復合天然抗氧化劑對鳊脂肪的抗氧化效果

陳小雷，胡　王，周蓓蓓，鮑俊杰，裴陸松，吳向俊，李正榮

(1.安徽省農業(yè)科學院水產研究所，合肥　230031；2.安徽省好再來食品有限公司，安徽馬鞍山　238100)

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復合天然抗氧化劑對鳊脂肪的抗氧化效果

陳小雷1，胡王1，周蓓蓓1，鮑俊杰1，裴陸松2，吳向俊2，李正榮1

(1.安徽省農業(yè)科學院水產研究所，合肥230031；2.安徽省好再來食品有限公司，安徽馬鞍山238100)

摘要：為了獲得一種能夠有效抑制鳊(Parabramis pekinensis)脂肪氧化的復合天然抗氧化劑，試驗中將VE、茶多酚、蝦青素、迷迭香提取物、葡萄籽提取物、人參提取物和蘆丁提取物進行復合，并研究復合天然抗氧化劑對鳊脂肪氧化的抑制作用。結果表明，在組分篩選試驗設計的8組復合天然抗氧化劑中，迷迭香提取物、人參提取物和VE組成的復合天然抗氧化劑具有較好的抗氧化效果(下文將迷迭香提取物、人參提取物和VE組成的復合天然抗氧化劑簡稱為目標抗氧化劑)；試驗對目標抗氧化劑的抗氧化性能進行驗證，結果表明目標抗氧化劑的抗氧化效果顯著優(yōu)于組分篩選試驗中的其他組合(P<0.05)，并將目標抗氧化劑與人工合成抗氧化劑(BHA、BHT、TBHQ)進行比較，結果表明目標抗氧化劑與這3種人工合成抗氧化劑抗氧化效果無顯著差異(P>0.05)。

關鍵詞：鳊( Parabramis pekinensis)；脂肪；天然抗氧化劑；復合；抗氧化

安徽省鳊的加工產品以封鳊為主，封鳊屬腌臘水產品，是安徽及長江中下游省份很受喜愛的傳統(tǒng)特色水產制品。封鳊在貯藏過程中容易受到溫度、氧氣等因素的影響，魚肉中的不飽和脂肪酸發(fā)生氧化而使魚肉表面褐變，改變魚體的組織、水合能力、顏色、風味等一系列品質特性，使封鳊的商品價值大大降低[1]；同時，不飽和脂肪酸氧化過程中產生的自由基、氫過氧化物、小分子聚合物等與人體細胞的老化、突變和癌變息息相關，對食用者的健康造成潛在的威脅。因此，開展抑制鳊脂肪氧化的研究具有十分重要的產業(yè)意義和應用價值。

目前，延緩魚肉脂肪氧化的措施主要有：避光隔絕空氣保藏、低溫保藏、添加抗氧化劑以及微膠囊化等[2]，其中添加抗氧化劑是較為科學而可行的方法[3]。食品抗氧化技術以使用合成抗氧化劑BHA為代表，有力地推動了食品工業(yè)的發(fā)展，隨著食品工業(yè)的不斷發(fā)展，食品抗氧化劑也得到了長足的發(fā)展，然而人工合成抗氧化劑易分解且具有刺激性，在食品中的應用范圍越來越窄，有研究表明，BHT、BHA和TBHQ會引起肝腫大，BHT還會使肺和肝微粒體酶的活性增加，使人體攝入的其他物質轉變?yōu)橛卸疚锘蛑掳┪颷4]。目前，在日本BHA只能用于棕櫚油和棕櫚仁油，美國、歐共體等已經禁止使用人工合成抗氧化劑，許多國家對其添加量已加以限制，因此，從天然產物中尋求高效無毒的抗氧化劑應用于魚肉脂肪抗氧化具有更強的科學價值和應用前景，其中天然香辛料、中草藥、果蔬植物等是研究的熱門領域，并且魚肉的抗氧化研究主要集中在草魚(Ctenopharyngodonidellus)、鱸魚(Lateolabraxjaponicus)、羅非魚(Oreochromisspp)、鰻魚(Muraensoxcinereus)等方面，鳊(Parabramispekinensis)目前未見報道。本試驗重點研究幾種天然抗氧化劑(VE、茶多酚、蝦青素、迷迭香提取物、蘆丁提取物、人參提取物和葡萄籽提取物)及其復合物對鳊脂肪氧化的抑制效果，為尋求一種新的安全、高效復合抗氧化劑提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1試驗材料與試劑

鳊購于合肥市大潤發(fā)超市；茶多酚迷迭香提取物、蘆丁提取物、人參提取物、蝦青素、葡萄籽提取物、VE均購于陜西浩洋生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2試驗儀器

磁力攪拌器(深圳天南海北有限公司)；數顯恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；DHG-9243B5-Ⅲ型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海新苗醫(yī)療器械有限公司)；AL204型電子分析天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；HITACHI CR22G型高速冷凍離心機(日本HITACHI koki公司)；TU-1901雙束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2試驗方法

1.2.1鳊脂肪的制取和精制

稱取一定質量處理后的鳊肉置于錐形瓶中，加水調節(jié)料液比至1∶1.5，用4 mol/L的NaOH和HCl調節(jié)初始pH至7.5，再加入1.5%的胰蛋白酶，置于水浴鍋中，50 ℃酶解2～3 h后，90 ℃滅酶5～15 min，然后5 000 r/min趁熱離心15 min，將離心管取出垂直放于-20 ℃條件下冷凍2 h，分離出上層油脂即為粗制鳊脂肪。粗制鳊脂肪經磷酸脫膠后，根據魚肉脂肪的酸價，升溫至40～60 ℃，加入70 g/L的NaOH溶液，攪拌15 min，靜置分層，水洗至中性，再加入混合脫色劑(高嶺土、活性炭質量比為1∶1)60 ℃條件下脫色30 min，抽濾得精制鳊肉脂肪。

1.2.2鳊脂肪的脂肪酸組成分析

樣品甲酯化參照張偉偉等的方法，之后用GC-MS分析[5]。GC條件：cp-sil8CB毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：高純氦；分流比：50∶1；流速：1.0 mL/min；進樣口溫度：260 ℃；程序升溫條件：起始溫度50 ℃，以12 ℃/min升溫至260 ℃，保持8 min，再以30 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min。MS條件：電離方式EI；離子源溫度150 ℃；電離能量70 eV；掃描質量范圍30～650。通過對NIST質譜檢索，對脂肪酸進行定性，通過面積歸一法確定其相對含量。

1.2.3鳊脂肪的氧化試驗

將鳊脂肪分成等量的幾份，抗氧化劑先用無水乙醇溶解，分別按照試驗要求添加到鳊脂肪中，混勻，將樣品放入加速氧化的條件下(60～70 ℃有氧烘箱中)，每24 h取出樣品進行氧化分析。

1.2.4鳊脂肪氧化的測定

(1)羰基值(COV)的測定。準確稱取樣品0.05～1.50 g，置于10 mL容量瓶中，加入精制正丁醇使之溶解，并稀釋至刻度，搖勻，準確稱取1 mL置于離心管中，加入2,4-二硝基苯肼溶液1 mL，搖勻，40 ℃水浴20 min，取出，冷卻至室溫，加入2.5%氫氧化鉀的正丁醇溶液8 mL，搖勻，3 000～4 000 r/min離心5 min，以相應試劑為空白，取上清液在390 nm處測定吸光度，并按下式計算COV。

COV(mg/kg)=[A/(658.8×W×V2/V1)]×1 000

式中，A為樣品的吸光度；W為樣品的質量(g)；V1為樣品稀釋后的體積(mL)；V2為測定用樣品稀釋后的體積(mL)；658.8為各種醛的毫摩爾吸收系數的平均值。

(2)硫代巴比妥酸反應物(TBARS)的測定。取10 g魚肉，攪碎后，加入50 mL 7.5%的三氯乙酸(含體積分數為0.1% EDTA)，振搖30 min，雙層濾紙過濾后取5 mL上清液于具塞試管中，加入5 mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液并在沸水浴中保溫30 min，取出，冷卻1 h后在4 500 r/min下離心5 min，上清液加入5 mL氯仿搖勻，靜置分層后取上清液分別在600 nm和532 nm處測定吸光度，并按下式計算TBA值[6]。

TBA值(mg/kg)=(A532-A600)/155×(1/10)×72.6×1000

式中，A532為在波長532 nm處樣品上清液的吸光度；A600為在波長600 nm處樣品上清液的吸光度。

與TBARS反應物質的量以每千克魚肉中丙二醛的毫克數來表示。

2結果與分析

2.1鳊的脂肪酸組成

從表1可以看出，通過GC-MS從鳊脂肪中分離鑒定出18種脂肪酸，主要為：棕櫚酸(C16∶0)、十六碳烯酸(C16∶1)、十八烷酸(C18∶0)、油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)等。魚油中飽和脂肪酸含量為24.63%，以棕櫚酸為主，含量為19.16%；單不飽和脂肪酸含量為44.08%，以油酸為主，含量為37.70%；多不飽和脂肪酸含量為31.27%，以亞油酸為主，含量為23.65%，同時還含有0.47%的EPA(C20∶5)和1.31%的DHA(C22∶6)；鳊脂肪中除了含有常見的偶數碳脂肪酸外，還含有一定的奇數碳脂肪酸，如十五烷酸、十七烷酸。

表1　鳊的脂肪酸組成

2.2復合天然抗氧化劑的篩選

以不添加任何抗氧化劑的魚肉脂肪為空白，以添加表2所有抗氧化劑的魚肉脂肪為參照，其他各編號試驗為與參照相比不添加某一種抗氧化劑(稱之為扣除項)。將上述各試驗樣品于60 ℃條件下加速氧化，定期測定氧化指標，組分篩選設計如表2所示。

表2　復合天然抗氧化劑組分篩選設計表

注：×表示扣除項，○表示添加項。

脂質過氧化反應中產生的自由基可使蛋白質變性[7]，幾乎組成蛋白質所有的氨基酸對羥自由基(·OH)及超氧陰離子自由基(O2-·)的攻擊都很敏感，尤其是側鏈上帶有NH或NH2的氨基酸對·OH更為敏感。在反應過程中，這些敏感基團被自由基攻擊轉化成羰基基團[8]，導致羰基含量的增加，因此可用羰基的含量來表示脂肪氧化程度，其原理是羰基化合物與2,4-二硝基苯肼生成紅色腙類化合物，在390 nm處有最大吸收，COV是脂肪氧化中期指標。

從圖1可以看出，COV隨著時間的延長不斷升高，但經抗氧化劑處理的鳊脂肪的COV明顯低于空白試驗，且9組試驗結果差異顯著(P<0.05)。其中，1、4、7組復合天然抗氧化劑與參照組相比抗氧化效果較差，2、3、5、6組抗氧化效果與參照組相比較好，說明復合天然抗氧化劑組分中不添加迷迭香提取物、人參提取物和VE，抗氧化作用減弱；而不添加茶多酚、蝦青素、葡萄籽提取物和蘆丁提取物，抗氧化效果增強，即在復合天然抗氧化劑組分中，茶多酚、蝦青素、葡萄籽提取物和蘆丁提取物對復合天然抗氧化劑的其他組分起到了抑制作用。從鳊脂肪的COV變化可以看出，目標抗氧化劑的組分為迷迭香提取物、人參提取物和VE。

圖1　復合天然抗氧化劑對鳊脂肪COV的影響

TBA值是脂肪氧化最常用的參考指標[9]，不飽和脂肪酸氧化分解產生丙二醛，它在水溶液中以烯醇的形式存在，實驗室條件下在酸性溶液中隨水蒸氣蒸出，可與TBA試劑作用生成紅色化合物，置于530 nm處有最大吸收。TBA值通過測定脂肪氧化分解為丙二醛的程度，來表示脂肪氧化的程度，醛的生成量與食品不良風味存在相關關系，與感官評分呈線性關系[10]。TBA法可用于比較單一物質的樣品在不同氧化階段的氧化程度，特別是肉類的氧化，隨著氧化程度的加深，次級產物不斷增多，TBA值不斷升高，一般來說，當生肉的TBA值超過0.5 mg/kg時，人就感覺到有氧化異味[11]。

從圖2可以看出，隨著時間的延長，鳊脂肪的TBA值不斷增加，但經抗氧化劑處理的試驗組TBA值明顯低于空白試驗，且9組試驗結果差異顯著(P<0.05)，其中2、3、5、6組抗氧化效果比添加全抗氧化劑的效果好，而1、4、7組效果較全抗氧化劑差，說明不添加迷迭香提取物、人參提取物和VE，抗氧化作用得到消弱，而不添加茶多酚、蝦青素、葡萄籽提取物和蘆丁提取物，抗氧化效果得到增強，即茶多酚、蝦青素、葡萄籽提取物和蘆丁提取物對復合天然抗氧化劑的其他成分起到了抑制作用，從鳊脂肪的TBA值變化可以看出，目標抗氧化劑的組分為迷迭香提取物、人參提取物和VE。

由圖1和圖2可以看出，COV和TBA值的試驗結果一致，說明目標抗氧化劑對鳊脂肪氧化的抑制作用比較穩(wěn)定。

2.3驗證試驗

為了驗證目標抗氧化劑的抗氧化劑效果，需要將目標抗氧化劑與組分篩選試驗表中效果最好的6號抗氧化劑(稱之為對照組)進行比較。從圖3可以看出，隨著時間的延長，COV不斷提高，但是，經目標抗氧化劑處理的試驗組COV顯著低于對照組(P<0.01)，說明目標抗氧化劑的抗氧化效果顯著優(yōu)于對照組。

圖2　復合天然抗氧化劑對鳊脂肪TBA值的影響

圖3　目標抗氧化劑和對照組對鳊脂肪COV的影響

從圖4可以看出，隨著時間的延長，TBA值不斷提高，但是，經目標抗氧化劑處理的試驗組TBA值顯著低于對照組(P<0.05)，說明目標抗氧化劑的抗氧化效果顯著優(yōu)于對照組。

圖4　目標抗氧化劑和對照組對鳊脂肪TBA值的影響

2.4復合天然抗氧化劑與人工合成抗氧化劑的比較

將目標抗氧化劑與人工合成抗氧化劑TBHQ、BHA、BHT進行抗氧化劑性能比較，因國標規(guī)定人工合成抗氧化劑的添加量不得高于0.02%，所以3種合成抗氧化劑的添加量均為0.02%。從圖5可以看出，隨著時間的延長，COV逐漸增大，其中BHA抗氧化效果最好，并且顯著優(yōu)于TBHQ(P<0.01)，但與目標抗氧化、BHT無顯著差異(P>0.05)，而目標抗氧化劑與BHA、BHT和TBHQ均無顯著差異(P>0.05)，說明目標抗氧化劑與人工合成抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ在鳊脂肪氧化過程中的抑制作用相當。

圖5　目標抗氧化劑與合成抗氧化劑

從圖6可以看出，4種抗氧化劑抗鳊脂肪氧化的效果強弱順序為TBHQ>目標抗氧化劑>BHA>BHT，但4種抗氧化劑抗氧化效果無顯著差異(P>0.05)。

圖6　目標抗氧化劑與合成抗氧化劑

3討論

3.1研究鳊抗氧化劑的必要性

從表1可以看出，鳊脂肪中不飽和脂肪酸含量為75.35%，遠遠多于飽和脂肪酸的含量，大量研究表明不飽和脂肪酸有降低膽固醇、預防冠心病、提高記憶力等作用[12]；鳊脂肪中還含有少量的奇數碳脂肪酸，研究表明奇數碳脂肪酸有極強的抗癌活性[13]；Σn-3/Σn-6值是比較魚類脂肪相對營養(yǎng)價值的一個指標，淡水魚的Σn-3/Σn-6值主要在0.5～3.8[14]，通常認為達到1∶1以上為好[15]，鳊脂肪中Σn-3/Σn-6值為2.82，高于白鰱(2.0)[16]和鯉魚(1.06)[17]等其他淡水魚類，以上均說明鳊脂肪是一種高品質的脂類；此外，封鳊是安徽及長江中下游地區(qū)主要的傳統(tǒng)水產制品，在安徽省傳統(tǒng)水產制品市場占有舉足輕重的地位，但是封鳊在加工、貯藏和運輸過程中存在很嚴重的脂肪氧化現象，制約了封鳊產業(yè)的發(fā)展，亟需采取科學的方法抑制其脂肪氧化，所以尋求抑制鳊脂肪氧化的復合天然抗氧化劑具有非常重要的理論和現實意義。

3.2目標抗氧化劑抑制鳊脂肪氧化的作用機理

迷迭香提取物中主要的抗氧化成分是迷迭香酚、鼠尾草酚。迷迭香酚和鼠尾草酚均是二取代酚，具有酚羥基，能向活潑的自由基提供氫原子；當迷迭香酚參與抗氧化反應后生成的迷迭香醌也具有較強的抗氧化活性，所以，迷迭香酚具有很強的抗氧化活性。鼠尾草酚的結構與迷迭香酚相似，同樣具有很強的抗氧化活性。另外，迷迭香酚和鼠尾草酚的二取代酚結構能夠抑制過氧自由基，中斷自由基的連鎖反應，所以迷迭香提取物是很好的天然抗氧化劑[18-20]。

人參提取物中主要的抗氧化成分是人參皂苷和人參多糖。人參皂苷是由糖分子上的半縮醛羥基與非糖類化合物上的羥基脫掉一個水分子縮合而成的配糖物質，是以四環(huán)或五環(huán)三萜達瑪烷型為骨架的一類皂苷[21]。皂苷大多具有明顯的抗氧化作用，例如，三七皂苷可顯著提高異育銀鯽的抗氧化性能[22]，梔子總皂甙具有清·OH、O2·和抑制Cu2+誘導的LDL氧化修飾的活性[23]。人參多糖包括多種糖類，如低聚糖和多糖，多糖可通過直接清除活性氧，絡合產生活性氧所必需的金屬離子等途徑實現抗氧化作用[24]，研究表明鼠尾藻多糖、青竹梅多糖、人參多糖、銅藻多糖對·OH都具有較好的清除作用[25]，生姜多糖具有較強的自由基清除活性[26]，藍莓多糖對·OH和DPPH自由基有較強的清除作用[27]。

VE又稱生育酚，可以將脂質過氧化物自由基ROO·轉變成化學性質不活潑的ROOH，從而有效地抑制脂質過氧化[28]、維持細胞膜的完整性、對抗自由基的破壞作用，甚至清除自由基，所以VE也被廣泛用于多種疾病的治療、抗衰老以及其他工業(yè)用途。并且有研究表明，植物中的一些抗氧化成分如阿魏酸、綠原酸和鞣花酸等能夠使VE再生[29]，所以推斷VE和迷迭香提取物的協同作用主要是迷迭香酸對VE的再生作用。

許多研究表明，多種抗氧化劑聯合使用，其效果往往要大于同劑量的單一抗氧化劑的效果，即抗氧化劑之間具有協同作用。所謂抗氧化劑之間的協同作用就是抗氧化劑之間通過某種方式使抗氧化效果增強的作用，作用機理一般有如下5種[30]：(1)淬滅活性氧：某些抗氧化劑可以直接與氧反應，降低體系氧的濃度，從而減少氧化反應生成的過氧化自由基；(2)絡合金屬離子：某些抗氧化劑與體系中的金屬離子形成螯合物，降低金屬離子的催化作用；(3)改變酶的活性：氧化酶或促氧化酶的活性對氧化反應起到至關重要的作用，某些抗氧化劑通過改變這些酶的活性來抑制氧化反應；(4)修復再生：某些抗氧化劑通過電子轉移等方式維持其他還原劑的水平；(5)偶聯氧化：通過降低參加反應的抗氧化物間的電位落差，促進抗氧化反應；偶聯的抗氧化劑油水分配系數互為補充，能夠充分發(fā)揮每種抗氧化劑的功能。

從圖1和圖2可以看出，1、4、7號抗氧化劑即分別不添加迷迭香提取物、人參提取物和VE的試驗組抗氧化劑效果比全抗氧化劑組差，說明迷迭香提取物、人參提取物和VE對鳊脂肪均起到很好的抗氧化作用，也進一步驗證了迷迭香提取物、人參提取物和VE具有優(yōu)良的抗氧化性的結論；從圖3和圖4 可以看出，迷迭香提取物、人參提取物和VE復合使用抗氧化效果優(yōu)于蝦青素、迷迭香提取物、人參提取物、VE、茶多酚、蘆丁提取物和葡萄籽提取物的復合使用，說明迷迭香提取物、人參提取物和VE之間存在協同增效作用。對比上述迷迭香提取物、人參提取物和VE的抗氧化以及協同增效的機理研究，可以認為目標抗氧化劑的作用機理如下：目標抗氧化劑中的迷迭香提取物主要起到向自由基提供氫離子，使活潑的ROO·轉變成化學性質不活潑的ROOH，從而阻斷自由基的鏈式反應；人參提取物主要起到清除體系中活性氧，并且絡合產生活性氧所需要的金屬離子，從而實現抗氧化作用；VE具有使細胞膜上的不飽和脂肪酸免受氧化，保護含磷脂的生物膜受脂質過氧化損傷的作用，同時迷迭香酸對VE有修復再生的作用，使VE能夠維持在正常水平不斷發(fā)揮抗氧化作用。從圖5和圖6可以看出，目標抗氧化劑與BHA、BHT和TBHQ的抗氧化效果無顯著差異，正是因為迷迭香提取物、人參提取物和VE不同的抗氧化作用機理，才能通過修復再生、吸收氧氣和絡合金屬離子的方式形成協同增效的抗氧化作用，使目標抗氧化劑具有很強的抗氧化效果。通過這3種不同類型抗氧化劑的復配，不僅能夠節(jié)省抗氧化劑的用量，還能減少單一抗氧化劑因用量大而對機體產生的負作用，從而獲得高抗氧化活性和低細胞毒性的復合天然抗氧化劑。

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(責任編輯：鄧薇)

Effect of complex natural antioxidant on Parabramis pekinensis lipid

CHEN Xiao-lei1,HU Wang1,ZHOU Bei-bei1,BAO Jun-jie1,PEI Lu-song2,WU Xiang-jun2,LI Zheng-rong1

(1.FisheriesInstitute,AnhuiAcademyofAgriculturalScience,Hefei230031,China;2.AnhuiHaozailaiFoodCompany,Maanshan238100,Anhui,China)

Abstract：The purpose of this study was to discover some complex natural antioxidant controlling oxidation of Parabramis pekinensis lipid.In this paper,VE,tea polyphenols,astaxanthin,rosemary extract,grape seed extract,ginseng extract and rutin extract were complex to restrain lipid oxidation of P.pekinensis.The experiments showed that rosemary extract,ginseng extract and VE complex had better effect of antioxidation on P.pekinensis lipid (P<0.05).The contrast experiments proved the complex natural antioxidant had equivalent antioxidation to BHA，BHT and TBHQ (P>0.05).

Key words：Parabramis pekinensis lipid;natural antioxidant;complex;antioxidation

收稿日期：2015-05-29；

修訂日期：2016-03-04

第一作者簡介：陳小雷(1986-)，女，碩士，專業(yè)方向為水產品加工與資源綜合利用。E-mail：chenxiaolei3344@126.com通訊作者：胡王。E-mail：huwang101@sina.com

中圖分類號：S983

文獻標識碼：A

文章編號：1000-6907-(2016)03-0092-07

資助項目：2014年馬鞍山市科技攻關項目(NY-2014-04)；安徽省農業(yè)科學院院長青年基金項目(15B0523)；安徽省農業(yè)科學院創(chuàng)新團隊(15C0501)