雪白睡蓮花中煙花苷的提取工藝研究

宋敏，李晨陽，譚為，趙軍，*，徐芳，敬思群（.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830004）

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雪白睡蓮花中煙花苷的提取工藝研究

宋敏1，李晨陽2，譚為2，趙軍2，*，徐芳2，敬思群1
（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.新疆藥物研究所維吾爾藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆烏魯木齊830004）

摘要：對(duì)煙花苷的提取工藝進(jìn)行了研究。以煙花苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)煙花苷提取率的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，確定提取睡蓮花煙花苷的最佳工藝條件為：乙醇濃度70%，料液比1∶30（g/mL），提取時(shí)間0.5 h，提取次數(shù)3次。在此工藝條件下，睡蓮花中煙花苷的平均含量為（3.213±0.029）mg/g。

關(guān)鍵詞：雪白睡蓮花；煙花苷；提取；正交設(shè)計(jì)

雪白睡蓮（Nymphaea candida Presl.）為睡蓮科睡蓮屬多年生水生草本植物，分布于我國新疆伊犁及博湖地區(qū)，主要用于觀賞和食用。該植物的干燥花蕾在維吾爾醫(yī)學(xué)中還用于感冒發(fā)熱、頭痛咳嗽、咽痛等病癥的治療，是維吾爾醫(yī)常用的單方或復(fù)方抗病毒藥中的主要成分［1-2］。黃酮類化合物煙花苷是雪白睡蓮花中所含的主要特征性成分，具有抗氧化、抗肝炎、神經(jīng)保護(hù)等生物活性［3-6］。然而，對(duì)煙花苷的提取工藝研究鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本論文在煙花苷含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，采用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交設(shè)計(jì)考察乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)睡蓮花煙花苷含量的影響，優(yōu)化煙花苷的提取工藝，以期為雪白睡蓮花資源的開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

睡蓮花藥材：新疆維吾爾藥業(yè)股份有限公司提供，新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為睡蓮科植物雪白睡蓮（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥花蕾；煙花苷對(duì)照品（含量為98.191%）：自制；乙腈和甲醇（色譜純）：美國Fisher公司；水：屈臣氏蒸餾水；乙醇、磷酸等其他試劑為國產(chǎn)分析純。

LC-10ATvp高效液相色譜儀、SPD-10Avp紫外可見檢測(cè)器：日本島津有限公司；梅特勒AL204型電子天平：梅特勒-托利多上海有限公司；恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1煙花苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.1.1對(duì)照品溶液的配制

精密稱取煙花苷對(duì)照品0.005 0 g，加甲醇定容至25 mL棕色容量瓶中，制備成煙花苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（0.20 mg/mL）。

1.2.1.2供試品溶液的配制

取睡蓮花藥材，粉碎過40目篩，取1 g，精密稱定，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇20 mL，精密稱重，加熱回流提取1次，每次1 h，待放置室溫后，加溶劑補(bǔ)足重量，離心，后取上清液2 mL蒸干，加水溶解后至25 mL容量瓶中定容，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下的方法測(cè)定藥材中煙花苷含量。

1.2.1.3HPLC色譜條件

色譜柱：phenomenex Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈和2 mL/L磷酸二元梯度洗脫，梯度條件：0～5～10～30～60 min，乙腈5%～5%～11%～14% ～20%；2 mL/L磷酸95%～95%～89%～86%～80%；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：266 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.1.4線性關(guān)系考察

精密量取煙花苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mL，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，搖勻。精密吸取各對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），煙花苷質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.1.5精密度試驗(yàn)

精密稱取稱取本品粉末1g，按“1.2.1.2”中方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，按照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)煙花苷峰面積的RSD值。

1.2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取稱取本品粉末1 g，按“1.2.1.2”中方法制備供試品溶液，共6份，精密吸取供試品溶液10 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積的RSD值。

1.2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取稱取本品粉末1 g，按“1.2.1.2”中方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別在0、1、5、7、20、24 h進(jìn)樣，測(cè)煙花苷在24 h內(nèi)峰面積的RSD值。

1.2.1.8回收率試驗(yàn)

精密稱取取已知含量的本品約0.5 g，共6份，分別加入煙花苷對(duì)照品（0.20 mg/mL）6 mL，按“1.2.1.2”中方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別進(jìn)樣，計(jì)算平均回收率及RSD值。

1.2.2雪白睡蓮花中煙花苷提取工藝優(yōu)化

1.2.2.1乙醇濃度對(duì)煙花苷含量的影響

精密稱取藥材粉末5份，每份0.5 g，分別加入水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇20 mL，回流提取1次，每次1 h。將提取液補(bǔ)重、離心、過濾，測(cè)定煙花苷的含量。

1.2.2.2料液比對(duì)煙花苷含量的影響

精密稱取藥材粉末5份，每份0.5 g，分別加入料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的50%乙醇，回流提取1次，每次1 h。將提取液補(bǔ)重、離心、過濾，測(cè)定煙花苷的含量。

1.2.2.3提取時(shí)間對(duì)煙花苷含量的影響

精密稱取過篩睡蓮花粉末5份，每份0.5 g，分別加入料液比為1∶30（g/mL）的50%乙醇回流提取1次，回流時(shí)間分別為0.5、1、1.5、2、2.5 h。將提取液補(bǔ)重、離心、過濾，測(cè)定煙花苷的含量。

1.2.2.4提取次數(shù)對(duì)煙花苷含量的影響

精密稱取過篩睡蓮花粉末3份，每份0.5 g，分別加入料液比為1∶30（g/mL）的50%乙醇，在95℃水浴鍋中分別回流提取1、2、3次，每次1 h。將提取液補(bǔ)重、離心、過濾，測(cè)定煙花苷的含量。

1.2.2.5正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)煙花苷的含量有影響的4個(gè)因素為變量，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以煙花苷含量為考察指標(biāo)，采用L9（34）因素水平表選用最佳提取參數(shù)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳提取方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，做3組平行試驗(yàn)，測(cè)定睡蓮花中煙花苷的平均含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用正交設(shè)計(jì)助手v1.1.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果與分析

2.1煙花苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.2.1.4的方法配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取各對(duì)照品溶液10 μL，進(jìn)樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），煙花苷質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程，得回歸方程為：Y = 21 015 503X+1 793.320 0，R2=0.999 9，樣品在0.004 0 mg/mL～0.120 0 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.1精密度試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)結(jié)果表明，煙花苷峰面積的RSD值為1.5735%，表明測(cè)定儀器精密度良好。

2.1.2重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，煙花苷峰面積的RSD為0.670 0%，表明測(cè)定方法重復(fù)性良好。

2.1.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明，分別在0、1、5、7、20、24h時(shí)進(jìn)樣，測(cè)得煙花苷在24 h內(nèi)峰面積的RSD為2.155 7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4回收率試驗(yàn)

回收率試驗(yàn)測(cè)得煙花苷的平均回收率為99.277%，RSD為1.536%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。見表2。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of average recovery

2.2雪白睡蓮花中煙花苷提取工藝優(yōu)化

2.2.1乙醇濃度對(duì)煙花苷含量的影響

不同乙醇濃度對(duì)煙花苷含量的影響如圖1所示。

圖1　乙醇濃度對(duì)煙花苷含量的影響Fig.1 Influence of ethanol concentration on content of nicotiflorin

結(jié)果如圖1所示，煙花苷含量隨乙醇濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，在乙醇濃度為50%時(shí)，煙花苷含量較高，因此選擇乙醇濃度為50%。

2.2.2料液比對(duì)煙花苷含量的影響

不同料液比對(duì)煙花苷含量的影響如圖2所示。

圖2　料液比對(duì)煙花苷含量的影響Fig.2 Influence of solid-liquid ratio on content of nicotiflorin

由圖2可見，煙花苷含量隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比大于1∶30（g/mL）時(shí)，煙花苷含量的增加量大大降低，從經(jīng)濟(jì)成本和大規(guī)模生產(chǎn)考慮，最終選擇浸提料液比為1∶30（g/mL）。

2.2.3提取時(shí)間對(duì)煙花苷含量的影響

不同提取時(shí)間對(duì)煙花苷含量的影響見圖3。

圖3　提取時(shí)間對(duì)煙花苷含量的影響Fig.3 Influence of extraction time on content of nicotiflorin

由圖3可知，回流提取時(shí)間為1 h和1.5 h時(shí)，煙花苷含量差異不大。因此提取時(shí)間選為1 h。

2.2.4提取次數(shù)對(duì)煙花苷含量的影響

提取次數(shù)對(duì)煙花苷含量的影響見圖4。

圖4　提取次數(shù)對(duì)煙花苷含量的影響Fig.4 Influence of extraction times on content of nicotiflorin

由圖4可知，隨著提取次數(shù)的增加，煙花苷含量緩慢提高。次數(shù)為3時(shí)，達(dá)到最高。

2.2.5正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results

表4　方差分析表Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment

以煙花苷含量為考察指標(biāo)，通過直觀分析中極值R可知，提取次數(shù)極差最大，其次是乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間。而影響煙花苷的提取效果因素大小依次為：提取次數(shù)＞乙醇濃度＞料液比＞提取時(shí)間。由方差分析可知，提取次數(shù)對(duì)煙花苷的提取具有顯著影響，而乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對(duì)煙花苷的提取影響較小。通過此正交試驗(yàn)與方差分析，并結(jié)合時(shí)間成本、經(jīng)濟(jì)成本及大規(guī)模生產(chǎn)等因素綜合考慮，篩選出最佳提取工藝為A3B2C1D3，即提取雪白睡蓮花煙花苷的最佳提取工藝為料液比為1∶30（g/mL）的70%乙醇回流提取3次，每次0.5 h。

2.2.6驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)確定的最佳提取方法進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，準(zhǔn)確稱量0.5 g睡蓮花藥材，按1∶30（g/mL）的料液加入70%乙醇回流提取3次，每次0.5 h，做3組平行試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果顯示睡蓮花中煙花苷的平均含量為（3.213±0.029）mg/g；結(jié)果表明提取工藝穩(wěn)定，重復(fù)性良好。

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)考察乙醇濃度、料液比、浸提時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)煙花苷得率的影響，并采用正交試驗(yàn)得到提取煙花苷的最佳工藝，即料液比為1∶30（g/mL）的70%乙醇回流提取3次，每次0.5 h。提取次數(shù)對(duì)煙花苷的提取率具有顯著影響。按照最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，睡蓮花中煙花苷的含量可達(dá)到（3.213±0.029）mg/g。本工藝方法操作簡便，成本低，適合工業(yè)化生產(chǎn)，結(jié)果可為雪白睡蓮花的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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Optimization of Extraction Technology of Nicotiflorin from Nymphaea candida Presl.

SONG Min1，LI Chen-yang2，TAN Wei2，ZHAO Jun2，*，XU Fang2，JING Si-qun1
（1. College of Life Sciences and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China；2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicines，Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，Xinjiang，China）

Abstract：The extracting technology of nicotiflorin from Nymphaea candida Presl. were studied. The nicotiflorin was used to evaluate the effect of ethanol concentration，solid-liquid ratio，extracting time and extraction times on the extracting rate. Based on the single-factor experiment the orthogonal experiments of four factors and three levels were found as follows：the ethanol concentration 70%，olid-liquid ratio 1∶30（g/mL），the extraction time 0.5 h，extraction for 3 times. In the best conditions the content of nicotiflorin from Nymphaea candida Presl. were（3.213±0.029）mg/g.

Key words：Nymphaea candida Presl.；nicotiflorin；extraction；orthogonal experiment

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.029

基金項(xiàng)目：新疆維吾爾自治區(qū)科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（201333118）

作者簡介：宋敏（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：藥食兼用植物的研究與開發(fā)。

*通信作者：趙軍（1973—），男（漢），研究員，博士，研究方向：藥食兼用植物的研究與開發(fā)。

收稿日期：2015-03-18