3種單花蜜總黃酮含量測定的比較

薛茗閣+卜翠萍+趙祥祥+紀(jì)麗蓮

摘要：采用酶標(biāo)儀微量法，以蘆丁為對照品對市售不同品牌的3種單花蜜（棗花蜜、紫云英蜜、洋槐蜜）總黃酮含量進(jìn)行測定比較。結(jié)果表明，3種單花蜜均含有黃酮類化合物，且不同單花蜜間總黃酮含量存在顯著性差異，其中棗花蜜的總黃酮含量最高（1.72 mg/100 g），紫云英蜜次之（1.26 mg/100 g），洋槐蜜含量最低（1.11 mg/100 g）；不同品牌瓶裝單花蜜間總黃酮含量不同，品牌2的3種單花蜜總黃酮含量均低于品牌1和品牌3。因此，蜂蜜中總黃酮含量可作為不同單花蜜品質(zhì)評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)之一；酶標(biāo)儀微量法具有簡便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于蜂蜜及相關(guān)產(chǎn)品的快速檢測。

關(guān)鍵詞：蜂蜜；總黃酮；酶標(biāo)儀微量法

中圖分類號(hào)： S896.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）04-0341-02

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1]。根據(jù)蜜源植物不同，分為單花蜜和雜花蜜?！侗静菥V目》中將蜂蜜的藥用功效描述為清熱、補(bǔ)中、解毒、潤燥、止痛[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證明蜂蜜具有增強(qiáng)免疫力，治療胃腸道疾病、呼吸道疾病、心臟病和不同炎癥的療效[3]。黃酮類化合物是蜂蜜中主要的有效成分之一，主要來自植物花蜜、花粉和蜂膠，以配基和糖苷形式存在[4]。由于其對人體內(nèi)自由基有明顯的清除作用，并可抑制細(xì)胞的凋亡，常是治療心血管疾病藥物的主要成分。不同的單花蜜中黃酮類化合物種類和含量差別很大，而同種單花蜜中產(chǎn)地不同含量也可能相差懸殊[5-6]。已有研究報(bào)道，根據(jù)蜂蜜中黃酮類化合物含量的不同，評價(jià)蜂蜜質(zhì)量、推測蜂蜜地理來源[7-8]。

常見的黃酮成分含量測定方法有高效液相色譜法、紫外分光光度計(jì)比色法、酶標(biāo)儀微量法。高效液相色譜法所需樣品劑量少，但操作復(fù)雜、成本較高。紫外分光光度計(jì)比色法操作簡便、節(jié)約成本，但樣品用量大。酶標(biāo)儀微量法同時(shí)具有所需試劑用量少、單次測樣多、效率高等優(yōu)點(diǎn)，是測量總黃酮含量的理想方法，正逐漸被廣大科研工作者所采用。本試驗(yàn)選用酶標(biāo)儀微量法對市場銷量較大的3種單花蜜總黃酮含量進(jìn)行測定比較，希望利用簡單準(zhǔn)確的檢測方法為蜂蜜質(zhì)量的綜合評價(jià)及消費(fèi)者的選購提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于淮安市大型超市購買銷售量較好的3種品牌瓶裝單花蜜（洋槐蜜、棗花蜜、紫云英蜜），所選品牌均為2014年中國蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)抽檢合格產(chǎn)品。

蘆丁對照品（Sigma公司）；無水三氯化鋁、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；超聲波清洗器KQ-500B（昆山市超聲儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 RE-2000（上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水式多用真空泵 SHZ-D（III）（鞏義市英裕予華儀器廠）；BS210S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精確稱取干燥至恒質(zhì)量的蕓香苷對照品20 mg，加甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得 0.2 mg/mL 蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確移取對照品溶液0.00、008、0.16、0.24、0.32、0.40、0.48 mL，分別置于2 mL Ep管中，各加水 0.32 mL，加0.08 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置6 min，加0.08 mL 10% 硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，加0.80 mL 4% 氫氧化鈉溶液，再加水至刻度，搖勻，放置15 min。在510 nm處用酶標(biāo)儀測定吸光度。以蕓香苷質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：y=7.757 9x-0.000 9（r2=0.999 2）。蕓香苷對照品溶液在0～0.048 mg/mL 范圍內(nèi)吸光度和濃度線性關(guān)系良好。

1.3.2 樣品溶液的制備 參考張文霽等[9]、羅顯來等[10]的方法，分別準(zhǔn)確稱取3種單花密各3種不同品牌的9種蜂蜜25 g于錐形瓶中，加入無水乙醇25 mL，在常溫下超聲萃 取25 min，重復(fù)3次，合并萃取所得上清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，用甲醇溶解定容于10 mL容量瓶中，作為樣品溶液。

1.3.3 樣品總黃酮含量測定 取0.16 mL樣品溶液置于 2 mL Ep管中，依照“1.3.1”節(jié)的方法測定吸光值，同時(shí)取 0.16 mL 甲醇代替待測液處理作空白對照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測液的總黃酮濃度，計(jì)算出樣品中濃度，單位為 mg/100 g 蜂蜜，以蕓香苷計(jì)。

1.4 試驗(yàn)方法考察

對樣品溶液和檢測方法，分別進(jìn)行精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)等。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均測定3次，分析和處理結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)方法為單因素方差分析，Duncans檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總黃酮含量測定結(jié)果

3種單花蜜總黃酮含量均在1.00 mg/100 g以上，其中棗花蜜總黃酮含量最高（1.72 mg/100 g），紫云英蜜次之（1.26 mg/100 g），洋槐蜜含量最低（1.11 mg/100 g）。不同單花蜜間總黃酮含量存在顯著性差異，單花蜜中總黃酮的含量與蜜源植物的種類密切相關(guān)（表1）。

不同品牌瓶裝單花蜜的總黃酮含量也存在一定差異。品牌2中3種單花蜜的總黃酮含量均低于品牌1和品牌3；3種品牌的棗花蜜總黃酮含量變化較大，品牌2棗花蜜黃酮含量明顯低于品牌1和品牌3；紫云英蜜品牌1和品牌3中黃酮含量相近，略高于品牌2；洋槐蜜3種品牌的黃酮含量變幅最小，無顯著性差異。蜂蜜產(chǎn)地、加工工藝、保存時(shí)間等因素均可引起單花蜜總黃酮含量的不同（圖1）。

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

量取同一蜂蜜樣品溶液，在相同波長條件下，連續(xù)檢測6次，測得吸光值RSD為2.16%，表明儀器精密度良好。稱取同一蜂蜜樣品溶液，分別在0、20、40、60、80、100、120 min的放置時(shí)間進(jìn)樣，測定吸光值RSD為0.56%，表明樣品在 120 min 內(nèi)穩(wěn)定。稱取同一蜂蜜25 g共6份，按照樣品溶液制備方法，計(jì)算含量RSD為1.16%，表明該方法重復(fù)性好。精確量取已知黃酮含量的蜂蜜供試品溶液，平行3組，3組中分別加入蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品0.05、0.20、0.50 mg，按上述制備方法和條件進(jìn)行處理和測定，計(jì)算平均加樣回收率為91.67%，RSD為2.11%，回收率良好。

3 討論

黃酮作為生物活性物質(zhì)，在不同蜜源植物中的含量不同。Yao等研究產(chǎn)于澳大利亞的5種單花蜜（Melaleuca honey，Guioa honey，Lophostemon honey，Banksia honey和Helianthu honey）發(fā)現(xiàn)Melaleuca honey含量最高，為6.35 mg/100 g，Helianthu honey含量最低，為1.79 mg/100 g，5種單花蜜總黃酮含量差異顯著，可有效地區(qū)分蜂蜜來源[11]。郭夏麗等利用高效液相色譜法對江西地區(qū)棗花蜜、紫云英蜜、洋槐蜜中的總黃酮進(jìn)行含量測定，比較得到棗花蜜黃酮含量最高，洋槐蜜最低[25]，本研究結(jié)果與之相一致。孫蘭鳳等檢測沈陽地區(qū)棗花蜜黃酮含量（4.68 μg/g）也高于槐花蜜（3.16 μg/g）[12]。但不同地區(qū)相同單花蜜間黃酮含量存在一定差異。此外，加工工藝、保存條件和保存時(shí)間等因素也會(huì)影響黃酮含量[13]。

黃酮類化合物可以和鋁離子形成絡(luò)合物而顯色，常采用比色法測定總黃酮含量。酶標(biāo)儀微量法相比較傳統(tǒng)紫外分光光度計(jì)法，檢測原理、操作方法、結(jié)果判定基本一致，不同之處是所需樣品試劑用量更少、單次檢測樣品更多、耗時(shí)更短。本研究測得的方法學(xué)考察結(jié)果中RSD值均小于5%，表明酶標(biāo)儀微量法測定蜂蜜中黃酮含量具有較高的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率，滿足試驗(yàn)要求，可替代傳統(tǒng)的紫外分光光度計(jì)，用于大批量蜂蜜樣品的快速測試。果葡糖漿勾兌的假蜂蜜中沒有源于植物的黃酮類物質(zhì)，通過檢測黃酮的含量及種類，可以判斷蜂蜜的真假，評價(jià)蜂蜜的質(zhì)量。我國于2011年正式實(shí)施GB 14963—2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 蜂蜜》，其中對理化指標(biāo)進(jìn)行了相應(yīng)修改，但還未將總黃酮含量納入其中，建議加入黃酮含量指標(biāo)，為蜂蜜質(zhì)量控制評價(jià)提供更全面的科學(xué)依據(jù)。

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