淡化對(duì)南美白對(duì)蝦存活率、滲透壓和Na+/K+-ATP酶活力的影響

唐建洲，劉　臻，汪星磊，齊紹武，柏連陽，

張建昌2，張　義2，劉勇虎1，劉正軒1

(1.長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系，長沙　410003；2.常德家華水產(chǎn)科技有限公司，湖南常德　415523；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙　410128；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長沙　410125)

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淡化對(duì)南美白對(duì)蝦存活率、滲透壓和Na+/K+-ATP酶活力的影響

唐建洲1，2,3，劉臻1，2，汪星磊1，齊紹武3，柏連陽4，

張建昌2，張義2，劉勇虎1，劉正軒1

(1.長沙學(xué)院生物與環(huán)境工程系，長沙410003；2.常德家華水產(chǎn)科技有限公司，湖南常德415523；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙410128；4.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長沙410125)

摘要：采用微型冰點(diǎn)滲透壓儀、熒光定量PCR和酶活力測定的方法分析淡化對(duì)南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)存活率、體內(nèi)滲透壓及Na+/K+-ATPase基因表達(dá)和酶活力的影響。結(jié)果表明，養(yǎng)殖水體鹽度由12‰下降到0‰過程中，蝦苗存活率和活力始終維持一個(gè)較高的水平。對(duì)蝦體內(nèi)滲透壓隨著水體鹽度的降低而降低，但沒有顯著差異。滲透壓調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因Na+/K+-ATPase mRNA表達(dá)水平和酶活力在水體鹽度12‰下降到9‰過程中顯著升高，之后隨著水體鹽度的下降表達(dá)量顯著降低，最后在6‰下降到0‰過程中趨于平緩。

關(guān)鍵詞：淡化；南美白對(duì)蝦(Penaeus vannamei)；存活率；滲透壓；Na+/K+-ATP酶

南美白對(duì)蝦(Penaeusvannamei)具有適應(yīng)鹽度范圍廣、抗病力強(qiáng)、生長速度快、出肉率高、肉質(zhì)鮮美、高蛋白低脂肪、適合于人工高密度養(yǎng)殖等特點(diǎn)，既可海養(yǎng)，也可淡養(yǎng)，是當(dāng)今世界上公認(rèn)的三大養(yǎng)殖對(duì)蝦優(yōu)良品種之一[1]。南美白對(duì)蝦具有較強(qiáng)的滲透壓自我調(diào)節(jié)能力，能在0～40‰的水體中正常生長，人們通常通過改變養(yǎng)殖水環(huán)境鹽度實(shí)現(xiàn)南美白對(duì)蝦在淡水環(huán)境中高效養(yǎng)殖[2-5]。盧光濤[6]研究了低鹽環(huán)境下南美白對(duì)蝦滲透壓的變化規(guī)律，結(jié)果表明鹽度突變(2‰→10‰)，蝦體血清滲透壓水平顯著上升，3 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后滲透壓水平逐步顯著下降，12 h時(shí)重新達(dá)到穩(wěn)定；王文娟等[7]在低鹽度下研究了不同蛋白含量飼料對(duì)南美白對(duì)蝦滲透壓調(diào)節(jié)的影響，結(jié)果揭示低鹽環(huán)境下，蝦體需要消耗蛋白質(zhì)維持滲透壓的穩(wěn)定；鄭德斌等[8]研究了環(huán)境溶解氧對(duì)南美白對(duì)蝦滲透壓變化的影響。此外，也有學(xué)者研究了甲殼類動(dòng)物滲透壓變化規(guī)律，如采用cDNA文庫的方法對(duì)南美白對(duì)蝦滲透壓相關(guān)基因進(jìn)行了分類研究，發(fā)現(xiàn)與滲透壓相關(guān)基因主要為ATP酶基因、調(diào)節(jié)因子、能量代謝等基因[9-12]。盡管前人開展了鹽度對(duì)對(duì)蝦滲透壓調(diào)節(jié)的研究，但是，南美白對(duì)蝦由高鹽度進(jìn)入低鹽度水體環(huán)境中，蝦體滲透壓調(diào)節(jié)的變化規(guī)律研究尚未見報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)研究不同鹽度對(duì)南美白對(duì)蝦存活率、滲透壓及其滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的Na+/K+-ATPase的基因表達(dá)和酶活力的變化規(guī)律，以期揭示南美白對(duì)蝦滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)理，為人工配制南美白蝦滲透壓調(diào)節(jié)劑的研究與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)條件

實(shí)驗(yàn)在0.2 m3的玻璃水族箱內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用水為淡水。初期使用滲透壓調(diào)節(jié)劑按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)水體鹽度為12‰，pH 8.6，水溫控制在(26±2)℃，24小時(shí)連續(xù)曝氣。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

南美白對(duì)蝦蝦苗(SPF蝦苗)由海南祿泰公司提供，規(guī)格整齊、大小一致，體長約0.2 cm。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣

實(shí)驗(yàn)設(shè)空白及對(duì)照組，各組重復(fù)3次，蝦苗進(jìn)缸前3 d將所用水體鹽度調(diào)成12‰，pH8.6。每一水族箱放置規(guī)格一致的蝦苗1 000尾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為水體從12‰淡化至0‰度為止，淡化時(shí)鹽度每天降低1.5‰，共8 d。分別在水體鹽度為12‰，9‰，6‰，0‰時(shí)取樣，測定各取樣點(diǎn)水體滲透壓、蝦苗存活率和活力、全蝦滲透壓、Na+/K+-ATPase表達(dá)量及酶活力。實(shí)驗(yàn)過程中每天投餌6次，日投餌量為蝦體重的5%～8%，視攝食情況進(jìn)行調(diào)整。每天觀察記錄蝦體的攝食、活動(dòng)及死亡情況，定期進(jìn)行吸污、換水和施藥防病等工作。

1.3.2蝦苗活力檢測

具體測定方法參照廖永巖等[13]。活力情況分為三個(gè)等級(jí)：差、一般、好。一個(gè)水族箱有50% ～ 80%的蝦苗對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏，游泳時(shí)有明顯的方向性，靜憩時(shí)頭部高昂，步足和腹肢支撐有力，尾扇張開，則活力一般；若有80%以上，則活力為好；若在50%以下，則活力為差。

1.3.3滲透壓測定方法

因蝦苗長度只有0.2 cm，所以每組取相同質(zhì)量的全蝦，低溫勻漿，用去離子水稀釋到0.5 mL，10 000 r/min冷凍離心10 min，吸取上清液，采用Fiske 210微型冰點(diǎn)滲透壓儀測定滲透壓。

1.3.4Real-time PCR 檢測基因表達(dá)

將全蝦用液氮研磨，使用Invitrogen公司的Trizol試劑盒進(jìn)行總RNA提取。用核酸蛋白儀進(jìn)行定量分析及純度鑒定，1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用Invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照Real Master MIX (SYBR Green)試劑盒(ABI 公司)說明書進(jìn)行操作，同時(shí)設(shè)置無模板陰性對(duì)照，采取兩步PCR 法，95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃變性10 s，60 ℃復(fù)性1 min，40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增引物為β-actin F/R (5′-TGACGGAGCGTGGCTACAC-3′,5′-CCACGTCGCACTTCATGATG-3′)和Na+/K+-ATPase F/R (5′-AAGGCTGGAAGGCTCTGTCT-3′,5′-GGGTCGTTCTTATCCTCGGT-3′)。反應(yīng)在Agilent Stratagene MX3005P 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行,數(shù)據(jù)采用2-△△CT方法分析[14]。

1.3.5Na+/K+- ATPase活力測定方法

酶液制備：取相同質(zhì)量的全蝦，用預(yù)冷的蒸餾水(0～4 ℃)洗凈、濾紙吸干后置于5 mL冰冷酶提取液(0.25 mmol/L蔗糖，6 mmol/L EDTA-Na2，10 mmol/L Tris，0.1%脫氧膽酸鈉，pH 7.5)中，勻漿5 min，10 000 r/min冷凍離心30 min，吸取上清再離心10 min，將所得上清液冷藏保存，8 h內(nèi)測定Na+/K+-ATPase活力。

酶活力測定：酶蛋白含量采用Bradford(1976)方法[15]測定。Na+/K+-ATPase活力測定采用南京建成超微量試劑盒(A070-2)進(jìn)行測定。以每小時(shí)每毫克蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位來計(jì)算，酶活力單位為微摩爾無機(jī)磷每毫克蛋白小時(shí)[μmol Pi/(mg pr·h)]表示。

1.4數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS statistics 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包用單因素方差分析(One-way ANOVA)的方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行組間多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1水體鹽度與對(duì)蝦苗存活率和活力的影響

由表1可知，養(yǎng)殖水體鹽度由12‰下降到0‰過程中，存活率始終維持較高的水平，在鹽度0‰仍能達(dá)到90.5%。鹽度的降低對(duì)蝦苗的活力影響并不大，在整個(gè)淡化過程中，蝦苗的活力較好。蝦苗對(duì)水體鹽度的變化能夠較好適應(yīng)。

表1　淡化對(duì)南美白對(duì)蝦蝦苗存活率和活力的影響

2.2水體鹽度與水體滲透壓、蝦體滲透壓的關(guān)系

由圖1可知，養(yǎng)殖水鹽度由12‰下降到0‰過程中，蝦苗滲透壓表現(xiàn)出隨鹽度下降而下降的趨勢。12‰下降到9‰時(shí)，蝦體滲透壓下降坡度較大，趨勢明顯； 9‰下降到0‰的過程中，下降坡度趨于平緩，蝦體滲透壓變化不大。養(yǎng)殖水體滲透壓與鹽度變化基本成線性關(guān)系，而蝦苗滲透壓曲線與水體鹽度變化沒有一定的線性關(guān)系，兩條曲線的焦點(diǎn)即為南美白對(duì)蝦蝦苗的等滲點(diǎn)，此時(shí)水體鹽度為8‰左右，滲透壓約380 mOsm，說明蝦苗水體鹽度對(duì)全蝦滲透壓有影響，但不明顯。

2.3水體鹽度與蝦體滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因Na+/K+-ATPase表達(dá)水平的關(guān)系

當(dāng)水體鹽度由12‰下降至9‰時(shí)，Na+/K+-ATPase mRNA表達(dá)水平急劇上升，差異顯著(P<0.05)，但水體鹽度進(jìn)一步降低至6‰時(shí)，表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；水體鹽度由6‰下降到0‰時(shí)基因表達(dá)繼續(xù)下調(diào)，且在0‰表達(dá)量達(dá)到最低(圖2)。

圖1　不同鹽度下蝦體滲透壓

圖2　不同鹽度下Na+/K+-ATPase基因的表達(dá)水平

(注：a,b,c表示基因表達(dá)水平的是否有顯著差異，相同字母之間沒有差異，不同字母之間有顯著差異)

2.4水體鹽度與Na+/K+-ATPase活力高低的關(guān)系

由圖3可知，養(yǎng)殖水體由12‰下降到0‰過程中，滲透壓相關(guān)最主要酶Na+/K+-ATPase活力的變化與基因表達(dá)呈相同的趨勢。在水體鹽度由12‰下降到9‰時(shí)，酶活力上升，在9‰下降到0‰過程中，先下降，后呈平穩(wěn)趨勢；其中在水體鹽度為9‰時(shí)活力最高，與其他鹽度下相比差異顯著(P<0.05)。

圖3　不同鹽度下Na+/K+-ATPase的活力

(注：a,b,c表示基因表達(dá)水平的是否有顯著差異，相同字母之間沒有差異，不同字母之間有顯著差異)

3討論

南美白對(duì)蝦是廣鹽性的蝦類，具有較強(qiáng)的滲透壓自我調(diào)節(jié)能力，能適應(yīng)在淡水中生活[13]。研究表明，養(yǎng)殖水體鹽度由12‰下降到0‰過程中，南美白對(duì)蝦幼苗的存活率較高，活力始終維持一個(gè)較高的水平。這與廖永巖等[13]研究淡化對(duì)凡納濱對(duì)蝦幼體存活和活力影響的結(jié)果一致，暗示了南美白對(duì)蝦對(duì)淡化過程中鹽度的變化有一個(gè)很好的適應(yīng)過程。

已有研究表明，南美白對(duì)蝦能在低鹽甚至淡水環(huán)境中正常生長，是因?yàn)槠渚哂休^強(qiáng)的滲透壓自我調(diào)節(jié)能力[2-5]。本研究觀察到南美白對(duì)蝦蝦體的滲透壓在水體滲透壓變化的過程中沒有直接相關(guān)性，雖然有一定的波動(dòng)，但是影響不大，這可能與蝦體對(duì)于自身滲透壓的調(diào)節(jié)有關(guān)。Huong等[16]研究低鹽對(duì)滲透離子調(diào)節(jié)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，極低鹽度下(0.5和1)南美白對(duì)蝦滲透壓變化很快，說明蝦苗在低鹽時(shí)的滲透壓調(diào)節(jié)能力很強(qiáng)。水體鹽度的變化對(duì)蝦體滲透壓影響不大，這可能是南美白對(duì)蝦適應(yīng)淡水生存的主要原因。

滲透壓調(diào)節(jié)可分成細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)，分別由不同的滲透壓調(diào)節(jié)因子進(jìn)行調(diào)節(jié)。細(xì)胞內(nèi)主要靠有機(jī)離子來調(diào)節(jié)，其中又以游離氨基酸占絕大部分，而細(xì)胞外滲透壓主要靠血液、淋巴中無機(jī)離子來調(diào)節(jié)，如Na+，K+等，可能與滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)及Na+/K+-ATPase活力有關(guān)[17]。南美白對(duì)蝦在低鹽度(12‰以下)下變化過程中，具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)能力，這可能與細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子都有一定的聯(lián)系。

在南美白對(duì)蝦中，很多基因參與滲透壓調(diào)節(jié)，其中最為重要的調(diào)節(jié)基因是各種離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶。在甲殼動(dòng)物中離子轉(zhuǎn)運(yùn)的酶包括Na+/K+-ATPase、V-ATPase和HCO3-ATPase和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase，CA)等[18]，其中Na+/K+-ATPase活力占轉(zhuǎn)運(yùn)酶活力的70%[21]，大量研究表明水體鹽度變化會(huì)導(dǎo)致甲殼動(dòng)物體內(nèi)Na+/K+-ATPase活性的顯著變化，鹽度是激發(fā)南美白對(duì)蝦滲透壓調(diào)節(jié)的最主要環(huán)境因素[19-22]。南美白對(duì)蝦蝦苗經(jīng)海南運(yùn)入長沙實(shí)驗(yàn)基地后，水體鹽度保持育苗時(shí)的鹽度，即12‰。為適應(yīng)湖南本地的淡水養(yǎng)殖，需進(jìn)行蝦苗淡化，以適應(yīng)當(dāng)?shù)氐?，所以本?shí)驗(yàn)從水體12‰鹽開始淡化。當(dāng)水體鹽度由12‰下降到9‰時(shí)，Na+/K+-ATPase基因表達(dá)水平及酶活力呈上升趨勢，可能是蝦苗為適應(yīng)水體鹽度變化的一種“應(yīng)激反應(yīng)”，以適應(yīng)當(dāng)前的水體鹽度變化；當(dāng)水體鹽度進(jìn)一步下降時(shí)，Na+/K+-ATPase表達(dá)水平和酶活力又緩慢下降，逐漸平緩，并保持在一定水平，可能是適應(yīng)了淡水水體的滲透壓。與其它研究結(jié)果一致，鹽度變化會(huì)影響甲殼動(dòng)物離子轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性，偏離等滲點(diǎn)時(shí)，不管是降低鹽度或是升高鹽度，離子轉(zhuǎn)移酶活力都會(huì)不同程度地升高，且低鹽度水體下，南美白對(duì)蝦Na+/K+-ATPase活力較高[23]。

綜上所述，南美白對(duì)蝦對(duì)低鹽環(huán)境的耐受力較強(qiáng)，Na+/K+-ATPase可能在低鹽脅迫過程中對(duì)南美白對(duì)蝦體內(nèi)滲透壓的調(diào)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Effects of desalination on survival rate,osmolality and Na+/K+-ATPase activity of Penaeus vannamei

TANG Jian-zhou1,2,LIU Zhen1,2,WANG Xin-lei1,QI Shao-wu3,BAI Lian-yang4,ZHANG Jian-chang2,ZHANG Yi2,LIU Yong-hu1,LIU Zheng-xuan1

(1.DepartmentofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ChangshaUniversity,Changsha410003,China;2.ChangdeJiahuaAquaticScienceandTechnologyCo.,LTD,Changde415523,Hunan,China;3.HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China;4.HunanAcademyofAgriculturalScience,Changsha410125,China)

Abstract：The methods of Fiske 210 freezing point osmometer,real-time PCR and enzymes activity were carried out to analyze the effects of desalination on the survival rate,osmolality,the Na+/K+-ATPase mRNA levels and activities of the Penaeus vannamei.The results showed a high level in survival rate and vigor of shrimps under low salinity stress.Further study found that desalination had no significant effect on shrimp osmolality,although a decrease in shrimp osmolality with decreasing salinity (from 12‰ to 0‰) was observed.Moreover,the mRNA expression levels and activities of Na+/K+-ATPase showed a statistically significant increase with decreasing salinity (from 12‰ to 9‰) but then declines gradually from 9‰ to 6‰ salinity and remains stable from 6‰ to 0‰ salinity.The study provides some basic data for desalination culture of P.vannamei.

Key words：desalination;Penaeus vannamei;survival rate;osmolality;Na+/K+-ATPase

收稿日期：2015-05-18；

修訂日期：2015-11-24

第一作者簡介：唐建洲(1979-)，男，在讀博士，從事水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)研究。E-mail：49071398@qq.com通訊作者：劉臻。E-mail：25300085@qq.com

中圖分類號(hào)：S968.22

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6907-(2016)03-0082-05

資助項(xiàng)目：湖南省教育廳優(yōu)秀青年項(xiàng)目(13B144)；湖南省高校產(chǎn)業(yè)化培育項(xiàng)目(13CY031);長沙市科技局重點(diǎn)項(xiàng)目(K1509006-21),湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(508);長沙學(xué)院校級(jí)重點(diǎn)課題(CDJJ-15010205)。