真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展

劉家揚(yáng)焦國(guó)寶有小娟廖祥儒孫利鵬

（1. 黃淮學(xué)院生物工程系，駐馬店 463000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，三門(mén)峽 472400；3. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122）

真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用研究進(jìn)展

劉家揚(yáng)1，2焦國(guó)寶2有小娟1廖祥儒3孫利鵬2

（1. 黃淮學(xué)院生物工程系，駐馬店 463000；2. 河南仰韶生化工程有限公司，三門(mén)峽 472400；3. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122）

作為一種含銅的多酚氧化酶，真菌漆酶比細(xì)菌漆酶、植物漆酶等具有更好的熱穩(wěn)定性、金屬離子耐受性及更高的底物催化氧化性，在工農(nóng)業(yè)及環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用中得到了較高的關(guān)注。目前普遍認(rèn)為，限制漆酶廣泛應(yīng)用的因素在于漆酶的生產(chǎn)規(guī)模、成本與性質(zhì)。真菌漆酶的生產(chǎn)模式包括固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵，工業(yè)生產(chǎn)基本以液體發(fā)酵為主。除了在染料脫色、染織廢水處理、紙漿漂白等過(guò)程中的應(yīng)用，最新的研究不斷拓展了漆酶新的用途，對(duì)近年來(lái)真菌漆酶的發(fā)酵生產(chǎn)、酶學(xué)性質(zhì)及應(yīng)用研究中的最新結(jié)果進(jìn)行了概述。

白腐真菌；漆酶；發(fā)酵；酶學(xué)性質(zhì)；應(yīng)用

漆酶（EC 1.10.3.2）是一種含銅的多酚氧化酶，以分子氧作為最終電子受體，能催化一大類酚類及芳胺類物質(zhì)的聚合、降解及轉(zhuǎn)化。由于具有廣泛的底物作用性，漆酶作為一種綠色生物催化劑在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品、環(huán)保和醫(yī)藥等領(lǐng)域均有巨大的應(yīng)用潛力，具有廣闊的市場(chǎng)前景［1］。漆酶的研究可以追溯到1883年，日本學(xué)者吉田發(fā)現(xiàn)了漆樹(shù)汁液中的一種蛋白可以使汁液氧化變硬?，F(xiàn)在研究表明，漆酶在自然界中廣泛存在，在植物、動(dòng)物、細(xì)菌和真菌中等都發(fā)現(xiàn)了漆酶或漆酶的類似物，但其主要生產(chǎn)者還是真菌，尤其是白腐真菌。漆酶在不同來(lái)源的生物中起著不同的生理作用。漆酶活性中心含有4個(gè)銅原子，在底物的催化過(guò)程中起著電子轉(zhuǎn)移的作用。由于具有廣泛的底物作用性，漆酶已經(jīng)在很多領(lǐng)域得到應(yīng)用。本文就近年來(lái)真菌漆酶的性質(zhì)、生產(chǎn)及應(yīng)用研究作一綜述，供研究者參考。

1 白腐真菌及胞外木質(zhì)素降解酶系

1.1 白腐真菌

真菌界是生物圈中一個(gè)重要的分支，在自然界生物進(jìn)化及物質(zhì)的循環(huán)中有著不可或缺的地位。木腐菌因能生長(zhǎng)在木質(zhì)材料上引起腐爛或腐朽而得名，英文名為wood-rotting fungi、wood-destroying fungi、wood-decay fungi等［2，3］。根據(jù)引起木材腐變類型的不同，可以將木腐菌分為白腐菌（white-rot fungi）、褐腐菌（brown-rot fungi）和軟腐菌（soft-rot fungi）3類［4］。白腐菌能選擇性地降解木材中的木質(zhì)素或同時(shí)降解木質(zhì)素及纖維素，使白色的纖維素暴露出來(lái)呈纖維狀連接，因此木質(zhì)腐變成白色［5］。常見(jiàn)的白腐真菌有栓菌屬（Trametes）、側(cè)耳屬（Pleurotus）、木耳屬（Auricularia）、密孔菌屬（Pycnoporus）和傘菌屬（Agaricus）等［6］。在白腐真菌的研究歷史中較為經(jīng)典的是黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）［7］。

白腐真菌在自然界生態(tài)系統(tǒng)的碳循環(huán)中起著非常重要的作用。木質(zhì)纖維類生物質(zhì)是自然界中最大的有機(jī)碳源庫(kù)，主要包括木質(zhì)素、纖維素和半纖維素等成分。植物在光合作用下固定的碳約有20%用來(lái)合成木質(zhì)素，而這些木質(zhì)素約占木質(zhì)干重的25%-30%，纖維素被這些木質(zhì)素包裹著并與之形成復(fù)雜的木材基質(zhì)，用以保護(hù)植物免受微生物的侵染［8］。木質(zhì)素是一類“頑強(qiáng)的”酚類生物大分子，基本結(jié)構(gòu)單元是苯基丙烷，是形成松伯醇、芥子醇和香豆醇的前體物質(zhì)［9］，木質(zhì)素的降解在木材的腐爛及降解中起限制性作用。目前唯一能對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行實(shí)質(zhì)性并徹底降解的微生物就是白腐真菌［10］。

1.2 白腐真菌的胞外酶系

白腐真菌對(duì)木質(zhì)纖維素的降解利用主要依靠其菌絲強(qiáng)大的穿透能力及胞外相關(guān)酶系的協(xié)調(diào)作用而實(shí)現(xiàn)。真菌的胞外木質(zhì)素降解酶系主要包括兩大類：過(guò)氧化物酶（peroxidases，PODs）類及漆酶（laccase）。PODs又包括4類：即木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（LiP）、錳過(guò)氧化物酶（MnP）、versatile peroxidase（VP）和generic peroxidase（GP）［10］。研究表明，這些酶類直接或間接參與木質(zhì)素的降解，黃孢原毛平革菌的LiP借助其表面的色氨酸殘基（Trp171），通過(guò)一系列的電子轉(zhuǎn)移能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)木質(zhì)素的直接降解；MnP中的殘基Glu35、Glu39和Asp175，可以結(jié)合Mn并發(fā)生相關(guān)的催化作用［10］。漆酶較LiP與MnP而言存在一定的爭(zhēng)議［11］，有的學(xué)者認(rèn)為漆酶不能降解木質(zhì)素，只有LiP及MnP才是真正能降解木質(zhì)素的酶；但同時(shí)也有研究表明漆酶失活（deactivation）的鮮紅密孔菌（Pycnoporus cinnabarinus）突變株不具備去除木質(zhì)素的能力，而野生菌則可以有效對(duì)紙漿漂白及脫除木質(zhì)素［12］。白腐真菌中通常含有5-26個(gè)這些酶的基因拷貝，因此能有效地降解木質(zhì)素，褐腐菌卻沒(méi)有［10］。某些真菌如扁韌革菌可同時(shí)分泌漆酶、LiP和MnP［13］，然而并非所有的白腐菌都能同時(shí)分泌這3種酶，如灰隔孢伏革菌僅分泌漆酶［14］。

2 漆酶簡(jiǎn)介

2.1 漆酶來(lái)源及分泌形式

漆酶（EC 1. 10. 3. 2）是一種多酚氧化酶，可氧化酚類和芳香胺類化合物，同時(shí)將分子氧還原成水，是一種綠色催化劑。漆酶最早于1883年在漆樹(shù)的汁液中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)研究表明漆酶其實(shí)廣泛存在于自然界中，如植物、真菌、細(xì)菌、動(dòng)物及昆蟲(chóng)中［15］。進(jìn)一步的研究表明，漆酶屬于銅藍(lán)氧化酶家族，其活性中心和抗壞血酸氧化酶、血漿銅藍(lán)蛋白及膽紅素氧化酶的活性中心極為相似［16，17］。漆酶在不同的生物體中充當(dāng)著不同的角色，主要參與木質(zhì)化、去木質(zhì)化、真菌形態(tài)發(fā)生、去毒、植物感染和植物氧化脅迫等過(guò)程［15］。自然界中真菌是漆酶的主要產(chǎn)生菌，包括擔(dān)子菌、子囊菌及半知菌等，其中又以是擔(dān)子菌門(mén)的白腐真菌為主［2］。漆酶一般以同工酶的形式被分泌出來(lái)，少數(shù)真菌僅分泌1種漆酶，多數(shù)真菌會(huì)分泌2種甚至更多種的同工酶，如灰隔孢伏革菌可分泌8種漆酶同工酶［14］。漆酶同工酶的分子量、活力和等電點(diǎn)等極為相似，其最大的不同在于其表達(dá)量及穩(wěn)定性有差異［18，19］。此外，即使是同一種真菌，當(dāng)以不同的形式生長(zhǎng)時(shí)，所產(chǎn)的漆酶也會(huì)有差異，如香菇（Lentinula edodes）有分泌型的漆酶lcc1及在子實(shí)體中的形式lcc4（非分泌型）［20］。這可能是真菌適應(yīng)生存環(huán)境的一種機(jī)制。

2.2 漆酶的活力測(cè)定方法

由于漆酶具有廣泛的底物特異性，因此測(cè)定漆酶活力的方法較多。目前常用的方法主要有分光光度法［21］及HPLC法等［22］。用分光光度法測(cè)定漆酶的活力時(shí)常見(jiàn)的底物有ABTS、丁香醛連氮、阿魏酸、DMP及愈創(chuàng)木酚等［23］。不同來(lái)源的漆酶對(duì)不同底物的親和力及催化能力不同，表現(xiàn)出不同的Km和Vmax；同一種酶用不同的底物測(cè)定所得出的酶活力也相差較大。以酚類物質(zhì)為底物測(cè)定漆酶的活力時(shí)，容易受到酚類物質(zhì)自氧化的干擾，尤其在酶活力低到一定范圍時(shí)干擾更大［24］。酶活的測(cè)定方法不同，酶活力的定義也不同，漆酶的活力一般定義為1 min內(nèi)催化1 μmol底物或產(chǎn)生1 μmol產(chǎn)物所需要的酶量，但也有人用反應(yīng)體系在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值每增加1為一個(gè)酶活單位［25］。目前有關(guān)漆酶的文獻(xiàn)中，使用的漆酶測(cè)定方法及測(cè)定體系差異較大，對(duì)酶活、產(chǎn)量之間的比較存在一定的難度［26］。

3 真菌漆酶性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特征

3.1 漆酶的理化特性

3.1.1 漆酶的分子量 真菌漆酶的分子量一般在50-90 kD之間，尤其在擔(dān)子菌漆酶中比較普遍［6，27-29］。最近的研究還發(fā)現(xiàn)了小分子量的漆酶，如灰隔孢伏革菌所分泌的同工酶中分子量較小的僅有26.2 kD［14］。

3.1.2 漆酶的等電點(diǎn) 真菌漆酶多為酸性蛋白，如灰隔孢伏革菌所分泌的同工酶其等電點(diǎn)為3-6之間［14］，雜色云芝漆酶等電點(diǎn)為4.2［27］，密孔菌L3漆酶等電點(diǎn)為4.7［28］。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)等電點(diǎn)為堿性的真菌漆酶，如側(cè)耳屬真菌POXA1a與POXA1b漆酶的等電點(diǎn)分別為6.7及6.9［6］。

3.1.3 漆酶的糖基化 漆酶一般都有不同程度的糖基化，其含糖量為10%-30%，分子中的糖可能為阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖及葡萄糖的一種或多種［30］。Phanerochaete flavido-alba漆酶分子量為98.7 kD，去掉糖基后變?yōu)?1.3 kD，即含糖17.7%［31］，然而番茄灰霉菌漆酶的含糖量可高達(dá)70%［30］。糖基可能對(duì)胞外漆酶的分泌、活性中心的維持、防止蛋白酶的降解、溫度穩(wěn)定及pH穩(wěn)定等構(gòu)像有重要影響［32，33］。漆酶的活力除受菌種來(lái)源的影響外，可能還受糖基化及含糖量的影響。

3.1.4 漆酶的氧化還原電勢(shì) 真菌漆酶一般低于漆樹(shù)漆酶的氧化還原電勢(shì)，表現(xiàn)出更高的催化活性。影響漆酶氧化還原電勢(shì)的因素很多，如分子量、與銅原子配位的氨基酸的差異等。真菌漆酶的氧化還原電勢(shì)一般為0.4-0.8 V，其中又可以分為兩類：0.4-0.6 V為低電勢(shì)，如灰蓋鬼傘漆酶；0.6-0.8 V為高電勢(shì)，如云芝漆酶，其分子中I銅原子附近獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得該漆酶具有較高的電勢(shì)，為0.78-0.79 V［15］。某些真菌如擔(dān)子菌C30漆酶的電勢(shì)非常低，僅有0.17 V［34］。

3.1.5 漆酶的最適反應(yīng)條件（溫度、pH值） 漆酶的最適反應(yīng)溫度和pH值具有很強(qiáng)的底物依賴性。最適反應(yīng)溫度普遍偏高，50-80℃較為常見(jiàn)，如密孔菌L3漆酶催化不同底物的最適溫度在55-75℃之間［28］。Zhang等［35］研究的云芝漆酶，以DMP為底物時(shí)最適溫度則高達(dá)85℃。有些真菌漆酶則嗜好較低的催化溫度，膠質(zhì)射脈革菌（Phlebia tremellosa）漆酶的最適溫度僅為20℃［36］。大多數(shù)漆酶在酸性的環(huán)境下能發(fā)揮其最大的催化活性，最適pH值在2-5之間［28］。個(gè)別真菌漆酶的最適pH值在中性，只有極少數(shù)的真菌漆酶在堿性的條件下有高效的催化能力，如Panaeolus papilionaceus漆酶以DMP為底物時(shí)的最適pH值為8.0［6］。

3.1.6 漆酶的穩(wěn)定性（溫度、pH值） 真菌漆酶普遍具有良好的熱穩(wěn)定性。云芝栓菌漆酶在65℃和75℃下的半衰期分別為5 h和70 min［35］，朱紅栓菌漆酶在70℃時(shí)的半衰期為60 min［37］，密孔菌漆酶在70℃及60℃時(shí)的半衰期分別為3 h、5 h［28］。盡管大部分漆酶都在酸性范圍內(nèi)有最高的催化效率，很多真菌漆酶在中性及偏堿性條件下（pH值為6-10）保存比較穩(wěn)定［28，38］。通過(guò)對(duì)漆酶進(jìn)行固定化可以有效提高漆酶對(duì)溫度、pH值及抑制劑等的穩(wěn)定性，擴(kuò)大漆酶的應(yīng)用范圍［39］。

3.1.7 漆酶的激活及抑制 漆酶的活性會(huì)受到金屬離子如銅離子、錳離子等的激活，有的則被抑制。鐵離子、銀離子及汞離子通常抑制漆酶的活性［28］。此外，鹵化物、硫化物、碳酸鹽、有機(jī)溶劑等也可抑制漆酶活性［15］，如二硫蘇糖醇、巰基乙醇、疊氮化鈉、L-半胱氨酸和碘化鉀等對(duì)漆酶抑制效果比較大，有機(jī)溶劑中甲醇、乙醇和乙腈等對(duì)漆酶影響不大，二甲亞砜則明顯抑制漆酶的活力［19，38，40］。不同的抑制劑對(duì)漆酶的抑制機(jī)理互不相同，如羥基甘氨酸和脂肪酸通過(guò)阻礙底物進(jìn)入漆酶的結(jié)合部位而抑制了漆酶的催化能力，鹵化物則阻礙了電子通往三核銅位點(diǎn)的路徑［15］。

3.2 漆酶的催化特性

漆酶具有廣泛的底物作用性，能催化一系列底物的氧化，諸如單酚、二酚、多酚、二胺、芳香胺、甲基酚、抗壞血酸及非酚類的化合物等［41］，其主要機(jī)理為通過(guò)單電子的轉(zhuǎn)移體系并伴隨著分子氧作為電子受體進(jìn)而被還原為水［42］。漆酶分子中的銅離子在催化過(guò)程中起著重要的作用，漆酶介導(dǎo)的催化過(guò)程主要有3步：（1）底物將I類銅離子還原；（2）I類銅離子將電子傳遞給含有二類和三類銅原子組成的三核中心；（3）在三核中心氧被還原為水（圖1）。

漆酶催化不同的底物時(shí)其機(jī)理不盡相同，小分子酚類化合物如α-萘酚、兒茶酚等通常在漆酶的介導(dǎo)下形成二聚體、三聚體等聚合物并進(jìn)一步發(fā)生沉淀［43，44］。當(dāng)小分子介體（如HBT）存在時(shí)，漆酶對(duì)酚類化合物的聚合作用常被抑制，而漆酶對(duì)這些化合物的降解作用則占主導(dǎo)［45］。但對(duì)于某些非酚類大分子，如環(huán)境中的污染物、激素和染料等，漆酶則無(wú)法直接作用。漆酶的氧化還原電勢(shì)比非酚類化合物的氧化還原電勢(shì)低，因此漆酶通常不能催化此類底物的氧化或分解，但如果存在電子轉(zhuǎn)移介體的情況下，漆酶也可以作用于非特異性底物［46］。介體可以起著橋梁的作用，首先被漆酶氧化，然后再介導(dǎo)底物的氧化。常見(jiàn)的介體有：ABTS、1-hydroxybenzotriazole（HBT）、N-hydrox yphthalimide（NHPI）、3-hydroxyanthranilic acid和violuric acid（VIO）等［3，47］。漆酶介體體系（LMS）已被廣泛地用于紙漿的脫木質(zhì)素、燃料電池、有機(jī)污染物的轉(zhuǎn)化、生物傳感器及染料的降解等。

圖1 漆酶對(duì)酚類底物催化的過(guò)程

圖2 Trametes versicolor漆酶的空間結(jié)構(gòu)（二級(jí)結(jié)構(gòu)）

3.3 漆酶的結(jié)構(gòu)特征

到目前為止，已經(jīng)有很多真菌漆酶被結(jié)晶出來(lái)用以結(jié)構(gòu)分析。下面以Trametes versicolor為例對(duì)漆酶的空間結(jié)構(gòu)做一說(shuō)明：如圖2［48］，漆酶分子成球形（大小為7 × 5 × 5 nm），主要由折疊結(jié)構(gòu)組成，其次有少量的無(wú)規(guī)則卷曲和極少量的螺旋結(jié)構(gòu)；漆酶分子中有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，T1銅離子（Cu 1）位點(diǎn)位于第3個(gè)結(jié)構(gòu)域，T2/T3銅離子（Cu2、Cu3a和Cu3b）位于另外兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的交界處，為三核中心；漆酶為糖基化蛋白，糖結(jié)合位點(diǎn)分別位于N54、N217、N333及N436；催化疏水口袋位于左側(cè)中間位置，在Cu1附近，該處的電子云密度比較稀疏，有較大的空間來(lái)容納底物，如底物2，5-二甲基苯胺（左側(cè)中間的棍棒結(jié)構(gòu)）；漆酶催化底物時(shí)，從底物獲得電子（His 458起著重要的作用），然后將電子從Cu1位點(diǎn)傳遞到Cu2/Cu3位點(diǎn)的三核中心，氧配位結(jié)合在Cu2/Cu3位點(diǎn)處，在此處氧被還原成水。也有研究發(fā)現(xiàn)雜色云芝（Coriolus versicolor）漆酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有更多的α-螺旋（68%），并非β-折疊［27］。

4 漆酶的生產(chǎn)

研究表明，真菌既可以固態(tài)培養(yǎng)也可以液態(tài)培養(yǎng)，但二者在漆酶產(chǎn)量及生產(chǎn)成本等方面具有差異，目前漆酶的生產(chǎn)多采用液態(tài)發(fā)酵方法。

4.1 真菌漆酶的生產(chǎn)周期

大部分真菌在培養(yǎng)的初始階段僅有菌體的生長(zhǎng)而幾乎沒(méi)有漆酶的分泌，漆酶的大量合成主要集中在培養(yǎng)的第二階段，即漆酶為次生代謝產(chǎn)物［13］，因此真菌漆酶的生產(chǎn)周期普遍較長(zhǎng)，幾天甚至幾十天。扁韌革菌在第4 d時(shí)到達(dá)產(chǎn)酶高峰（約25 U/mL）［13］，密孔菌L3液體培養(yǎng)6 d后產(chǎn)酶72 U/mL［49］，栓菌在第6 d時(shí)最高酶活為18 U/mL［50］，虎皮香菇菌在優(yōu)化后的培養(yǎng)基中培養(yǎng)11 d時(shí)產(chǎn)酶2.2 U/mL［51］，Lentinus sp.在培養(yǎng)16 d時(shí)酶活達(dá)到58 U/mL的最高活力［38］，木硬孔菌則需要24 d的培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到產(chǎn)酶高峰［52］。與液體發(fā)酵相比，固態(tài)培養(yǎng)真菌產(chǎn)漆酶所需要的周期更長(zhǎng)，如側(cè)耳需要50 d［53］，密孔菌L3以柳枝稷（switchgrass）為培養(yǎng)基質(zhì)時(shí)分泌漆酶的高峰在36 d［54］。

4.2 培養(yǎng)基組成的影響

培養(yǎng)基的組成對(duì)真菌分泌漆酶的影響較大，尤其是碳源和氮源，其中碳氮比對(duì)漆酶分泌的影響尤其顯著，一般在“氮饑餓”時(shí)漆酶的分泌會(huì)增強(qiáng)［55］。真菌用于自身生長(zhǎng)及合成漆酶所需要的碳源有：甘油、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖、纖維二糖、蔗糖、纖維素及一些木質(zhì)纖維類生物質(zhì)等。常用的氮源包括：酒石酸銨、磷酸氫二銨、氯化銨、尿素、酵母膏、豆粕和玉米漿等［14］，其中有些不僅可充當(dāng)?shù)?，同時(shí)具有漆酶誘導(dǎo)劑的作用，如玉米漿等［56］。

4.3 培養(yǎng)條件的影響

影響微生物發(fā)酵產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件主要有溫度、pH值、轉(zhuǎn)速和接種量等。大部分漆酶產(chǎn)生菌嗜好的培養(yǎng)條件為：轉(zhuǎn)速150-250 r/min，溫度25-35℃，培養(yǎng)基pH值2-6［57，58］，如Lentinus sp.相對(duì)喜歡較低的溫度（25℃）和轉(zhuǎn)速（150 r/min）［38］。真菌產(chǎn)漆酶的最適初始pH值多為酸性?；⑵は愎降呐囵B(yǎng)基初始pH值為5.0，培養(yǎng)溫度28℃，搖瓶轉(zhuǎn)速140 r/min［51］。在機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐上，轉(zhuǎn)速對(duì)大部分真菌生物量及漆酶的產(chǎn)量影響較大，但有的真菌則不受影響［2］，如Fenice等［59］發(fā)現(xiàn)虎皮香菇在3 L攪拌式發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)最佳的轉(zhuǎn)速是500 r/min。培養(yǎng)基中的溶氧水平受轉(zhuǎn)速及通氣量的影響（在搖瓶中主要受轉(zhuǎn)速的影響），攪拌式發(fā)酵罐上通氣量為1.0 VVm（即每分鐘的通氣量等同于培養(yǎng)基的體積）時(shí)似乎對(duì)很多真菌的產(chǎn)酶都有利。

4.4 提高漆酶產(chǎn)量的策略

對(duì)漆酶進(jìn)行誘導(dǎo)是提高漆酶產(chǎn)量常用的方法，其中銅離子［51］、醇類［60］、芳香族化合物等常被用作漆酶的誘導(dǎo)劑［56，61］。誘導(dǎo)劑的添加時(shí)期也是影響漆酶分泌的因素之一，如Lentinus sp.是在培養(yǎng)3 d后添加終濃度2 mmol/L的二甲基苯胺來(lái)對(duì)漆酶進(jìn)行分泌誘導(dǎo)［38］。反轉(zhuǎn)錄PCR分析表明，二甲基苯胺等通過(guò)提高漆酶基因的轉(zhuǎn)錄水平而使漆酶的分泌水平提高，而芳香化合物則可能是激發(fā)了漆酶啟動(dòng)子上的外源化合物響應(yīng)原件（XRE），進(jìn)而促使漆酶大量的分泌［51］。

4.5 漆酶的生產(chǎn)規(guī)模

目前關(guān)于漆酶的生產(chǎn)研究大部分集中在搖瓶水平上，僅有少部分菌株在發(fā)酵罐水平上得到嘗試，整體發(fā)酵規(guī)模偏小。在發(fā)酵罐水平上比較有潛力的真菌菌株主要是栓菌屬（Trametes）和密孔菌屬（Pycnoporus）［2］。單色云芝在20 L攪拌式發(fā)酵罐中生長(zhǎng)14 d后達(dá)到最高的漆酶產(chǎn)量142 000 nkat/L［62］，絨毛栓菌在20 L攪拌式發(fā)酵罐中產(chǎn)酶高達(dá)333 U/mL，流加后產(chǎn)生更高的酶活力740 U/mL［63，64］。Liu等［49］在65 L氣升式發(fā)酵罐中培養(yǎng)Pycnoporus sp. SYBC-L3菌株，在第6 d達(dá)到漆酶最高活72 U/mL。

4.6 漆酶的異源表達(dá)

由于漆酶的后加工過(guò)程比較復(fù)雜，其中涉及引導(dǎo)肽的切除等過(guò)程，因此真菌漆酶一般需要在真核生物中異源表達(dá)［2］。真菌漆酶由1 500-2 500 bp左右的核苷酸編碼520左右的氨基酸所組成，如Lentinus sp.漆酶lcc3的cDNA包括1 563 bp的堿基，編碼含有521個(gè)氨基酸殘基的多肽［38］。真菌漆酶基因一般包含數(shù)量不等的外顯子，如虎皮香菇漆酶lac1和lac2的基因分別有9個(gè)和4個(gè)外顯子［51］。現(xiàn)在已經(jīng)有很多真菌漆酶的基因被克隆并在黑曲霉及李氏木霉等菌株中異源表達(dá)［2］。此外，漆酶基因的表達(dá)具有一定的宿主選擇性，如香菇漆酶基因在Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae和Pichia pastoris中表達(dá)出的蛋白雖具備了和漆酶相似的大小，卻沒(méi)有漆酶的活性，在Aspergillus oryzae中卻能成功表達(dá)并分泌至胞外［20］。

相對(duì)液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵成本較低，因此也常被采用，尤其是在農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化利用方面。Sharma等［65］用麥糠為固態(tài)培養(yǎng)基質(zhì)，在添加礦物質(zhì)鹽溶液后于搪瓷盒中培養(yǎng)靈芝真菌，5 d后得到漆酶活力高達(dá)11 589 U/g基質(zhì)，發(fā)酵規(guī)模達(dá)到10 kg基質(zhì)。

5 漆酶的應(yīng)用

漆酶在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，近年來(lái)的研究在漆酶的應(yīng)用方面有了新的進(jìn)展。

5.1 造紙工業(yè)

在漂白過(guò)程中去除木質(zhì)素可提高紙張的質(zhì)量及色澤，傳統(tǒng)的紙漿漂白過(guò)程采用氯化物對(duì)木質(zhì)素選擇性的降解，但副產(chǎn)物如二噁英等則對(duì)環(huán)境形成一定的負(fù)面影響。漆酶及漆酶介體系統(tǒng)（LMS）可以作為傳統(tǒng)試劑的替代劑對(duì)紙漿處理達(dá)到較好的漂白效果［66］。Sharma等［65］研究發(fā)現(xiàn)在紙漿漂白過(guò)程中依次使用木聚糖酶及漆酶比單獨(dú)使用二者更有效，能減少過(guò)程中35%的二氧化氯使用量，提高紙漿性能（撕裂指數(shù)增加15.7%，褪色值降低50%），并使最終廢液的可吸附有機(jī)鹵化物含量減少34%。

5.2 食品工業(yè)

漆酶還能有效地降解黃曲霉毒素（AFB1），這對(duì)于控制食品中的生物毒素水平具有重要的價(jià)值［67］。聯(lián)合使用漆酶和納米顆粒（如氧化鋱Tb4O7）可以作為酒中多酚物質(zhì)檢測(cè)的一種新方法［68］。此外，由于漆酶具有催化酚類化合物及同時(shí)消耗氧的特點(diǎn)，其在凈化水質(zhì)及防止食品變質(zhì)等方面也有應(yīng)用。

5.3 染料脫色

合成類染料種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜且難降解，具有生物毒性及致畸作用，利用漆酶能有效地對(duì)染料進(jìn)行降解，且多數(shù)在10 min內(nèi)即可達(dá)到80%以上的脫色率［38，69］。在廢水處理過(guò)程中，可利用酶的固定化技術(shù)提高效率、降低成本。如將漆酶分子上的氨基與聚苯醚砜分子上的環(huán)氧樹(shù)脂基共價(jià)結(jié)合獲得固定化漆酶可降解酸性紅染料，降解率可達(dá)88%以上［70］。在小分子介體如丁香醛連氮或草酸鹽等的參與下，漆酶對(duì)染料的降解速率可明顯提高［14］，也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)介體如ABTS等對(duì)脫色過(guò)程沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用［71］。某些真菌可以利用染織廢水作為培養(yǎng)基，在添加農(nóng)業(yè)廢棄物刺激后生產(chǎn)胞外漆酶，實(shí)現(xiàn)同步脫色的效果［72］。菌株對(duì)染料的脫色過(guò)程中，生物降解與菌體吸附同時(shí)起作用，提高了脫色效果［73］。

5.4 生物修復(fù)

漆酶在去除環(huán)境水體及市政污水中的固醇類激素方面表現(xiàn)出了潛力，這些激素包括雌酮（E1）、雌二醇（E2）、雌三醇（E3）［74］。在橄欖油生產(chǎn)過(guò)程中排放的廢水中含有多種酚類化合物、漆酶及介體系統(tǒng)可以將大部分此類化合物轉(zhuǎn)化、降解［75］?？股氐人幬镌谡婢崦傅拇呋乱部捎行コ?6］。

5.5 化學(xué)合成

漆酶能將底物3-氨基-4-羥基苯磺酸（AHBS）聚合，形成新的產(chǎn)物吩惡嗪酮染料（phenoxazinone dye）［77］。4-氟-2-甲氧基酚（4-fluoroguaiacol）在漆酶的介導(dǎo)下通過(guò)去氟、聚合反應(yīng)生成具有熒光性的物質(zhì)，在膠片生成方面表現(xiàn)出了巨大潛力［78］。乳清蛋白和甜菜果膠在漆酶的參與下發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)、聚合和乳化等可形成大小為109 nm的納米顆粒［79］。

5.6 醫(yī)藥方面

Zhang等［80］用大傘杯漆酶對(duì)腫瘤及HIV反轉(zhuǎn)錄酶活性進(jìn)行抑制能力研究發(fā)現(xiàn)，隨著漆酶用量的增加（2.5-20 mmol/L），Hep G2和MCF-7細(xì)胞都受到了不同程度的抑制，抑制率分別為9.1%-80.5%及40.2%-95.4%，對(duì)這兩種細(xì)胞的IC50分別為12.3和3.0 mmol/L；在漆酶濃度為20 mmol/L時(shí)對(duì)HIVRT的抑制達(dá)到70.4%，IC50值為14.4 mmol/L。漆酶能轉(zhuǎn)化某些酚類底物生產(chǎn)抗菌素，如將4-甲基-3-羥基鄰氨基苯甲酸轉(zhuǎn)化成放線菌素（actinocin），該產(chǎn)物通過(guò)阻斷腫瘤細(xì)胞DNA的轉(zhuǎn)錄而起到對(duì)抗癌癥的功效［81］。

5.7 園藝

沙質(zhì)土壤出現(xiàn)斥水性（SWR）是高爾夫球場(chǎng)草坪維護(hù)管理中的難題之一，斥水土壤將導(dǎo)致草皮的大面積死亡進(jìn)而導(dǎo)致草坪質(zhì)量下降及管理成本增加。最近的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶處理斥水性較強(qiáng)的高爾夫球場(chǎng)淺層土壤可以有效去除其斥水性，有望結(jié)合或替代傳統(tǒng)保水劑的使用來(lái)提高草坪的管理水平、降低管理成立成本［82，83］。同時(shí)漆酶的噴灑可以減少草坪淺層土壤中的有機(jī)層厚度及有機(jī)質(zhì)含量（thatch），利于草坪的生長(zhǎng)及維護(hù)［84，85］。

6 結(jié)語(yǔ)

高效率、規(guī)?；a(chǎn)是實(shí)現(xiàn)漆酶廣泛應(yīng)用的前提。在自然界中產(chǎn)漆酶的菌株雖多，但能進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的菌株卻較少，通過(guò)篩選自然菌株乃至對(duì)原始菌株改造有望滿足不同領(lǐng)域的需求。此外，從實(shí)驗(yàn)室的搖瓶水平到小型發(fā)酵罐上的中試水平、再到工業(yè)化的生產(chǎn)水平還有一道很大的鴻溝，過(guò)程優(yōu)化控制及工藝放大是規(guī)模化生產(chǎn)的必要環(huán)節(jié)。在未來(lái)的研究中，漆酶應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展必然推動(dòng)新型漆酶的開(kāi)發(fā)與研制，通過(guò)代謝工程學(xué)、分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)等研究進(jìn)一步深入了解漆酶，利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)漆酶分子在蛋白質(zhì)水 平上進(jìn)行改造等獲得具有特殊性質(zhì)、功能的漆酶是新的趨勢(shì)。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

A Review on Properties，Production，and Application of Fungal Laccases

LIU Jia-yang1，2JIAO Guo-bao2YOU Xiao-juan1LIAO Xiang-ru3SUN Li-peng2
（1. Department of Bioengineering，Huanghuai University，Zhumadian 463000；2. Henan Yangshao Biochemical Engineering Co. Ltd.，Sanmenxia 472400；3. School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122）

As one of copper-containing oxidoreductases，fungal laccase shows better thermal stability，higher metal tolerance and catalytic oxidative to substrates than bacterial or plant ones，and thereby draws great attentions on applications in industry，agriculture and environmental protection. It is widely considered that the factors limiting the extensive application of laccase are production scale，process cost as well as its properties. Laccase can be produced via solid or liquid state fermentation，and the latter is usually adopted for industrial purposes. Recent progress has expanded the novel applications of laccase in addition to its conventional uses such as dye decolorization，treating wastewater of dyeing and paper pulp bleaching. This paper reviews the published literatures in recent years while focusing on the production，properties，and application of fungal laccase.

white-rot fungi；laccase；fermentation；enzymatic properties；application

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.04.003

2015-06-14

黃淮學(xué)院引進(jìn)人才科研項(xiàng)目（1000.12.10.1342）

劉家揚(yáng)，男，博士，副教授，研究方向：酶的生產(chǎn)及應(yīng)用；Email：liujiayang5@sohu.com