魔芋根域優(yōu)勢真菌鑒定和化感作用及其生防放線菌的篩選

何　斐,張忠良,崔　鳴,薛泉宏

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院,b 林學(xué)院,c 資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2 秦巴魔芋研究開發(fā)中心,陜西 安康 725000)

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魔芋根域優(yōu)勢真菌鑒定和化感作用及其生防放線菌的篩選

何斐1a,張忠良1b,崔鳴2,薛泉宏1c

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) a 生命科學(xué)學(xué)院,b 林學(xué)院,c 資源環(huán)境學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2 秦巴魔芋研究開發(fā)中心,陜西 安康 725000)

[摘要]【目的】 探索魔芋軟腐病株根區(qū)、根表土壤及根系大量存在的優(yōu)勢真菌F3和F8是否具有致病性和化感活性；篩選針對該優(yōu)勢真菌及魔芋軟腐病原細(xì)菌的高效廣譜生防放線菌?！痉椒ā?從魔芋健株和病株中分離F3和F8菌株，根據(jù)菌落形態(tài)及rDNA-ITS序列分析對2株真菌進(jìn)行鑒定；離體侵染法測定菌株對魔芋球莖及胡蘿卜離體組織的致病性；測定真菌粗毒素溶液對甜瓜種子萌發(fā)、幼苗生長的化感活性；采用瓊脂塊和發(fā)酵濾液法篩選能拮抗優(yōu)勢病原真菌和魔芋軟腐病原細(xì)菌的生防放線菌?！窘Y(jié)果】 ①在魔芋軟腐病株根區(qū)、根表土壤及根系中存在大量的F3和F8，經(jīng)鑒定，2株真菌分別為腐皮鐮刀菌(Fusarium solani)和尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，其發(fā)酵粗濾液對魔芋離體球莖及胡蘿卜有致病性，其粗毒素溶液能抑制甜瓜種子萌發(fā)和幼苗生長。②篩選得到6株對優(yōu)勢病原真菌鐮刀菌和魔芋軟腐病原細(xì)菌均有較強(qiáng)拮抗作用的生防放線菌?！窘Y(jié)論】 魔芋軟腐病株根區(qū)、根表土壤及根系大量存在的優(yōu)勢真菌腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌具有致病性和化感抑制活性，是魔芋軟腐病發(fā)生時(shí)的復(fù)合侵染有害菌之一；以2株鐮刀菌為靶標(biāo)菌篩選到的6株生防放線菌對魔芋軟腐病株根域大量存在的優(yōu)勢有害真菌及軟腐病原細(xì)菌均有較強(qiáng)的拮抗作用。

[關(guān)鍵詞]魔芋；軟腐病；腐皮鐮刀菌；尖孢鐮刀菌；化感作用；復(fù)合侵染

魔芋是重要的經(jīng)濟(jì)作物，目前我國魔芋種植面積居世界第一。隨著種植面積及連作年限增加，魔芋病蟲害日益嚴(yán)重。軟腐病是普遍發(fā)生、危害最嚴(yán)重的魔芋土傳和種傳病害[1-2]。軟腐病害的發(fā)生與軟腐病原細(xì)菌致病有直接關(guān)系，也與魔芋根區(qū)、根表土壤和根系微生物區(qū)系異常密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在同一田塊，生態(tài)條件及農(nóng)藝措施基本相同，但魔芋軟腐病株與健株根域的微生物區(qū)系存在顯著差異(擬另文報(bào)道)，其中有2株優(yōu)勢真菌F3和F8在病株根區(qū)、根表土壤及根系中大量存在，但在健株的相同部位未檢出或數(shù)量很少。本研究擬對F3和F8 2株真菌進(jìn)行分類鑒定，探索其是否具有致病性及化感活性，并篩選出對該菌及軟腐細(xì)菌具有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌，以期為魔芋軟腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)，并為魔芋軟腐病的防治提供生防菌株。

1材料與方法

1.1材料

供試放線菌：共662株，其中638株分離自陜西省嵐皋縣與鎮(zhèn)安縣農(nóng)田魔芋、刺槐林魔芋根域土壤，24株來自本研究室的拮抗放線菌種質(zhì)資源庫。

軟腐病原細(xì)菌：菊果膠桿菌(Pectobacteriumchrysanthemi，編號CZS-B6)、菊歐文氏菌(Dickeyadadantii，編號CZS-B4)及菊歐氏桿菌(Erwiniachrysanthemi，編號分別為CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2)[3]。以上6株菌均由西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物資源研究室分離鑒定并保存，其16S rRNA基因序列在GenBank的登錄號依次為KJ145869、KJ145868、KJ145864、KJ145865、KJ145866及KJ145867。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基(BPA)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、高氏1號瓊脂培養(yǎng)基(GA)和高氏1號液體培養(yǎng)基[4]。

1.2魔芋根域優(yōu)勢真菌的分離、鑒定及化感作用

1.2.1真菌分離2011-08在陜西省嵐皋縣藺河鄉(xiāng)立新村刺槐林下及魔芋農(nóng)田，選取健康(Healthy plant，HP)和具有典型軟腐癥狀(Diseased plant，DP)的魔芋植株，分別采集魔芋全植株及根際土壤帶回實(shí)驗(yàn)室及時(shí)分離。參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行樣品處理和根區(qū)、根表土壤及根系優(yōu)勢真菌的分離。病株(DP)優(yōu)勢真菌數(shù)量、比例較健株(HP)的增率均用ΔHP表示，按公式(1)計(jì)算：

(1)

1.2.2優(yōu)勢真菌鑒定對于分離得到的2株優(yōu)勢真菌F3和F8進(jìn)行培養(yǎng)特征觀察，將真菌于PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，觀察菌落顏色等特征。

rDNA-ITS序列分析：CTAB法[6]提取F3和F8菌株DNA，用真菌通用引物(ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4:5′-TCCTCCGC-TTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。用Blast方法從GenBank數(shù)據(jù)庫中調(diào)取相關(guān)同源性高的序列，采用ClustalX 2.0軟件對獲得的序列進(jìn)行序列同源性分析，用Mega 5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3真菌致病性檢測真菌粗濾液制備：將斜面上活化的優(yōu)勢真菌F3和F8接種至100 mL液體PDA培養(yǎng)基，28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)7 d，雙層無菌紗布過濾得粗濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

真菌致病性：挑選健康魔芋和胡蘿卜用自來水沖洗干凈，750 mL/L 乙醇浸泡30 s，1 g/L升汞消毒3 min，無菌水沖洗6次。用直徑1.5 cm無菌打孔器切取魔芋圓柱塊；用無菌手術(shù)刀將胡蘿卜切成厚度約1 cm的組織片，再用直徑7 mm的無菌打孔器在胡蘿卜片中央打孔，孔深度約為胡蘿卜組織片厚度的4/5。將魔芋圓柱塊和胡蘿卜片用無菌水反復(fù)沖洗10次，分別置于裝有無菌水保濕的雙層濾紙培養(yǎng)皿中，每皿3個組織片(3個組織片分別來自不同的魔芋或胡蘿卜個體)，每處理3次重復(fù)。用無菌槍頭吸取30 μL真菌粗濾液穿刺接種魔芋圓柱塊[7]，取100 μL真菌粗濾液接種至胡蘿卜片中央小孔，以無菌水為對照，28 ℃保濕培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況[8]。

1.2.4真菌粗毒素的化感作用真菌粗毒素溶液的制備：將斜面上活化好的真菌F3和F8分別接種于100 mL液體PDA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d，無菌雙層紗布過濾。濾液經(jīng)121 ℃高溫濕熱滅菌20 min，得到真菌粗毒素溶液，4 ℃保存?zhèn)溆?。試?yàn)時(shí)將供試粗毒素溶液用無菌水依次稀釋1，10，102，103和104倍，以無菌水(CK1)和液體PDA培養(yǎng)基無菌濾液(CK2)為對照[9]。

以甜瓜為指示植物進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。選取顆粒飽滿、大小一致的甜瓜種子，經(jīng)100 g/L NaOCl消毒2 min，用無菌水反復(fù)沖洗5次后置于裝有5 mL不同稀釋倍數(shù)真菌粗毒素溶液的試管中。每處理重復(fù)3個試管，每試管10粒種子，以無菌水(CK1)和液體PDA培養(yǎng)基無菌濾液(CK2)為對照。于28 ℃避光浸種24 h后，無菌水反復(fù)沖洗種子5次，用無菌濾紙吸干表面水分。將種子按照不同處理分別放入加有1 mL無菌水浸潤滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，28 ℃培養(yǎng)96 h后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率，測量甜瓜幼苗胚根、胚軸長度，稱取鮮質(zhì)量。根據(jù)下式分別計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)[10]、簡明活力指數(shù)[11]、側(cè)根數(shù)及處理較對照的增幅ΔCK。

(2)

(3)

式中：Gt為每天發(fā)芽數(shù)；Dt為與Gt相對應(yīng)的天數(shù)。

簡明活力指數(shù)=發(fā)芽率×胚根長度(mm)；

(4)

(5)

式中：LT為處理的各指標(biāo)，LCK為對照的相應(yīng)指標(biāo)。

1.3拮抗放線菌的篩選

1.3.1拮抗性放線菌對優(yōu)勢真菌的拮抗作用放線菌瓊脂塊制備:挑取少量活化的放線菌，于已滴加0.1 mL無菌水的高氏1號培養(yǎng)皿上，涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)7 d，用直徑5 mm打孔器制成菌餅，備用。

優(yōu)勢真菌菌懸液的制備：向已培養(yǎng)4 d的優(yōu)勢真菌斜面中加入5 mL無菌水，用滅菌竹簽將菌絲刮下、磨碎，攪勻制成菌懸液備用。

拮抗放線菌瓊脂塊初篩：采用瓊脂塊法進(jìn)行初篩[12]。用1 mL無菌吸管吸取0.1 mL優(yōu)勢真菌菌懸液于PDA平皿上，涂布均勻，將已制備的放線菌瓊脂塊菌面向上接種于平皿中央。28 ℃培養(yǎng)4 d，待優(yōu)勢真菌均勻長滿整個平皿后，采用十字交叉法測定拮抗環(huán)寬度(Width,W)，觀察拮抗圈透明度(Transparence，T)。拮抗圈的透明程度表示靶標(biāo)菌(優(yōu)勢真菌)被抑制的程度：完全被抑制，表現(xiàn)為透明，用“++”表示；部分被抑制，表現(xiàn)為出現(xiàn)抑菌圈，但其中仍有菌絲生長，呈半透明，用“+”表示。按公式(6)計(jì)算拮抗環(huán)寬度(W)：

(6)

式中：D為抑菌圈直徑。

拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液的制備[12]：將初篩得到的拮抗放線菌于高氏1號斜面培養(yǎng)7 d，加無菌水5 mL，用無菌竹簽將孢子刮下，攪勻制成孢子懸液。用無菌吸管吸1 mL孢子懸液于裝有60 mL高氏1號液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，4層紗布封口，重復(fù)3瓶。28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d，依次用濾紙過濾、0.45 μm微孔濾膜真空抽濾、0.45 μm滅菌微孔濾膜過濾除菌得無菌發(fā)酵濾液。

優(yōu)勢真菌瓊脂塊的制備：向已培養(yǎng)4 d的優(yōu)勢真菌斜面加入5 mL無菌水，用滅菌竹簽將菌絲刮下、攪勻。用1 mL無菌吸管吸取0.1 mL菌懸液于PDA平皿上，用刮鏟涂布均勻，28 ℃培養(yǎng)4 d后，用打孔器制成5 mm菌餅。

拮抗放線菌無菌發(fā)酵濾液的抑菌試驗(yàn)：將放線菌無菌發(fā)酵濾液與冷卻至50 ℃的PDA培養(yǎng)基按體積比1∶4混勻后倒平板，以無菌水代替放線菌無菌發(fā)酵濾液為對照。用滅菌竹簽挑取優(yōu)勢真菌瓊脂塊菌面向下接種于平皿中央，每處理重復(fù)3次。28 ℃培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24，48，72 h后采用十字交叉法測量菌落直徑，按公式(7)計(jì)算抑菌率：

(7)

1.3.2拮抗放線菌對軟腐病原菌的拮抗作用將初篩得到的拮抗放線菌于高氏1號斜面培養(yǎng)7 d，加無菌水5 mL，用無菌竹簽將孢子刮下，攪勻制成孢子懸液，均勻涂布于高氏1號平皿，28 ℃倒置培養(yǎng)8 d，用打孔器制成7 mm菌餅。

軟腐病菌菌懸液制備：將單個病原細(xì)菌克隆接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h后，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加無菌水懸浮細(xì)菌。用A600光密度比濁法制備密度為108CFU/mL的菌懸液，備用。

拮抗放線菌對軟腐病菌的拮抗作用：用1 mL無菌吸管吸取0.1 mL軟腐病菌菌懸液于PDA平皿上，用刮鏟涂布均勻。再將制成的放線菌菌餅菌面向上接種于靶標(biāo)病原細(xì)菌平皿上，28 ℃正置培養(yǎng)1 d，觀察拮抗圈透明度(Transparence，T)。拮抗圈的透明程度表示病原菌被抑制的程度：完全被抑制，表現(xiàn)為透明，用“++”表示；部分被抑制，表現(xiàn)為出現(xiàn)抑菌圈，但其中仍有病原菌生長，呈半透明，用“+”表示。采用十字交叉法測量拮抗圈直徑(Diameter,D)，按公式(8)計(jì)算拮抗環(huán)寬度(Width,W)[13]：

(8)

2結(jié)果與分析

2.1優(yōu)勢真菌在魔芋根域的分布

根域指根系密集分布的區(qū)域，包括作物根系及根區(qū)、根表土壤[4]。本研究從健康和軟腐病魔芋植株根域土壤中發(fā)現(xiàn)2株優(yōu)勢真菌F3和F8。由表1可知，真菌F3和F8在魔芋軟腐病株與健株根區(qū)、根表土壤及根系的分布存在明顯差異。其中，真菌F3在軟腐病株根區(qū)土壤中的檢出量較農(nóng)田和刺槐林健株分別增加216.7%和1 325.0%，差異均顯著(P<0.05)；在病株根表土壤中的數(shù)量較農(nóng)田健株增加37.8%，差異顯著(P<0.05)，但刺槐林健株未檢出。病株根表土壤真菌F8的數(shù)量較農(nóng)田和刺槐林健株分別增加97.9%和330.3%，差異顯著(P<0.05)，且病株真菌F8在根區(qū)土壤及根系中的檢出量分別為33.8×102和0.7×102CFU/g，但在農(nóng)田和刺槐林健株根區(qū)土壤及根系均未檢出。由此推測，魔芋軟腐病株發(fā)病與其根區(qū)、根表土壤和根系中存在的真菌F3和F8有關(guān)，2株真菌可能具有一定的致病性。

表 1　菌株F3和F8在魔芋根區(qū)、根表土壤及根系中的分布

注：同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note:Different lowercase letters in each column indicate significant difference (P<0.05).

2.2魔芋根域優(yōu)勢真菌的鑒定

對從魔芋根域分離得到的2株優(yōu)勢真菌F3和F8進(jìn)行培養(yǎng)特征觀察，結(jié)果見圖1。由圖1可見，魔芋根域優(yōu)勢真菌F3和F8在PDA培養(yǎng)基上生長5 d后，菌株F3菌絲平鋪致密茂盛，氣絲白色、中間微淺黃色，基絲黃色。菌株F8菌落突起呈絮狀，菌絲微黃色致密茂盛，基絲淺黃色。

圖 1　菌株F3(左)和F8(右)的形態(tài)特征觀察

從圖2可以看出，菌株F3與叢赤殼屬(Nectria)和鐮刀菌屬(Fusarium)真菌聚在同一分支，其與腐皮鐮刀菌(F.solani)相似度最大(100.0%)，結(jié)合其菌落形態(tài)特征，將菌株F3鑒定為腐皮鐮刀菌。菌株F8與鐮刀菌屬(Fusarium)相關(guān)菌株聚在同一分支，其與尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)的相似度最大(100.0%)，結(jié)合形態(tài)特征，將菌株F8鑒定為尖孢鐮刀菌。優(yōu)勢真菌F3和F8 的rDNA-ITS序列GenBank登錄號分別為KJ145882和KJ145886。

圖 2基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的真菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.2Phylogenetic tree of fungi based on rDNA-ITS sequence

2.3魔芋根域優(yōu)勢真菌的致病性

由表2和圖3可以看出，供試真菌腐皮鐮刀菌(F3)和尖孢鐮刀菌(F8)對魔芋球莖和胡蘿卜組織具有一定的致病性。接種鐮刀菌的魔芋球莖腐爛變軟，有酒味和惡臭味，接種鐮刀菌的胡蘿卜病變組織呈黑褐色軟腐，未接種對照無病癥。2株鐮刀菌對魔芋球莖侵染速度基本一致，尖孢鐮刀菌(F8)對胡蘿卜組織的致病作用較腐皮鐮刀菌(F3)明顯。

表 2　優(yōu)勢真菌菌株F3和F8的致病性檢測

注：“-、+、++及+++”分別表示未侵染、1/3以下軟腐、1/3～2/3軟腐及2/3以上軟腐。

Note:“-, +, ++ and +++” represent uninfected,soft rot area less than 1/3,soft rot area from 1/3 to 2/3 and soft rot area more than 2/3,respectively.

圖 3菌株F3和F8的致病性表現(xiàn)

A1-A3.分別為無菌水對照、F3和F8對魔芋球莖的致病性；B1-B3.分別為無菌水對照、F3和F8對胡蘿卜的致病性

Fig.3Pathogenicity of isolates F3 and F8

A1-A3.Pathogenicity of sterile water (control),F3 and F8 onA.konjaccorm,respectively;B1-B3.Pathogenicity of sterile water (control),F3 and F8 on carrot,respectively

2.4鐮刀菌毒素的化感作用

2.4.1對甜瓜種子萌發(fā)的抑制作用由表3可以看出，腐皮鐮刀菌(F3)、尖孢鐮刀菌(F8)不同稀釋倍數(shù)毒素濾液處理甜瓜種子萌發(fā)均受到抑制。F3毒素濾液不同稀釋倍數(shù)處理甜瓜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、簡明活力指數(shù)及幼苗側(cè)根數(shù)分別較對照降低3.7%～33.3%，2.6%～28.8%，7.9%～41.7%及2.0%～18.7%。F8毒素濾液不同稀釋倍數(shù)處理甜瓜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、簡明活力指數(shù)及幼苗側(cè)根數(shù)較對照分別降低3.7%～11.1%，1.9%～14.1%，5.7%～18.0%及2.9%～9.3%。

2.4.2對甜瓜幼苗生長的抑制作用由表4可以看出，腐皮鐮刀菌(F3)毒素濾液不同稀釋倍數(shù)處理甜瓜幼苗胚根長度、胚根鮮質(zhì)量、胚軸長度及胚軸鮮質(zhì)量分別較對照降低4.4%～21.3%，0.2%～3.3%，2.4%～18.0%及0.2%～11.1%。尖孢鐮刀菌(F8)毒素對甜瓜幼苗生長也有抑制作用，F(xiàn)8毒素溶液不同稀釋液處理，其幼苗胚根長度、胚根鮮質(zhì)量、胚軸長度及胚軸鮮質(zhì)量較對照的降幅分別為1.3%～14.9%，0.3%～5.8%，3.5%～30.3%及1.7%～7.1%。

表 3　鐮刀菌菌株F3和F8毒素對甜瓜種子萌發(fā)的抑制作用

注：CK1為無菌水對照，CK2為液體PDA培養(yǎng)基無菌濾液對照；由于CK1和CK2無顯著差異，因此采用無菌水對照計(jì)算各指標(biāo)增幅。表中同列相同菌株各項(xiàng)數(shù)值后標(biāo)不同小寫字母表示該菌株不同稀釋度處理與對照差異顯著(P<0.05)。表4同。

Note:CK1represents distilled water control.CK2represents liquid PDA filtrate control.Since there was no significant difference between CK1and CK2,distilled water was used to calculate theΔCK.Different letters in each column of same strain indicate significant difference among the same fungal toxin dilutions and the control (P<0.05).The same for Table 4.

表 4　鐮刀菌菌株F3和F8毒素對甜瓜幼苗生長的抑制作用

2.5拮抗放線菌的篩選

2.5.1放線菌對鐮刀菌的拮抗作用利用瓊脂塊法從供試的662株放線菌中篩選得到7株對腐皮鐮刀菌(F3)和尖孢鐮刀菌(F8)均有拮抗活性的菌株，其對2種致病真菌具有不同程度的拮抗作用(表5)。

2.5.2放線菌無菌發(fā)酵濾液對鐮刀菌的抑菌活性由表6可知，篩選獲得的7株放線菌無菌發(fā)酵濾液對供試2種鐮刀菌均有抑菌活性。另外，本研究室種質(zhì)資源庫中還有4株放線菌的無菌發(fā)酵濾液也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗真菌作用。其中，培養(yǎng)24 h，放線菌468、C27無細(xì)胞發(fā)酵濾液對尖孢鐮刀菌的抑菌率均達(dá)100.0%；培養(yǎng)72 h，放線菌D74、Act12無細(xì)胞發(fā)酵濾液對腐皮鐮刀菌的抑菌率分別為54.1%和40.3%。放線菌D74、Act12、C27及468無菌發(fā)酵濾液對鐮刀菌也有明顯抑菌效果(圖4)。

表 5　放線菌對2種鐮刀菌F3和F8的拮抗作用

注：-表示無抑菌活性；+、++分別表示拮抗環(huán)半透明、完全透明。表7同。

Note:- indicates no antagonistic activity;+ and ++ indicate semi-transparent and complete transparent,respectively.The same for Table 7.

表 6　放線菌無菌發(fā)酵濾液對2種鐮刀菌F3和F8的抑菌率

圖 4放線菌無菌發(fā)酵濾液對腐皮鐮刀菌(F3)和尖孢鐮刀菌(F8)的抑制作用

Fig.4Inhibition of ferment fluid of actinomycetes againstF.solani(F3) andF.oxysporum(F8)

2.5.3放線菌對軟腐病原菌的拮抗性從表7可以看出，對2種致病菌有拮抗和抑菌作用的11株放線菌中，有6株對魔芋軟腐病致病細(xì)菌也有較強(qiáng)的拮抗作用，即篩選出的6株拮抗放線菌同時(shí)對2株致病真菌及魔芋軟腐細(xì)菌均具有較強(qiáng)的抗菌活性。

表 7　拮抗放線菌對魔芋軟腐病原菌的拮抗活性

3討論

3.1魔芋土傳病害致病性鐮刀菌

研究證明，黃瓜[14]、甜瓜[13]、芹菜[15]及辣椒[16]等作物土傳病害的發(fā)生與根域微生物區(qū)系變化密切相關(guān)。本研究對刺槐林及農(nóng)田魔芋田間生態(tài)現(xiàn)象的觀察發(fā)現(xiàn)，在相同生態(tài)條件下的同一田塊，農(nóng)藝措施基本相同，魔芋軟腐病株與健株同時(shí)存在,通過對健康與軟腐病株根域土壤微生態(tài)系統(tǒng)比較發(fā)現(xiàn)，上述生態(tài)現(xiàn)象存在的原因也與根際微生物區(qū)系不同有關(guān)(擬另文報(bào)道)。

本研究表明，在魔芋軟腐病株根區(qū)、根表土壤及根系中存在大量的腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌。腐皮鐮刀菌是一類分布廣泛的植物病原菌，可侵染木薯等作物[17]；尖孢鐮刀菌是引起瓜類枯萎病的主要病原菌[18]；腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌復(fù)合侵染可導(dǎo)致苜蓿根腐病病害發(fā)生[19]。腐皮鐮刀菌也是魔芋干腐病的病原菌，發(fā)病植株葉片退綠，逐漸黃化，萎蔫下垂，嚴(yán)重時(shí)植株倒伏死亡[20]。鐮刀菌(Fusarium)也是魔芋根腐病病原菌之一，主要為害根部，植株輕度受害時(shí)地上部葉片退綠黃化，后期葉柄枯死，地下球莖膨大受到嚴(yán)重影響[20]。盡管目前大部分研究者公認(rèn)，魔芋軟腐病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種(Erwiniacarotovorassp.cantovora,Ecc.)、菊歐文氏菌(E.chrysanthemi,Ech.)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌黑脛亞種(E.carotovorassp.atroseptica,Eca.)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)和腸桿菌(Enterobacterspp.)等[21]細(xì)菌引起的土傳病害，但細(xì)菌侵染過程中致病性真菌的作用也不容忽視。

本研究發(fā)現(xiàn)，同一生態(tài)條件下軟腐病株、健株根域優(yōu)勢真菌存在顯著差異，其中值得特別注意的重要差異是軟腐病株根域致病性真菌數(shù)量遠(yuǎn)高于健株。魔芋軟腐病株根域腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌的大量存在就證明了魔芋軟腐病發(fā)生是軟腐病菌與腐皮鐮刀菌及尖孢鐮刀菌復(fù)合侵染的結(jié)果。

李艷梅等[22]也發(fā)現(xiàn)，植物病害的發(fā)生往往是多種病原菌復(fù)合侵染的結(jié)果，發(fā)病植物根際土壤中其他致病菌亦會參與并加劇病害發(fā)生。吳祝平[23]研究表明，魔芋病害是以一個病害為主，多個病害共同發(fā)生構(gòu)成的“復(fù)合感染”。因此，在對魔芋軟腐病的防治過程中，應(yīng)該探索全方位兼顧病原細(xì)菌和致病性真菌的防治策略，以達(dá)到標(biāo)本兼治的效果。

微生物產(chǎn)生的毒素作為化感物質(zhì)能導(dǎo)致寄主植物萎蔫、組織壞死[24]。鐮刀菌毒素是鐮刀菌在生長過程中產(chǎn)生的多種有毒代謝產(chǎn)物，能造成植物萎蔫、根腐及穗腐等腐爛病，導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至絕收[25]。研究表明，植物的幼嫩組織如種子萌發(fā)期幼苗胚根、胚軸對毒素的脅迫極為敏感[26]，培養(yǎng)初期的尖孢鐮刀菌粗毒素濾液對黃瓜種子萌發(fā)及胚根生長具有明顯的抑制作用；胚根生長的抑制率達(dá)30.0%～45.0%[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，2株鐮刀菌產(chǎn)生的毒素對甜瓜種子萌發(fā)及幼苗胚根、胚軸生長也具有明顯的抑制作用。腐皮鐮刀菌和尖孢鐮刀菌發(fā)酵粗濾液對離體魔芋球莖和胡蘿卜組織均有侵染和致病性。該結(jié)果表明，2株致病鐮刀菌也可能通過有毒代謝產(chǎn)物參與魔芋軟腐病的致病過程。

3.2拮抗放線菌篩選

目前，國內(nèi)外主要通過栽培措施[28]、化學(xué)藥劑[29]、生防細(xì)菌[30-33]和生防真菌[34]等防治魔芋軟腐病，而有關(guān)放線菌生防的研究報(bào)道較少，僅見葉晶龍[21]篩選出11株對魔芋軟腐病病原菌有抑菌能力的放線菌菌株的報(bào)道。此外，現(xiàn)有的研究基本以單一的軟腐病菌為靶標(biāo)菌來篩選生防菌，篩選得到的生防菌抗菌譜未覆蓋致病真菌，限制了生防菌抗菌效果的發(fā)揮。因此，篩選對軟腐病菌及致病性真菌同時(shí)有抑制作用的廣譜拮抗性放線菌對提高魔芋軟腐病微生物防治效果有重要意義。

本研究以魔芋軟腐病株根域大量存在的2株致病性鐮刀菌為靶標(biāo)菌，從供試662株放線菌中篩選出11株對軟腐病株根區(qū)、根表土壤及根系大量存在的致病性鐮刀菌有較強(qiáng)拮抗作用的放線菌?？管浉〖?xì)菌活性測定結(jié)果表明，所選拮抗菌中有6株同時(shí)對軟腐細(xì)菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。該結(jié)果為魔芋軟腐病土傳病害生物防治及微生態(tài)調(diào)整提供了活性較強(qiáng)的廣譜拮抗菌資源，其中的放線菌婁徹氏鏈霉菌(S.rochei,D74)、瀨里予鏈霉菌(S.senoensis,420)、黃三素鏈霉菌(S.flavotricini,C27)、肉質(zhì)鏈霉菌(S.carnosus,Act11)、密旋鏈霉菌(S.pactum,Act 12)已用于魔芋盆栽和大田試驗(yàn)，表現(xiàn)出良好的防病促生作用(擬另文發(fā)表)。

由于魔芋軟腐病采用傳統(tǒng)的化學(xué)藥劑難以有效控制，探索新的防治途徑是目前亟待解決的問題。放線菌是抗生素的主要產(chǎn)生菌[35]，其中的鏈霉菌孢子量大，孢子存活能力強(qiáng)，易于工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。接種拮抗性放線菌可減少魔芋根域致病菌數(shù)量，有望從源頭上阻止或減輕魔芋軟腐病等土傳病害的發(fā)生。因此，本研究的拮抗菌篩選結(jié)果對魔芋軟腐病的生物防治有重要意義。

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Identification and allelopathic effect of dominant fungi in root-zone ofAmorphophalluskonjacand screening of the bio-control actinomycetes

HE Fei1a,ZHANG Zhong-liang1b,CUI Ming2,XUE Quan-hong1c

(1 aCollegeofLifeScience,bCollegeofForestry,cCollegeofNaturalResourcesandEnvironment,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2QinbaMoyuResearchandDevelopmentCenter,Ankang,Shaanxi725000,China)

Abstract:【Objective】 Dominant fungi F3 and F8 were obtained from rhizosphere soil,rhizoplane soil,and root of soft rot-infected Amorphophallus konjac plants and their pathogenicity and allelopathic activities were tested.Efficient and broad-spectrum biocontrol actinomycetes with conspicuous antagonistic effect on dominant fungi and pathogenic bacteria were also screened.【Method】 Strains F3 and F8 isolated from diseased and healthy A.konjac plants were identified according to colony morphology and rDNA-ITS sequence analysis.Infection test in vitro was used to determine the pathogenicity on A.konjac and carrot tissues.Melon seed germination experiments were conducted to investigate the allelopathic activity.Antagonistic bio-control actinomycetes against dominant fungi and pathogenic bacteria were screened by agar block and fermentation filtrate.【Result】 ① A large number of F3 and F8 existed in rhizosphere soil,rhizoplane soil and root of soft rot-infected A.konjac plants. Isolates F3 and F8 were identified as Fusarium solani and Fusarium oxysporum.Their crude filtrates of fermentation were pathogenic to A.konjac corms and carrot tissues.Their crude toxin solutions also had inhibition effects on seed germination and growth of melon seedlings.②Six bio-cotrol actinomycetes were screened with strong antagonistic activity against dominant Fusarium and soft rot pathogenic bacteria of A.konjac.【Conclusion】 Dominant fungi Fusarium solani and Fusarium oxysporum found abundantly in rhizosphere soil,rhizoplane soil and root of diseased A.konjac had pathogenic and allelopathic activities.Six antagonistic bio-control actinomycetes were screened against dominant Fusarium and soft rot pathogenic bacteria of A.konjac.

Key words:Amorphophallus konjac;soft rot disease;Fusarium solani;Fusarium oxysporum;allelopathic effect;composite infection

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2016-03-1408:4510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.04.022

[收稿日期]2014-09-02

[基金項(xiàng)目]國家林業(yè)局重點(diǎn)科技推廣項(xiàng)目(魔芋產(chǎn)業(yè)化配套技術(shù)2010-38)；財(cái)政部農(nóng)業(yè)科技體系建設(shè)項(xiàng)目(XTG2013-36)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013K02-24)

[作者簡介]何斐(1988-)，女，陜西南鄭人，碩士，主要從事微生物資源利用研究。E-mail:hefei6000@163.com[通信作者]薛泉宏(1957-)，男，陜西白水人，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物資源與應(yīng)用研究。

[中圖分類號]S432；Q939.95

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)04-0157-11

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160314.0845.044.html

E-mail:xuequanhong@163.com