鹽芥TsGPX3基因的克隆、亞細(xì)胞定位與原核表達(dá)

王寧陳靜，2高飛李華云隋欣周宜君

（1. 中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100741）

鹽芥TsGPX3基因的克隆、亞細(xì)胞定位與原核表達(dá)

王寧1陳靜1，2高飛1李華云1隋欣1周宜君1

（1. 中央民族大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，北京 100081；2. 公安部物證鑒定中心，北京 100741）

以鹽芥（Thellungiella salsuginea）為材料，獲得TsGPX3的cDNA全長序列，其開放閱讀框（ORF）序列長591 bp，編碼196個氨基酸，具有GPXs家族的3個保守的特征結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，TsGPX3與同屬于十字花科的蘿卜RsGPX3、油菜BnGPX3和花椰菜BoGPX3等具有較高的同源性。構(gòu)建植物表達(dá)載體pRTL2-TsGPX3-GFP，利用PEG轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞進(jìn)行瞬時表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TsGPX3蛋白主要定位在細(xì)胞膜上。構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-TsGPX3，采用不同濃度IPTG對轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）的pET-TsGPX3進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了分子量約為27 kD的蛋白，該蛋白在37℃、誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h時可獲得較高的表達(dá)量。

TsGPX3；鹽芥；亞細(xì)胞定位；原核表達(dá)

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidases，GPXs）是維持細(xì)胞內(nèi)H2O2穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶［1］，它通過催化還原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）與H2O2反應(yīng)生成氧化型谷胱甘肽（GSSG）及水，從而阻止羥基自由基（·OH）的產(chǎn)生，避免由其引發(fā)的質(zhì)膜過氧化，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性［2］。由多個成員組成的GPXs廣泛存在于動物和植物中，目前已發(fā)現(xiàn)植物體GPXs為誘導(dǎo)型表達(dá)，在不同脅迫條件下，編碼GPXs基因的mRNA呈現(xiàn)不同水平的表達(dá)，GPXs在植物抗氧化過程中可能具有重要作用［3，4］，因此關(guān)于植物中GPXs的相關(guān)研究備受關(guān)注，包括GPXs家族成員的獲得、結(jié)構(gòu)特征的闡釋，以及應(yīng)答脅迫的表達(dá)模式和亞細(xì)胞定位等［5-7］。

鹽芥（Thellungiella salsuginea）是模式植物擬南芥的近緣物種，與擬南芥具有相似的生物學(xué)特征［8］，且二者的cDNA序列同源性高達(dá)90%-95%［9，10］，但屬于鹽生植物的鹽芥卻能夠在含有500 mmol/L NaCl的高鹽環(huán)境或 -15℃的低溫條件下生存［11］，具有強(qiáng)耐逆性。此外由于鹽芥具有模式植物的生物學(xué)特性，因此被作為耐鹽性研究的模式植物［12，13］。研究表明，擬南芥中AtGPXs由8個成員組成，其中AtGPX3不僅可以作為氧化信號傳感器，還能在干旱脅迫下清除植物體內(nèi)多余的脫落酸（Abscisic acid，ABA），響應(yīng)ABA和干旱脅迫，這種雙重機(jī)制在其他植物中也具有相似性［14］。本實(shí)驗(yàn)室前期對鹽芥TsGPXs家族的8個成員進(jìn)行了研究，皆具有3個典型的GPXs特征結(jié)構(gòu)域，同時在應(yīng)答不同脅迫時表達(dá)模式不同。在8個TsGPXs成員中，只有TsGPX3具有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于分泌蛋白，亞細(xì)胞定位預(yù)測分析顯示可能定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或質(zhì)膜上［7］。本研究通過構(gòu)建植物表達(dá)載體、利用PEG介導(dǎo)擬南芥原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)進(jìn)行TsGPX3亞細(xì)胞定位研究；構(gòu)建原核表達(dá)載體，對蛋 白表達(dá)條件進(jìn)行初步研究，旨在為進(jìn)一步研究TsGPX3與鹽芥抗逆性關(guān)系及植物GPXs的功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

鹽芥山東生態(tài)型種子為本實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol試劑購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、pGEM-T載體、pET28a、限制性內(nèi)切酶Nde I和Sal I購自Promega公司，大腸桿菌（Escherchia coli）DH5α和BL21（DE3）購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司，pRTL2表達(dá)載體由北京師范大學(xué)惠贈，限制性內(nèi)切酶Xho I和Xba I購自Fermentase公司，ECL試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，考馬斯亮藍(lán)R-250購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，PVDF膜購自Millipore公司，辣根過氧化酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，根據(jù)鹽芥TsGPXs蛋白序列設(shè)計(jì)的鹽芥TsGPX特異抗體（TsGPX-A）由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心制備。

1.2 方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 室內(nèi)培養(yǎng)鹽芥實(shí)生苗，培養(yǎng)基質(zhì)為營養(yǎng)土∶蛭石= 3∶1的混合土，培養(yǎng)條件為光周期16 h/d，光照強(qiáng)度93 μmol/（m2·s），相對濕度60%/80%（晝/夜），溫度為23℃/18℃（晝/夜），用Hoagland營養(yǎng)液澆灌。生長8周后，以Hoagland營養(yǎng)液配制300 mmol/L NaCl溶液，采用根灌法處理鹽芥幼苗12 h后取樣，迅速凍于液氮中，保存于-80℃，用于總RNA的提取。

1.2.2 鹽芥總RNA的提取與鹽芥TsGPX3基因全長的獲得 采用Trizol法提取鹽芥總RNA。以鹽芥總RNA為模板，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，操作步驟按說明書進(jìn)行。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期獲得的TsGPX3基因序列設(shè)計(jì)引物，引物序列為F1：5'-TGTCGATGCCTAAATCAAGC-3'/ R1：5'-GAAAATGAGATTCACACTGGTACTC-3'。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸50 s，共30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶，回收產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并送至北京華大基因公司進(jìn)行測序。

1.2.3 鹽芥TsGPX3系統(tǒng)進(jìn)化分析 在NCBI搜索與TsGPX3同源性較高的16種植物GPX3序列，采用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.4 鹽芥TsGPX3的亞細(xì)胞定位 對TsGPX3基因序列和含有綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，GFP）的植物表達(dá)載體pRTL2-GFP進(jìn)行酶切圖譜分析，設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的引物F2：5'-CCGCT CGAGCGATGCCTAAATCAAGCACTTGG-3'（下劃線部分為Xho I的酶切位點(diǎn)）/ R2：5'-GCTCTAGATCA AGCAGATGCCAATAGCTTC-3'（下劃線部分為Xba I的酶切位點(diǎn)）。利用限制性內(nèi)切酶Xho I 和Xba I將TsGPX3構(gòu)建入pRTL2的C端GFP載體中，獲得重組質(zhì)粒pRTL2-TsGPX3-GFP，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中，菌液PCR鑒定與測序驗(yàn)證。

制備擬南芥葉片細(xì)胞的原生質(zhì)體，將鑒定正確的重組質(zhì)粒pRTL2-TsGPX3-GFP和空載體pRTL-GFP分別以PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP標(biāo)簽的表達(dá)。

1.2.5 鹽芥TsGPX3的原核表達(dá) 設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)的引物F3：5'-GGGAATTCCATATGCGATGCCTAAATCAAGCACTTGG-3'（下劃線部分為Nde I酶切位點(diǎn)）/ R3：5'-ACGCGTCGACTCAAGCAGATGCCAATAGCTTC-3'（下劃線部分為Sal I的酶切位點(diǎn)）。利用限制性內(nèi)切酶Nde I和Sal I將 TsGPX3構(gòu)建入pET28a載體中，獲得重組質(zhì)粒pET-TsGPX3。將重組質(zhì)粒pET-TsGPX3和pET28a空載體分別轉(zhuǎn)化至E.coli BL21（DE3）中，篩選陽性克隆進(jìn)行酶切與測序驗(yàn)證。

分別將含有重組質(zhì)粒pET-TsGPX3和空載體pET28a的E.coli BL21（DE3）接種于含氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）的10 mL LB液體培養(yǎng)基，于37℃條件下振蕩培養(yǎng)。在菌液到達(dá)對數(shù)期（OD600為0.8左右）時加入終濃度為1 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)。分別取1 mL菌液，在37℃下分別培養(yǎng)1、2、3、4和5 h，以確定最佳表達(dá)時間。分別取1 mL菌液，在16℃、28℃和37℃分別培養(yǎng)5 h時，以確定最佳表達(dá)溫度。分別收集上述條件下所得菌體。每個樣品取5 μL進(jìn)行SDSPAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)R-250染色，檢測融合蛋白的表達(dá)情況。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白的Western blotting檢測 SDS-PAGE電泳后，將未進(jìn)行染色的凝膠轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜（轉(zhuǎn)膜15 V，30 min），加入5%脫脂奶封閉液，于 100 r/min的搖床上室溫封閉30 min。加入一抗（TsGPX-A抗體），于100 r/min的搖床上37℃孵育1 h，用TBST洗3遍，5 min/次。加入二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG），于100 r/min的搖床上37℃孵育1 h，用TBST洗3遍，5 min/次。用ECL試劑盒進(jìn)行顯色，將試劑盒A、B液1∶1混合配成2 mL溶液，室溫孵育PVDF膜1 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察。

2 結(jié)果

2.1 鹽芥TsGPX3基因的擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化分析

以引物序列F1/R1 擴(kuò)增TsGPX3的全長cDNA序列，大小為776 bp，其中6-596 bp為開放閱讀框（ORF），編碼196個氨基酸（圖1）。TsGPX3蛋白的理論相對分子量為23.258 kD，理論等電點(diǎn)為7.33。TsGPX3具有植物GPX蛋白活性中心的3個保守Cys（C）殘基以及3個保守特征結(jié)構(gòu)域（催化結(jié)構(gòu)域NVASKCG、標(biāo)志性基序ILAFPCNQF和PHGPX的特征基序KWNFAKFL），且3個保守結(jié)構(gòu)域中各含有1個催化氨基酸殘基，即C、Q和W（圖2）。

圖1 鹽芥TsGPX3基因全長cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 TsGPX3的核苷酸及推測的氨基酸序列

為了研究TsGPX3的進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 5.0對TsGPX3及與TsGPX3同源性較高的16種植物GPX3序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果（圖3）顯示，鹽芥TsGPX3與同屬于十字花科的蘿卜（Raphanus sativus）RsGPX3、油菜（Brassica napus）BnGPX3、花椰菜（Brassica oleracea）BoGPX3、擬南芥（Arabidopsis lyrata）AlyGPX3和擬南芥（A. thaliana）At-GPX3同源性較高，聚為一類。與非十字花科的高粱（Sorghum bicolor）SbGPX3、玉米（Zea mays）ZmGPX3、水稻（Oryza sativa）OsGPX3、大麥（Hordeum vulgare）HvGPX3、藍(lán)桉樹（Eucalyptus globulus）EglGPX3、巨桉（Eucalyptus grandis）EgrGPX3以及小麥（Triticum aestivum）TaGPX3-1A、TaGPX3-1B、Ta-GPX3-1D的同源性較低。另外，研究發(fā)現(xiàn)，上述物種與萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CreGPX3和小立碗蘚（Physcomitrella patens）PpaGPX3的同源關(guān)系均較遠(yuǎn)。

圖3 鹽芥TsGPX3及其他植物GPX3序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 TsGPX3基因的亞細(xì)胞定位

將pRTL2空載體和經(jīng)過鑒定的pRTL2-TsGPX3-GFP載體以PEG介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，結(jié)果見圖4。pRTL2空載體亞細(xì)胞定位結(jié)果（圖4-A）顯示，GFP熒光蛋白在細(xì)胞的各個部位都有表達(dá)，顯示清晰的GFP綠色熒光信號。pRTL2-TsGPX3-GFP載體亞細(xì)胞定位結(jié)果（圖4-B）顯示，TsGPX3∷GFP融合蛋白僅在細(xì)胞膜位置產(chǎn)生熒光，由此推測TsGPX3基因所編碼的蛋白主要定位在細(xì)胞膜上，與生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果基本一致。

2.3 鹽芥TsGPX3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

以未被IPTG誘導(dǎo)的pET28a空載體為對照，將經(jīng)過鑒定的含有重組質(zhì)粒pET-TsGPX3的E.coli BL21（DE3）在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)1、2、3、4和5 h后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果（圖5-A）顯示，含有pET-TsGPX3表達(dá)載體的E.coli BL21（DE3）在不同誘導(dǎo)條件下、在27 kD附近都出現(xiàn)1條新的特異條帶，與TsGPX3預(yù)測大小基本一致，pET28a空載體沒有特異蛋白表達(dá)。在5個誘導(dǎo)時間（1、2、3、4和5 h）處理中，TsGPX3融合蛋白的表達(dá)呈逐漸上升趨勢，在5 h達(dá)到最高；在3個處理溫度（16℃、28℃和37℃）下表達(dá)5 h，TsGPX3融合蛋白的表達(dá)量逐漸增加，在37℃時達(dá)到最高。采用Western blotting對誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白能夠與抗體發(fā)生特異反應(yīng)，證明表達(dá)產(chǎn)物為目的蛋白（圖5-B）。

3 討論

作為生物體抗氧化酶防御體系的關(guān)鍵酶之一，谷胱甘肽過氧化物酶（GPXs）通過多種信號途徑在植物響應(yīng)逆境中發(fā)揮重要作用［15］。本研究獲得的鹽芥TsGPX3基因所編碼的蛋白含有植物GPXs蛋白活性中心的3個保守Cys（C）殘基以及植物GPXs的3個保守特征結(jié)構(gòu)域，且在3個保守結(jié)構(gòu)域中均具有3個GPXs催化殘基Cys70（C）、Gln101（Q）和Trp159（W），說明本研究獲得的TsGPX3屬于植物GPXs家族。與其他植物GPX3進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，TsGPX3與同屬于十字花科物種的GPX3親緣關(guān)系最近，而與非十字花科物種的GPX3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明在進(jìn)化過程中，不同科屬植物物種的GPX3序列發(fā)生了一定的變化。

圖4 空載體（A）及鹽芥TsGPX3（B）亞細(xì)胞定位結(jié)果

圖5 pET-TsGPX3在E.coli BL21（DE3）中表達(dá)的SDSPAGE檢測（A）和Western blotting鑒定（B）

植物GPXs家族有多個成員，不同成員的亞細(xì)胞定位與其行使的生物學(xué)功能相關(guān)。采用PSORT 在線分析軟件進(jìn)行鹽芥TsGPXs 8個成員的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，TsGPX1和TsGPX7定位在葉綠體中，TsGPX2、TsGPX4、TsGPX5和TsGPX8定位在細(xì)胞質(zhì)溶質(zhì)中，TsGPX6定位在線粒體中，而TsGPX3定位在細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，且具有信號肽［7］。構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究表明，鹽芥TsGPX6主要定位在線粒體和內(nèi)體中［16］。本研究通過亞細(xì)胞定位研究顯示TsGPX3定位于細(xì)胞膜上，與預(yù)測基本相符。由于膜上分布眾多的載體蛋白、與細(xì)胞活動相關(guān)的離子泵、通道蛋白和蛋白受體等，因此推測TsGPX3對細(xì)胞質(zhì)膜的穩(wěn)定或控制蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)具有一定的作用［17］。已有研究顯示擬南芥［14］、楊樹［5］和百脈根［6］GPX3定位在細(xì)胞質(zhì)中，而鹽芥TsGPX3與其不同，主要定位在細(xì)胞膜上，其不同物種的GPX3亞細(xì)胞定位差異可能與抗逆功能有關(guān)，有待進(jìn)一步探究。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)［18］，但融合蛋白在該系統(tǒng)中的表達(dá)結(jié)果可受多種因素影響，如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑的濃度、誘導(dǎo)時間等。已有研究顯示TsGPX8的原核表達(dá)融合蛋白大小約為23 kD，最佳表達(dá)條件為37℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h［19］。本研究構(gòu)建了TsGPX3的原核表達(dá)載體并進(jìn)行了原核表達(dá)蛋白的分析。前期預(yù)測的TsGPX3的分子量約為23 kD，將TsGPX8與His-tag融合后分子量大約為27 kD，與原核表達(dá)電泳圖顯示的結(jié)果一致。采用Western blotting驗(yàn)證誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白，證明表達(dá)產(chǎn)物為目的蛋白。與TsGPX8原核表達(dá)體系的表達(dá)條件相似，從本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，TsGPX3原核表達(dá)體系在37℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h具有較高的蛋白表達(dá)量。

4 結(jié)論

鹽芥TsGPX3基因的全長cDNA序列大小為776 bp，編碼一個包含196個氨基酸的蛋白，具有植物GPXs的特征結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，鹽芥TsGPX3與同屬于十字花科的蘿卜RsGPX3、油菜BnGPX3和花椰菜BoGPX3等同源性較高。亞細(xì)胞定位研究顯示TsGPX3主要定位于細(xì)胞膜上。TsGPX3原核表達(dá)體系在37℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h具有較高的蛋白表達(dá)量。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning，Subcellular Localization and Prokaryotic Expression of Gene TsGPX3 from Thellungiella salsuginea

WANG Ning1CHEN Jing1，2GAO Fei1LI Hua-yun1SUI Xin1ZHOU Yi-jun1
（1. College of Life and Environmental Sciences，Minzu University of China，Beijing 100081；2. Institute of Forensic Science，Ministry of Public Security of P. R. China，Beijing 100741）

A cDNA of TsGPX3（Thellungiella salsuginea GPX3）was isolated from T. salsuginea，and it contained a complete ORF with 591 bp encoding 196 amino acid residues. The three conservative domains of TsGPX3 protein in GPXs family was predicted by bioinformatics analysis. Phylogenetic analysis discovered that TsGPX3 was in high homology with RsGPX3 of Raphanus sativus，BnGPX3 of Brassica napus，and BoGPX3 of B. oleracea etc.，all belonging to Brassicaceae. The plant-expressed vector pRTL2-TsGPX3-GFP was transiently expressed by transforming the protoplasts of Arabidopsis thaliana via PEG method，and it was discovered that the TsGPX3 protein was mainly located in the plasma membrane. The constructed prokaryotic vector pET-TsGPX3 was transferred into Escherichia coli strain BL21（DE3）for induced expression under different concentration of IPTG，and a 27 kD recombinant protein was highly expressed after induced for 5 h at 37℃.

TsGPX3；Thellungiella salsuginea；subcellular localization；prokaryotic expression

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.014

2015-07-09

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31370356，31070361），中央民族大學(xué)一流大學(xué)一流學(xué)科項(xiàng)目（YLDX01013，2015MDTD08C），中央民族大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（2015）

王寧，女，碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)，E-mail：wzpn123@163.com；陳靜為本文并列第一作者

周宜君，女，博士，教授，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：queenzhou@263.net