13個(gè)中國(guó)葡萄優(yōu)新品種的分子身份證構(gòu)建

王慧玲閆愛(ài)玲孫磊張國(guó)軍王曉玥徐海英

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，北京 100093；2.北京市落葉果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

13個(gè)中國(guó)葡萄優(yōu)新品種的分子身份證構(gòu)建

王慧玲1，2閆愛(ài)玲1，2孫磊1，3張國(guó)軍1王曉玥1徐海英1

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所，北京 100093；2.北京市落葉果樹(shù)工程技術(shù)研究中心，北京 100093；3.農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093）

以近年來(lái)選育的13個(gè)葡萄優(yōu)新品種為試材，進(jìn)行親緣關(guān)系分析，構(gòu)建分子身份證，為中國(guó)葡萄品種鑒定和新品種保護(hù)提供一定的參考。利用國(guó)際通用的9對(duì)引物對(duì)供試葡萄品種進(jìn)行SSR分析，并根據(jù)引物對(duì)不同品種擴(kuò)增條帶分子量的大小進(jìn)行賦值編碼。結(jié)果表明，該9對(duì)引物在供試葡萄品種間共檢測(cè)出48個(gè)等位基因，每對(duì)引物平均檢測(cè)到等位基因數(shù)為5.3個(gè)；期望雜合度的范圍在0.435-0.811之間；多態(tài)性信息含量變幅為0.401-0.784。同時(shí)基于SSR分析結(jié)果得到編碼各異的品種分子身份證，該分子編碼可以將13個(gè)葡萄品種進(jìn)行有效區(qū)分。聚類(lèi)分析顯示13個(gè)品種根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近聚為不同類(lèi)別。

葡萄；優(yōu)新品種；SSR；分子身份證

葡萄屬葡萄科（Vitaceae）葡萄屬（Vitis L.），是全球性果樹(shù)之一，品種繁多，分布廣泛。我國(guó)是世界上葡萄栽培面積較大的國(guó)家之一，目前全國(guó)入圃保存的葡萄種質(zhì)資源也有2 000份左右［1］，并且每年都會(huì)有多個(gè)新品種出現(xiàn)，因此進(jìn)行品種保護(hù)、品種鑒定及譜系分析等工作不僅對(duì)苗木繁育具有重要意義，也是保護(hù)這些品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)的需要。

SSR（Simple sequence repeat）分子標(biāo)記技術(shù)具有重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高及簡(jiǎn)便快速等特點(diǎn)［2］，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于葡萄種質(zhì)鑒別［3］、遺傳多樣性分析［4，5］、親緣關(guān)系鑒定［6，7］及分子遺傳圖譜構(gòu)建［8］等方面，同時(shí)也成為葡萄指紋圖譜構(gòu)建的有效工具［9］。尹玲等［10］對(duì)我國(guó)近年來(lái)新育成的24個(gè)鮮食葡萄品種，利用6對(duì)國(guó)際通用的SSR熒光標(biāo)記引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并利用毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離，建立了這些葡萄品種的指紋圖譜。近幾年，研究者在遺傳圖譜基礎(chǔ)上提出了“分子身份證”的概念，并將它賦予品種本身作為識(shí)別品種的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。分子身份證是在指紋圖譜的基礎(chǔ)上將種質(zhì)的特征數(shù)字化，即每個(gè)種質(zhì)都擁有一個(gè)屬于自己的字符串形式的代碼，達(dá)到更加簡(jiǎn)單明了區(qū)分種質(zhì)的目的。在果樹(shù)方面，研究者利用SSR標(biāo)記分別構(gòu)建了甜櫻桃、香蕉和桃等的分子身份證［11-13］。2013年，杜晶晶等［14］以國(guó)家葡萄品種資源圃?xún)?nèi)保存的80份葡萄種質(zhì)為試材，對(duì)利用SSR標(biāo)記構(gòu)建葡萄種質(zhì)分子身份證的方法進(jìn)行了探討，證明SSR標(biāo)記可以用于進(jìn)行葡萄的分子身份證構(gòu)建。

本研究選取北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所選育的13個(gè)葡萄優(yōu)新品種為試材，通過(guò)SSR標(biāo)記分析技術(shù)，分析它們的親緣關(guān)系，嘗試構(gòu)建13個(gè)品種的分子身份證，旨在為保護(hù)中國(guó)葡萄優(yōu)新品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，并為育成品種的分子鑒定奠定理論基礎(chǔ)，對(duì)中國(guó)葡萄遺傳育種及品種保護(hù)提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料均為北京市農(nóng)林科學(xué)院林業(yè)果樹(shù)研究所選育的優(yōu)新品種，共13份（表1），分別種植于所內(nèi)資源圃和溫室。在四月中旬采集各個(gè)葡萄品種幼葉液氮速凍，保存于-80℃冰箱，用于基因組DNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA提取參照Marsal等［15］的方法。從葡萄幼葉中提取基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用Eppendorf公司生產(chǎn)的Bio-Photometer核酸檢測(cè)儀檢測(cè)DNA溶液的濃度與純度，并將濃度稀釋至50 ng/μL。

1.2.2 DNA擴(kuò)增和電泳 本研究選取9對(duì)國(guó)際通用的SSR引物進(jìn)行擴(kuò)增（表2），其中6個(gè)標(biāo)記（VVMD5、VVMD7［16］、VVMD27、VVS2［17］、VRZAG62及VRZAG79［18］）曾被This等［19］推薦為葡萄品種篩選的核心標(biāo)記。引物由上海生工合成，每對(duì)引物合成2OD，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA擴(kuò)增采用20 μL體系。其中含：10×PCR buffer，引物0.25 μmol/L，模板DNA 50 ng，dNTP 0.2 mmol/L，rTaq DNA 聚合酶0.5 U。用于SSR-PCR 反應(yīng)的dNTP、Taq酶、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司。

PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，65℃-55℃退火15 s，72℃延伸1 min，10個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，25個(gè)循環(huán)；4℃保存。PCR反應(yīng)在美國(guó)Bio-Rad公司生產(chǎn)的9600 Thermal Cycler型PCR儀上進(jìn)行。然后取PCR產(chǎn)物4 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色，膠干后在清華紫光e100 掃描儀上成像保存。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用Powermarker軟件（Version 3.25）［20］對(duì)9個(gè)SSR標(biāo)記的遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理方法參考陳昌文等［11］的方法。根據(jù)每對(duì)引物對(duì)不同種質(zhì)擴(kuò)增片段對(duì)應(yīng)的分子量大小，按從小到大依次編碼為1-8。同時(shí)參考桃分子身份證的構(gòu)建方法，當(dāng)引物擴(kuò)增的某一品種等位基因有2個(gè)時(shí)，按等位基因堿基數(shù)較小的條帶編碼進(jìn)行賦值。并通過(guò)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立親緣關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 SSR引物擴(kuò)增多態(tài)性

通過(guò)改進(jìn)的CTAB方法提取全部實(shí)驗(yàn)材料的基因組DNA，通過(guò)電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，基因組DNA的濃度和純度均符合SSR實(shí)驗(yàn)要求。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，SSR擴(kuò)增條帶清晰。本實(shí)驗(yàn)所選用的9對(duì)SSR引物在供試葡萄品種中共檢測(cè)到48個(gè)等位基因，平均每對(duì)引物擴(kuò)增的等位基因數(shù)是5.3個(gè)。最少的VVMD6和VrZAG29引物分別擴(kuò)增出3個(gè)等位基因，VrZAG79擴(kuò)增的等位基因數(shù)最多為8個(gè)，其中有5對(duì)引物的等位基因數(shù)超過(guò)平均數(shù)（表2）。等位基因數(shù)越多，表明該引物更能反應(yīng)品種之間的差異。其中VVMD5和VVMD7對(duì)13個(gè)品種擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，13個(gè)品種分別有6個(gè)等位基因。盡管9對(duì)引物的多態(tài)性不高，但是足以區(qū)分這13個(gè)葡萄品種。

利用Powermaker軟件對(duì)9個(gè)SSR標(biāo)記在13個(gè)葡萄品種中的主等位基因頻率、期望雜合度、觀測(cè)雜合度及擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)信息含量等進(jìn)行了計(jì)算分析。結(jié)果（表3）表明，擴(kuò)增位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度在0.385-0.846之間，平均值為0.641。期望雜合度的范圍在0.435-0.811之間，平均值為0.638。多態(tài)性信息含量PIC變幅為0.401-0.784，平均為0.598。 VrZAG79引物的PIC值最高，結(jié)合期望雜合度值及等位基因數(shù)值，該引物對(duì)本研究供試葡萄品種的區(qū)分能力最強(qiáng)。

表1 13個(gè)葡萄品種名稱(chēng)及分子身份證編碼

2.2 分子身份證構(gòu)建

根據(jù)電泳結(jié)果，對(duì)9對(duì)引物在供試種質(zhì)擴(kuò)增的等位基因譜帶大小分布范圍進(jìn)行賦值。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中引物擴(kuò)增最多的等位基因數(shù)為8，所以賦值范圍為1-8（表4）。為了保證分子身份證字符串的每位上只有1個(gè)字符，對(duì)同一引物下的擴(kuò)增條帶只選擇位點(diǎn)較小的進(jìn)行分子編碼。

根據(jù)表4中等位基因的賦值標(biāo)準(zhǔn)和各引物對(duì)品種的擴(kuò)增結(jié)果，對(duì)13份供試葡萄品種進(jìn)行分子編碼，結(jié)果（表1）顯示，用選取的9對(duì)引物可以將13個(gè)品種進(jìn)行有效區(qū)分。但是因?yàn)槠贩N親緣關(guān)系較近，進(jìn)行分子編碼最少也需要8對(duì)引物才能夠?qū)⑺衅贩N區(qū)分開(kāi)，如瑞都紅玫和瑞都早紅的分子編碼比較相似，在第8對(duì)引物時(shí)才區(qū)分開(kāi)。另外在所構(gòu)建的13個(gè)品種分子身份證中，有7個(gè)品種具有至少一個(gè)特異等位基因。紫珍珠、早玫瑰香和瑞都脆霞各具有一個(gè)特異等位基因，艷紅、早瑪瑙和峰后各具有2個(gè)特異等位基因，瑞都無(wú)核怡則具有3個(gè)特異等位基因。

2.3 供試葡萄品種親緣關(guān)系分析

根據(jù)本研究所用的9對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，利用POWERMAKER軟件，采用UPGMA法對(duì)所有品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，聚類(lèi)結(jié)果（圖2）顯示，親緣關(guān)系近的多聚為一類(lèi)，如父母本相同的瑞都紅玫、瑞都早紅、瑞都脆霞和瑞都香玉聚在一起，而瑞都紅玉為瑞都香玉的芽變，也聚為一類(lèi)。紫珍珠和早玫瑰香親本相同聚為一類(lèi)。艷紅、早瑪瑙愛(ài)神玫瑰與香妃聚為一個(gè)大類(lèi)，他們都有相同的親本玫瑰香。該聚類(lèi)結(jié)果清楚地反應(yīng)了品種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。

3 討論

采用9對(duì)SSR引物對(duì)13個(gè)葡萄品種進(jìn)行了分子身份證構(gòu)建和親緣關(guān)系分析。平均等位基因數(shù)（5.3）、期望雜合度（0.435-0.811）和引物多態(tài)性信息含量（0.401-0.784）方面顯示，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果都較低（表3）。Guo等［21］利用相同引物在32個(gè)中國(guó)葡萄品種擴(kuò)增平均位點(diǎn)數(shù)11.5，期望雜合度0.740-0.915，多態(tài)性信息含量0.716-0.908。本研究結(jié)果也低于Moreno-Sanz等［22］采用相同引物在西班牙品種中的擴(kuò)增結(jié)果?？赡苁怯捎?3個(gè)供試葡萄品種來(lái)源于相同的育種單位，許多品種父母本相同，親緣關(guān)系較近，選育品種的性狀相似，導(dǎo)致品種遺傳多樣性較低。但是通過(guò)這9個(gè)分子標(biāo)記，也可以將13個(gè)葡萄品種完全區(qū)分開(kāi)。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)標(biāo)記VrZAG79在本研究所用的13個(gè)中國(guó)葡萄品種中擴(kuò)增等位基因數(shù)最多，多態(tài)信息含量最高，這與Guo等［21］在32個(gè)中國(guó)葡萄品種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明VrZAG79可以作為區(qū)分中國(guó)葡萄品種的核心標(biāo)記之一。

表2 9對(duì)SSR引物的堿基序列及擴(kuò)增結(jié)果

表3 9個(gè)SSR標(biāo)記在13個(gè)供試葡萄品種的遺傳多樣性

表4 SSR引物擴(kuò)增基因譜帶大小/bp

在引物擴(kuò)增結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們采取最小等位基因編碼法［13］對(duì)13個(gè)葡萄品種進(jìn)行分子編碼。得到了13個(gè)葡萄品種編碼各異的分子身份證。在桃編碼中發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系較近的品種很難區(qū)分［13］，而本研究中，對(duì)于親緣關(guān)系較近的品種通過(guò)增加引物也得到了有效區(qū)分，如瑞都紅玫和瑞都早紅的區(qū)分等。本研究對(duì)來(lái)自同一育種單位親緣關(guān)系相同或較近的品種均可被有效區(qū)分，充分說(shuō)明我們所選取的引物足以區(qū)分親緣關(guān)系很近的不同材料，亦即利用SSR標(biāo)記構(gòu)建葡萄分子身份證具有較強(qiáng)的可靠性，可作為鑒別葡萄品種的一種有效方法。本實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果在一定程度上可以作為供試品種鑒定的依據(jù)，但在后期的大量鑒定中的適用性還需進(jìn)一步的驗(yàn)證。如果能將分子標(biāo)記和品種來(lái)源及表型性狀相結(jié)合來(lái)研究制定它們的分子身份證將會(huì)得到更加科學(xué)客觀的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1 VVMD5和VVMD7擴(kuò)增的等位基因特征

圖2 13個(gè)葡萄品種基于SSR的聚類(lèi)分析

4 結(jié)論

本研究采用國(guó)際通用的9對(duì)SSR引物，對(duì)13份中國(guó)葡萄優(yōu)新品種進(jìn)行了親緣關(guān)系分析，構(gòu)建了它們的有效分子身份證，再一次表明SSR分析技術(shù)可以作為葡萄品種分子身份證構(gòu)建的有效技術(shù)手段。

［1］ 劉崇懷, 馬小河, 武崗. 中國(guó)葡萄栽培品種［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2014.

［2］ Morgante M, Olivieri A. PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics［J］. The Plant Journal, 1993, 3（1）：175-182.

［3］ 吳子龍, 王軍, 沈育杰, 路文鵬. 8個(gè)山葡萄及山歐雜種葡萄品種的SSR分析［J］. 植物資源學(xué)報(bào), 2008, 9（1）：105-109.

［4］ 鄒瑜, 楊柳, 黃大輝, 等. 70份毛葡萄種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 44（12）：1943-1948.

［5］ Emanuelli F, Lorenzi S, Grzeskowiak L, et al. Genetic diversity and population structure assessed by SSR and SNP markers in a large germplasm collection of grape［J］. BMC Plant Biology, 2013, 13：39

［6］ 李慧, 羅正榮, 張青林. 基于SSR和IRAP標(biāo)記的‘關(guān)口葡萄’親緣關(guān)系分析［J］. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2014, 31（6）：1024-1027.

［7］ 溫景輝, 申海林, 鄒利人, 等. 20 份葡萄種質(zhì)親緣關(guān)系的SSR分析［J］. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2011, 28（5）：782-786.

［8］ Vezzulli S, Troggio M, Coppola G, et al. A reference integrated map for cultivated grapevine（Vitis vinifera L.）from three crosses, based on 283 SSR and 501 SNP-based markers［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2008, 117：499-511.

［9］ Karata H, De?irmenci D, Velasco R, et al. Microsatellite fingerprinting of homonymous grapevine（Vitis vinifera L. ）varieties in neighboring regions of South-East Turkey［J］. Scientia Horticulturae, 2007, 114：164-169.

［10］ 尹玲, 張晨, 向江, 等. 我國(guó)新育成葡萄品種SSR 指紋圖譜的建立［J］. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2015, 32（3）：366-373.

［11］ 艾呈祥, 張力思, 魏海蓉, 等. 甜櫻桃品種SSR指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立［J］. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 23（5）：55-58.

［12］ 王靜毅, 陳業(yè)淵, 黃秉智, 等. 部分香蕉品種SSR指紋圖譜的構(gòu)建［J］. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2009, 26（5）：733-738.

［13］ 陳昌文, 曹珂, 王力榮, 等. 中國(guó)桃主要品種資源及其野生近緣種的分子身份證構(gòu)建［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 44（10）：2081-2093.

［14］ 杜晶晶, 劉國(guó)銀, 魏軍亞, 等. 基于SSR 標(biāo)記構(gòu)建葡萄種質(zhì)資源分子身份證［J］. 植物研究, 2013, 33（2）：232-237.

［15］ Marsal G, Baiges I, Canals JM, et al. A fast, efficient method for extracting DNA from leaves, stems, and seeds of Vitis vinifera L. ［J］. American Journal of Enology and Viticulture, 2011, 62：376-381.

［16］ Bowers JE, Dangl GS, Vignani R, Meredith CP. Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape（Vitis vinifera L. ）［J］. Genome, 1996, 39：628-633.

［17］ Thomas MR, Scott NS. Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphisms when analyzed as sequence-tagged sites（STSs）［J］. Theoretical Applied Genetics, 1993, 86：985-990.

［18］ Sefc KM, Regner F, Turetschek E, et al. Identification of microsatellite sequences in Vitis riparia and their applicability for genotyping of different Vitis species［J］. Genome, 1999, 42（3）：367-373.

［19］ This P, Jung A, Boccacci P, et al. Development of a standard set of microsatellite reference alleles for identification of grape cultivars［J］. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 109（7）：1448-1458.

［20］ Liu K, Muse SV. PowerMarker：an integrated analysis environment for genetic marker analysis［J］. Bioinformatics, 2005, 21：2128-2129.

［21］ Guo DL, Zhang Q, Zhang GH. Characterization of grape cultivars from China using microsatellite markers［J］. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding, 2013, 49：164-170.

［22］ Moreno-Sanz P, Loureiro MD, Suárez B. Microsatellite characterization of grapevine（Vitis vinifera L. ）genetic diversity in Asturias（Northern Spain）［J］. Scientia Horticulturae, 2011, 129：433-440.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Molecular ID Establishment of 13 Chinese Newly-developed Grape Cultivars

WANG Hui-ling1，2YAN Ai-ling1，2SUN Lei1，3ZHANG Guo-jun1WANG Xiao-yue1XU Hai-ying1
（1. Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100093；2. Beijing Engineering Research Center for Deciduous Fruit Tree，Beijing 100093；3. Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture of P. R. China，Beijing 100093）

Using 13 newly-developed grape cultivars as experimental materials，the phylogenetic relationship among them were analyzed and their molecular IDs were established，which aimed to provide the references for identifying the grape cultivar and protecting the new ones. SSR analysis was carried out on the tested grape cultivars with the international commonly-used 9 pairs of primers，and the codes of each cultivar was assigned according to the molecular weight of the amplified band of different cultivar by the primer. The results showed：a total of 48 alleles and an average of 5.3 alleles per primer were detected by 9 pairs of primers. The expected heterozygosity varied between 0.435-0.811，and the information content of polymorphism ranged from 0.401 to 0.784. After alleles assignment and coded，the molecular IDs of cultivars were established，by which the 13 grape cultivars can be identified. According to the clustering analysis，13 cultivars showed clear separations due to their different parents.

grape；new cultivars；SSR；molecular ID

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.018

2015-07-21

科技創(chuàng)新能力建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)（KJCX20140110，KJCX20140202）

王慧玲，女，博士，助理研究員，研究方向：葡萄分子遺傳育種；E-mail：whlhappy@aliyun.com

徐海英，女，研究員，研究方向：葡萄遺傳育種；E-mail：haiyingxu63@sina.com