīng),反應(yīng)液中BSA的終濃度是0.4 μmol·L-1。取3 mL反應(yīng)液加入到石英比色皿中測定熒光光譜,激發(fā)波長掃描范圍為220~450 nm,發(fā)射波長掃描范圍為290~550 nm。

    1.2.2 停流光譜分析儀實驗

    50 μmol·L-1的BSA、緩沖液和50 μmol·L-1的葉酸分別注射到停流光譜分析儀的S1、S2和S3三個注射器中,實驗中通過改變?nèi)齻€注射器中反應(yīng)液的比例來控制葉酸的濃度和反應(yīng)總體積,反應(yīng)溶液中BSA的終濃度為12.50 μmol·L-1,葉酸濃度分別為0.00,6.25,12.50,18.75,25.00,31.25和37.50 μmol·L-1,激發(fā)波長為287 nm,發(fā)射波長為343 nm。實驗過程中用停流光譜分析儀自帶的恒溫水浴裝備來控制反應(yīng)過程中的溫度。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 BSA與葉酸相互作用三維熒光光譜分析

    BSA中的Trp,Tyr和Phe殘基能夠發(fā)射內(nèi)源熒光。生理溫度下,三維熒光掃描結(jié)果顯示280 nm的激發(fā)波長下,BSA在發(fā)射波長343 nm處有熒光峰,峰高為1 471[見圖1(a)]。隨著葉酸濃度的逐漸增加,BSA在343 nm處的發(fā)射波長保持不變,但此峰的熒光強(qiáng)度不斷降低,當(dāng)葉酸濃度達(dá)到1.2 μmol·L-1時,BSA的峰高降低到853,熒光強(qiáng)度減弱了42.01%[見圖1(g)],說明葉酸對BSA內(nèi)源熒光有猝滅作用。

    Fig.1 Fluorescence spectra of BSA with different folic acid concentration at 37 ℃

    cFA(a): 0.0, (b): 0.2, (c): 0.4, (d): 0.6, (e): 0.8, (f): 1.0, (g): 1.2 μmol·L-1

    25,30和37 ℃下BSA的三維熒光強(qiáng)度隨葉酸濃度變化的考察結(jié)果顯示:隨著溫度的升高,BSA的峰高降低得更加明顯(圖2),表明溫度升高促進(jìn)了葉酸對BSA的熒光猝滅。

    Fig.2 Fluorescence intensity of BSA with different folic acid concentration at different temperature

    假設(shè)葉酸對BSA的修飾作用是一個熒光動態(tài)猝滅過程,則由圖2的F0/F結(jié)果根據(jù)Stern-Volmer方程式F0/F=1+Kqτ0[FA]做BSA熒光猝滅的曲線。實驗數(shù)據(jù)線性擬合得到的直線斜率代表熒光猝滅過程速率常數(shù)Kq。隨著葉酸濃度的增加,F(xiàn)0/F逐漸增大,且二者呈良好的線性關(guān)系。25,30和37 ℃下擬合得到直線斜率分別為:2.455×1010,4.900×1010和6.427×1010L·mol-1·s-1,線性相關(guān)系數(shù)分別為0.897 8,0.995 9和0.979 1。由數(shù)據(jù)可知,不同溫度下,葉酸和BSA結(jié)合反應(yīng)的Kq都遠(yuǎn)大于各種猝滅劑對生物大分子的最大擴(kuò)散常數(shù)2.000×1010L·mol-1·s-1,且隨著溫度的升高,BSA熒光猝滅常數(shù)增大,表明葉酸對BSA內(nèi)源熒光的猝滅過程不是由擴(kuò)散和碰撞引起的動態(tài)猝滅,而是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。

    2.2 BSA與葉酸相互作用停流熒光光譜分析

    固定BSA的濃度,改變?nèi)~酸的濃度,運(yùn)用停流光譜分析儀掃描混合溶液的熒光光譜。生理溫度下,BSA熒光光譜隨葉酸濃度增大而變化的動力學(xué)曲線(圖3)顯示無葉酸加入時,BSA的熒光強(qiáng)度為5.25 a.u.,且隨著時間的推移,BSA的熒光強(qiáng)度保持不變;隨著葉酸的加入,BSA的熒光強(qiáng)度呈先逐漸下降后平穩(wěn)趨勢,且葉酸濃度越大,下降趨勢越明顯。當(dāng)葉酸濃度為12.50 μmol·L-1時,BSA初始熒光強(qiáng)度為4.79 a.u.,反應(yīng)結(jié)束時的熒光強(qiáng)度平穩(wěn)在3.50左右,當(dāng)葉酸濃度為37.50 μmol·L-1時,BSA的初始熒光強(qiáng)度為3.96 a.u.,反應(yīng)結(jié)束時的熒光強(qiáng)度平穩(wěn)在2.98 a.u.左右。說明葉酸分子使BSA的熒光發(fā)生了猝滅,且猝滅效應(yīng)隨著葉酸濃度的增大而增強(qiáng)。

    Fig.3 Kinetic traces of BSA with different folic acid concentration in 37 ℃

    cFAa: 6.25,b: 12.50,c: 18.75,d: 25.00,e: 31.25,f: 37.50 μmol·L-1)

    用停流光譜分析儀自帶的動力學(xué)曲線模擬軟件Bio-Kine擬合出表觀速率常數(shù),見表1。由表1可見葉酸催化BSA分解的表觀速率常數(shù)隨著葉酸濃度的增加而呈線性增加趨勢。

    由停流動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)公式kobs=k0+kcat[catalyst]線性擬合得直線的斜率為kcat。不同溫度下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)擬合曲線見圖4:溫度為25 ℃時, BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.143×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.989 1;溫度為30 ℃時,k=2.721×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.994 0;溫度為37 ℃時,k=3.174×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.992 5。結(jié)果表明,當(dāng)溫度升高,BSA與葉酸反應(yīng)的速率加快,且反應(yīng)速率在30和37 ℃比25 ℃分別加快26.97%和48.11%。由于BSA和葉酸的反應(yīng)速率常數(shù)恒大于100 mol·L-1·s-1,進(jìn)一步驗證葉酸對BSA內(nèi)源熒光的猝滅過程是形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。

    Table 1 kobs of BSA with different folic acid concentration at different temperature

    Fig.4 kcat of BSA and folic acid at different temperature

    BSA分子由一條單獨(dú)的氨基酸多肽鏈構(gòu)成,其三級結(jié)構(gòu)主要包含3個結(jié)構(gòu)域,即SiteⅠ,SiteⅡ和SiteⅢ,其中SiteⅠ和SiteⅡ兩個結(jié)構(gòu)域與許多小分子化合物具有較強(qiáng)結(jié)合能力,其結(jié)構(gòu)隨溶液pH的改變會發(fā)生改變[14]。在生理溫度下,測定了不同pH值的磷酸緩沖液下BSA與葉酸反應(yīng)的動力學(xué)曲線,并用Bio-Kine軟件擬合出表觀速率常數(shù)(表2)。由數(shù)據(jù)可見,pH值會影響葉酸催化BSA分解的表觀速率常數(shù);不同pH值下,葉酸催化BSA分解的表觀速率常數(shù)都隨著葉酸濃度的增加呈線性增加,且中性環(huán)境下表觀速率常數(shù)較大。

    Table 2 kobs of BSA with different folic acid concentration in different pH

    將表2數(shù)據(jù)代入公式kobs=k0+kcat[catalyst]擬合出不同pH值下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)(圖5):pH 6.5時,BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.201×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.990 8;pH 7.0時,k=2.786×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.996 1;pH 7.5時,k=2.953×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.992 3;pH 8.0時,BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.391×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.992 6。數(shù)據(jù)表明,生理溫度下,磷酸緩沖液為中性時,BSA與葉酸的反應(yīng)速率最快。BSA的熒光強(qiáng)度在微酸性和微堿性范圍內(nèi)發(fā)生改變會影響Trp的量子產(chǎn)率、質(zhì)子解離作用及氨基酸的疏水性和能量傳遞等。由于BSA中Trp和Phe殘基的非極性基團(tuán)的疏水性比Tyr殘基強(qiáng),當(dāng)反應(yīng)體系偏酸性時Trp微環(huán)境的疏水性增強(qiáng),BSA表面疏水性降低;偏堿性時部分Phe殘基微環(huán)境的極性增強(qiáng),將更多疏水性氨基酸殘基暴露在水溶劑中。因此,在研究葉酸藥物時,需要考慮到人體的pH微環(huán)境,以便達(dá)到人體對藥物最大吸收值。

    Fig.5 kcat of BSA and folic acid in different pH of PBS

    人體血液和細(xì)胞液中含有多種鹽類共同維持體內(nèi)酸堿平衡,其中氯化鈉溶液和重碳酸鹽類是含量較多的兩種。實驗中分別測定了BSA與葉酸在0.9%氯化鈉水溶液和25 mMNaHCO3水溶液反應(yīng)的動力學(xué)曲線,并用Bio-Kine軟件擬合出表觀速率常數(shù)(表3)。結(jié)果顯示水溶液中反應(yīng)的表觀速率常數(shù)相對NaCl和NaHCO3溶液較大。

    Table 3 kobs of BSA with different folic acid concentration in different buffer solution

    從各緩沖介質(zhì)下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)(圖6)可以看出:含0.9% NaCl的水溶液,BSA與葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)k=2.748 8×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.995 2;含25 mmol·L-1NaHCO3的水溶液,k=2.677×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.992 8;水溶液,k=2.952×105mol·L-1·s-1,相關(guān)系數(shù)為0.989 5。生理溫度下,BSA與葉酸在水溶液下的反應(yīng)速率比生理介質(zhì)NaCl和CO2溶液中的速率大15.7%和9.3%,說明NaCl和NaHCO3兩種介質(zhì)影響葉酸和BSA結(jié)合速率。由SiteⅡ更利于結(jié)合芳香酸類小分子,可以判斷NaCl和NaHCO3兩種分子應(yīng)該是通過SiteⅠ位點與BSA的結(jié)合,由于葉酸也是結(jié)合在BSA的SiteⅠ位點,因此NaCl和NaHCO3兩種分子和葉酸產(chǎn)生了競爭,降低了葉酸催化BSA的熒光猝滅速率。

    Fig.6 kcat of BSA and folic acid in different buffer solution

    3 結(jié) 論

    運(yùn)用熒光光譜技術(shù)和停流動力學(xué)研究了BSA與葉酸的相互作用。用Stern-Volmer方程處理熒光猝滅實驗數(shù)據(jù),得到25,30和37 ℃下葉酸對BSA的熒光猝滅常數(shù)(Kq值)分別為:2.455×1010,4.900×1010和6.427×1010L·mol-1·s-1;動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)的計算結(jié)果表明:不同溫度、pH值和緩沖介質(zhì)下BSA和葉酸反應(yīng)的速率常數(shù)都大于100 mol·L-1·s-1,闡明了BSA與葉酸之間的猝滅機(jī)理是通過形成復(fù)合物的靜態(tài)猝滅過程。此外,用積分速率方程對BSA和葉酸反應(yīng)的停流動力學(xué)曲線進(jìn)行分析,證實了BSA和葉酸的反應(yīng)屬于二級反應(yīng),并計算出仿生溫度下的藥代半衰期t1/2為0.059 s,且25,30和37 ℃下二級反應(yīng)速率常數(shù)分別為2.143×105,2.721×105和3.174×105mol·L-1·s-1。

    在研究葉酸藥物時應(yīng)該考慮到溫度、pH值和生理介質(zhì)對BSA與葉酸反應(yīng)造成的影響。通過仿生藥物動力學(xué)特征的研究,為確定臨床用藥方案、預(yù)測藥物的療效和毒性以及合理用藥有著重要意義。

    [1] HE Feng, GU Hai-yong, GONG Ding-xu, et al(何 鋒,顧海勇,龔丁旭,等). Molecular Cardiology of China(中國分子心臟病學(xué)), 2012, 4: 249.

    [2] YANG Jiang-fan, YANG Rong-wei, LI-Wei, et al(楊江帆,楊戎威,李 煒,等). Chinese Journal of Neonatology(中國新生兒科), 2007, 22(03): 129.

    [3] FAN Jian, DING Liang-ru(樊 劍,丁良儒). China Foreign Medical Treatment(中外醫(yī)療), 2008, 23: 76.

    [4] WU Mei-chun, WANG Chi(吳鎂春,王 馳). Chinese Journal of New Drugs(中國新藥), 2010, 7: 569.

    [5] Green R, Jacobsen D W. New York: Marcel Dekker, 1995. 99.

    [6] SHI Jian, LI Fen(石 建,李 芬). Chinese General Practice(中國全科醫(yī)學(xué)), 2005, 8(18): 1551.

    [7] Mikelsaar A V, Sunter A, Mikelsaar R, et al. Cell Div., 2012, 7(1): 21.

    [8] Tracy C, Natasha K, Jeremy L, et al. Biochem. J. 2009, 420: 283.

    [9] HU Tao-ying, CHEN Lin, LIU Ying(胡濤英,陳 琳,劉 穎). Spectroscopy and Spectral Analysis(光譜學(xué)與光譜分析),2014, 34(5): 1343.

    [10] BAI Hai-xin, LIU Xiao-hua, YUAN Chao(白海鑫,劉小花,袁 超). Henan Science(河南科學(xué)), 2008, 26(12): 1477.

    [11] DANG Yu-li, LIU Xiao-hua, BAI Hai-xin, et al(黨玉麗,劉小花,白海鑫,等). Journal of Henan Agricultural University(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報), 2010, 44(05): 538.

    [12] FU Cai-xia, GAO Zong-hua, WANG Hai-ying(付彩霞,高宗華,王海英). Chemical Research(化學(xué)研究), 2013, 24(01): 71.

    [13] Niki S J, Nand K J. Chem. Thermodynamics, 2011, 43: 814.

    [14] Christensen U, Holm J, Hansen S I. Biosci. Rep., 2006, 26(4): 291.

    *Corresponding author

    Study of Reaction Dynamics between Bovine Serum Albumin and Folic Acid by Stopped-Flow/Fluorescence

    YE San-xian1, LUO Yun-jing1*, QIAO Shu-liang3, LI Li2, LIU Cai-hong2, SHI Jian-long1, AN Xue-jing1

    1. College of Life Science and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China

    2. Chinese Aeademy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China

    3. Baotou Entry-Exit Inspection and Quarantine, Baotou 014010, China

    As a kind of coenzyme of one-carbon enzymes in vivo, folic acid belongs to B vitamins, which can interact with other vitamins and has great significance for converting among amino acids, dividing growth of cells and protein synthesis reactions. Half-life, concentration and reaction rate constant of drugs are important parameters in pharmacokinetic study. In this paper, by utilizing fluorescence spectrophotometer and stopped-flow spectrum analyzer, reaction kinetic parameters between bovine serum albumin(BSA) and folic acid in a bionic system have been investigated, which provide references for parameters of drug metabolism related to folic acid. By using Stern-Volmer equation dealing with fluorescence quenching experiments data, we concluded that under 25, 30, and 37 ℃, the static quenching constants of folic acid to intrinsic fluorescence from bovine serum albumin were 2.455×1010, 4.900×1010and 6.427×1010L·mol-1·s-1respectively; The results of kinetic reaction rate have shown that the reaction rate of BSA and folic acid are greater than 100 mol·L-1·s-1at different temperatures, pH and buffering media, illustrating that the quenching mechanism between BSA and folic acid is to form composite static quenching process. Reaction concentration of bovine serum albumin and its initial concentration were equal to the secondary reaction formula, and the correlation coefficient was 0.998 7, while the half-life (t1/2) was 0.059 s at physiological temperature. With the increase of folic acid concentration, the apparent rate constant of this reaction had a linear increasing trend, the BSA fluorescence quenching rate constant catalyzed by folic acid was 3.174×105mol·L-1·s-1. Furthermore, with different buffer, the apparent rate constant and reaction rate constant of BSA interacting with folic acid were detected to explore the influence on the reaction under physiological medium, which is of great significance to determine the clinical regimen, forecast the efficacy and toxicity of drugs and rational drug.

    BSA (Bovine Serum Albumin); Folic acid; Fluorescence spectra; Kinetic parameter

    Oct. 10, 2014; accepted Jan. 25, 2015)

    2014-10-10,

    2015-01-25

    北京市教育委員會科技計劃面上項目(KM201210005032)和北京市自然科學(xué)基金項目(2102005)資助

    葉三仙, 女,1988年生,北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院碩士研究生 e-mail: 450212535@qq.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: luoyj@bjut.edu.cn

    O657.3

    A

    10.3964/j.issn.1000-0593(2016)01-0134-06

    猜你喜歡
    葉酸常數(shù)白蛋白
    喜舒復(fù)白蛋白肽飲品助力大健康
    關(guān)于Landau常數(shù)和Euler-Mascheroni常數(shù)的漸近展開式以及Stirling級數(shù)的系數(shù)
    缺血修飾白蛋白和肌紅蛋白對急性冠狀動脈綜合征的早期診斷價值
    準(zhǔn)備懷孕前3個月還不補(bǔ)葉酸就晚了
    正在備孕的你,葉酸補(bǔ)對了嗎
    準(zhǔn)備懷孕前3個月還不補(bǔ)葉酸就晚了
    用獼猴桃補(bǔ)葉酸?未必適合你
    媽媽寶寶(2017年4期)2017-02-25 07:01:16
    幾個常數(shù)項級數(shù)的和
    萬有引力常數(shù)的測量
    白蛋白不可濫用
    祝您健康(2014年9期)2014-11-10 17:29:39
    一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲国产欧美在线一区| 丰满少妇做爰视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| kizo精华| 国产精品 国内视频| 操美女的视频在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲七黄色美女视频| 99久久精品国产亚洲精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日韩免费高清中文字幕av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲国产精品国产精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美日韩福利视频一区二区| 啦啦啦在线免费观看视频4| 啦啦啦啦在线视频资源| 欧美黑人精品巨大| 精品福利永久在线观看| 精品久久蜜臀av无| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 天天添夜夜摸| 亚洲美女视频黄频| 嫩草影院入口| 无遮挡黄片免费观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 少妇人妻久久综合中文| 午夜91福利影院| 老司机靠b影院| 男女床上黄色一级片免费看| av在线观看视频网站免费| 免费黄色在线免费观看| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| av天堂久久9| 国产精品免费视频内射| 亚洲男人天堂网一区| 日韩一本色道免费dvd| 日韩中文字幕视频在线看片| 热99国产精品久久久久久7| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 波野结衣二区三区在线| 亚洲成国产人片在线观看| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产在线一区二区三区精| 欧美日本中文国产一区发布| 婷婷色综合大香蕉| 丝袜美足系列| 欧美av亚洲av综合av国产av | 亚洲欧洲日产国产| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久av网站| 大香蕉久久成人网| 亚洲精品久久午夜乱码| 免费黄网站久久成人精品| 成年人免费黄色播放视频| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久午夜综合久久蜜桃| 丝袜在线中文字幕| 人体艺术视频欧美日本| 精品午夜福利在线看| 又黄又粗又硬又大视频| h视频一区二区三区| 久久久久久久久久久久大奶| 在线观看国产h片| 国产精品免费视频内射| 在线天堂中文资源库| 哪个播放器可以免费观看大片| 亚洲精品久久午夜乱码| 91成人精品电影| 在线天堂最新版资源| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品一区二区在线观看99| 国产国语露脸激情在线看| 国产1区2区3区精品| 国产一级毛片在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本vs欧美在线观看视频| 好男人视频免费观看在线| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 丝袜美腿诱惑在线| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 美女国产高潮福利片在线看| 另类亚洲欧美激情| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲,一卡二卡三卡| 午夜精品国产一区二区电影| 精品国产乱码久久久久久男人| 少妇的丰满在线观看| 欧美乱码精品一区二区三区| avwww免费| 国产福利在线免费观看视频| 久久久精品94久久精品| 性色av一级| 久久久久精品人妻al黑| 日本一区二区免费在线视频| 高清欧美精品videossex| 日本91视频免费播放| 亚洲第一区二区三区不卡| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 亚洲一区中文字幕在线| 青春草视频在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 精品一区在线观看国产| 亚洲欧美激情在线| 五月开心婷婷网| 亚洲国产av影院在线观看| 一级毛片我不卡| 丝袜喷水一区| 这个男人来自地球电影免费观看 | 性高湖久久久久久久久免费观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美日韩av久久| 亚洲人成网站在线观看播放| 91国产中文字幕| 精品少妇久久久久久888优播| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产成人精品无人区| svipshipincom国产片| 国产日韩欧美视频二区| 女性生殖器流出的白浆| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av不卡在线播放| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲精品视频女| 久久午夜综合久久蜜桃| 成年av动漫网址| 国产精品av久久久久免费| 日韩中文字幕视频在线看片| 秋霞在线观看毛片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 777米奇影视久久| 午夜激情av网站| 欧美激情 高清一区二区三区| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲欧美一区二区三区久久| 蜜桃在线观看..| 超色免费av| 国产99久久九九免费精品| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日韩av不卡免费在线播放| 综合色丁香网| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久99精品国语久久久| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产色婷婷99| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 久久天堂一区二区三区四区| 亚洲天堂av无毛| 咕卡用的链子| 在线观看免费视频网站a站| 制服诱惑二区| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲第一青青草原| 人人妻人人澡人人看| 老司机深夜福利视频在线观看 | 亚洲成人免费av在线播放| 精品福利永久在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 国产免费又黄又爽又色| 青草久久国产| 亚洲四区av| 一区二区日韩欧美中文字幕| 黄片无遮挡物在线观看| 亚洲国产欧美网| 国产xxxxx性猛交| 在线观看免费日韩欧美大片| 我要看黄色一级片免费的| 成人午夜精彩视频在线观看| 香蕉国产在线看| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲第一av免费看| 99精品久久久久人妻精品| 9191精品国产免费久久| 熟女av电影| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| 在线天堂中文资源库| 一本色道久久久久久精品综合| 欧美精品亚洲一区二区| 国产探花极品一区二区| 欧美另类一区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 一级,二级,三级黄色视频| 高清不卡的av网站| 赤兔流量卡办理| 免费在线观看黄色视频的| 老司机亚洲免费影院| 尾随美女入室| 一边亲一边摸免费视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 亚洲精品,欧美精品| 9191精品国产免费久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 七月丁香在线播放| 秋霞在线观看毛片| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜91福利影院| 国产成人午夜福利电影在线观看| 十分钟在线观看高清视频www| 国产乱来视频区| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美激情高清一区二区三区 | 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 一边亲一边摸免费视频| av在线app专区| 超色免费av| 无限看片的www在线观看| 欧美人与善性xxx| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品在线美女| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 国产亚洲av高清不卡| 国产一区二区激情短视频 | 最近最新中文字幕免费大全7| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 精品国产露脸久久av麻豆| 欧美精品av麻豆av| 欧美97在线视频| 日韩伦理黄色片| 亚洲精品日本国产第一区| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 久久99精品国语久久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产男女超爽视频在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 中文欧美无线码| 在线 av 中文字幕| 久久国产精品大桥未久av| 国产视频首页在线观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 秋霞在线观看毛片| 欧美精品人与动牲交sv欧美| av国产久精品久网站免费入址| kizo精华| 多毛熟女@视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美xxⅹ黑人| 9191精品国产免费久久| 在线天堂中文资源库| 国产精品三级大全| 欧美精品高潮呻吟av久久| 69精品国产乱码久久久| 国产日韩欧美视频二区| 色精品久久人妻99蜜桃| 丝袜脚勾引网站| 国产成人精品在线电影| 日日摸夜夜添夜夜爱| 欧美黑人精品巨大| 亚洲av福利一区| 老汉色∧v一级毛片| 满18在线观看网站| 欧美乱码精品一区二区三区| videosex国产| 青青草视频在线视频观看| 精品视频人人做人人爽| 精品久久蜜臀av无| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 中文字幕人妻熟女乱码| 韩国高清视频一区二区三区| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美精品亚洲一区二区| 国产成人精品久久二区二区91 | 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 在线免费观看不下载黄p国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 免费不卡黄色视频| av线在线观看网站| 免费在线观看黄色视频的| 亚洲三区欧美一区| 亚洲精品视频女| 超碰成人久久| xxxhd国产人妻xxx| 精品一区二区三卡| 欧美中文综合在线视频| 亚洲欧美色中文字幕在线| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 黄色 视频免费看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美日韩精品网址| 伊人亚洲综合成人网| av在线播放精品| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲综合色网址| 18禁观看日本| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产一级毛片在线| 两性夫妻黄色片| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 午夜日本视频在线| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 一区二区三区精品91| 老司机影院成人| 成人亚洲欧美一区二区av| 啦啦啦在线免费观看视频4| 人妻一区二区av| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 精品一区二区三卡| 高清av免费在线| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产极品粉嫩免费观看在线| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国产精品99久久99久久久不卡 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 我的亚洲天堂| 亚洲视频免费观看视频| 丰满乱子伦码专区| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产淫语在线视频| 久久久国产一区二区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品人妻久久久影院| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲精品乱久久久久久| 国产又爽黄色视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 十八禁高潮呻吟视频| av福利片在线| 欧美成人精品欧美一级黄| 只有这里有精品99| 日韩一区二区三区影片| 亚洲精品视频女| 热99国产精品久久久久久7| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 精品少妇内射三级| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄色视频不卡| 一二三四中文在线观看免费高清| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 卡戴珊不雅视频在线播放| 日本黄色日本黄色录像| 国产1区2区3区精品| 在线天堂中文资源库| 看免费av毛片| 捣出白浆h1v1| 综合色丁香网| 国产一区二区激情短视频 | 两个人看的免费小视频| 十八禁网站网址无遮挡| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 十八禁网站网址无遮挡| 久久国产亚洲av麻豆专区| 91精品三级在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 超碰成人久久| 美女大奶头黄色视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 超碰97精品在线观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产日韩欧美视频二区| 波多野结衣一区麻豆| 18禁动态无遮挡网站| 99热国产这里只有精品6| 18禁动态无遮挡网站| 又大又黄又爽视频免费| 亚洲少妇的诱惑av| 国产精品人妻久久久影院| 精品一区二区三卡| 国产精品人妻久久久影院| 日韩视频在线欧美| svipshipincom国产片| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| 中文字幕av电影在线播放| 在线天堂中文资源库| 国产免费视频播放在线视频| 国产有黄有色有爽视频| 9热在线视频观看99| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲第一青青草原| 一区二区三区四区激情视频| 黑丝袜美女国产一区| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品偷伦视频观看了| 久久久精品区二区三区| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 妹子高潮喷水视频| 99精品久久久久人妻精品| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 美女视频免费永久观看网站| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 赤兔流量卡办理| 精品第一国产精品| 黄色一级大片看看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 男女下面插进去视频免费观看| 国产精品免费视频内射| 波多野结衣一区麻豆| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲伊人色综图| 七月丁香在线播放| 日韩一区二区视频免费看| 丰满乱子伦码专区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产1区2区3区精品| 最近中文字幕2019免费版| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 飞空精品影院首页| 最近最新中文字幕免费大全7| 男女无遮挡免费网站观看| 成人影院久久| 国产探花极品一区二区| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲成人免费av在线播放| 99久久精品国产亚洲精品| 天天影视国产精品| 久久久久精品国产欧美久久久 | 韩国av在线不卡| 欧美日韩视频精品一区| 亚洲国产精品国产精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 免费观看av网站的网址| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲熟女精品中文字幕| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲,欧美,日韩| 大片免费播放器 马上看| 男女免费视频国产| 青春草国产在线视频| 99精品久久久久人妻精品| 国产野战对白在线观看| 美女扒开内裤让男人捅视频| avwww免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 啦啦啦 在线观看视频| 热re99久久国产66热| 大话2 男鬼变身卡| 一边摸一边做爽爽视频免费| 看非洲黑人一级黄片| 如何舔出高潮| 美国免费a级毛片| 在线看a的网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 免费在线观看黄色视频的| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产片内射在线| 精品少妇黑人巨大在线播放| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品视频女| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲国产欧美在线一区| 国产精品二区激情视频| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲精品一区蜜桃| 丰满乱子伦码专区| 成人亚洲精品一区在线观看| av女优亚洲男人天堂| 午夜av观看不卡| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| svipshipincom国产片| 在线天堂中文资源库| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 国产野战对白在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产 精品1| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产视频首页在线观看| 天天添夜夜摸| 国产亚洲av高清不卡| 精品国产一区二区久久| videos熟女内射| 高清av免费在线| 国产在线视频一区二区| www日本在线高清视频| 欧美日韩成人在线一区二区| 涩涩av久久男人的天堂| 久久影院123| 女人久久www免费人成看片| 日本欧美国产在线视频| 亚洲天堂av无毛| 天天影视国产精品| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产av精品麻豆| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 人妻 亚洲 视频| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人精品无人区| 欧美 日韩 精品 国产| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩免费高清中文字幕av| 欧美日韩成人在线一区二区| 在线观看人妻少妇| 国产激情久久老熟女| 亚洲在久久综合| 一本久久精品| 只有这里有精品99| 少妇精品久久久久久久| 丰满迷人的少妇在线观看| 久久国产精品大桥未久av| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜老司机福利片| 日韩欧美一区视频在线观看| 99久久综合免费| 日韩人妻精品一区2区三区| 成年av动漫网址| 欧美少妇被猛烈插入视频| 伦理电影大哥的女人| 日本黄色日本黄色录像| 最近手机中文字幕大全| 香蕉国产在线看| 日本欧美视频一区| 久久久久久久精品精品| 在线天堂最新版资源| 亚洲精品在线美女| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 捣出白浆h1v1| 曰老女人黄片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产精品国产av在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久久99精品国语久久久| 国产成人系列免费观看| 一区二区三区四区激情视频| 电影成人av| 亚洲专区中文字幕在线 | 欧美人与善性xxx| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99精品久久久久人妻精品| 秋霞伦理黄片| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 一区二区三区精品91| 国产精品久久久av美女十八| 久久97久久精品| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品亚洲成a人片在线观看| 夫妻午夜视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 狂野欧美激情性xxxx| 黄色视频不卡| 少妇人妻精品综合一区二区| 久久久久精品久久久久真实原创| 热99久久久久精品小说推荐| 婷婷色综合www| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产免费又黄又爽又色| 91精品国产国语对白视频| 亚洲av中文av极速乱| 一个人免费看片子| 啦啦啦在线免费观看视频4| 麻豆av在线久日| 波多野结衣av一区二区av| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 波多野结衣av一区二区av| 国精品久久久久久国模美| 视频在线观看一区二区三区| 久久久国产欧美日韩av| 国精品久久久久久国模美| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲国产精品一区三区| 满18在线观看网站| 99久久人妻综合| 精品一区二区三区av网在线观看 | 午夜日韩欧美国产| 超色免费av| 男女无遮挡免费网站观看| 亚洲欧美一区二区三区久久| 日本色播在线视频| 国产淫语在线视频| 丰满少妇做爰视频| 婷婷色综合大香蕉| 1024香蕉在线观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 成年人免费黄色播放视频| 亚洲精品第二区| 亚洲精品乱久久久久久| 女人久久www免费人成看片|