基于Design- Expert軟件設(shè)計優(yōu)化大蒜多糖提取工藝

王富花，董鳳鳳，張占軍，*（.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州57；.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，江蘇揚(yáng)州5009）

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基于Design- Expert軟件設(shè)計優(yōu)化大蒜多糖提取工藝

王富花1，董鳳鳳2，張占軍2，*
（1.揚(yáng)州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225127；2.揚(yáng)州市職業(yè)大學(xué)，江蘇揚(yáng)州225009）

摘要：主要研究大蒜多糖提取的4種影響因素及其交互作用對大蒜多糖提取率的影響，借助于Design-Expert軟件設(shè)計，優(yōu)化大蒜多糖提取工藝條件，以期為開發(fā)利用大蒜多糖提供參考。采用水煮醇沉法提取大蒜多糖，以苯酚-硫酸法檢測其含量，分別考察浸提時間、料液比、浸提溫度及浸提次數(shù)對大蒜多糖得率的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert軟件進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，建立了大蒜多糖提取率和各因素之間的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，提取溫度、液料比、提取時間和提取次數(shù)的一次項，個別交互項及其二次項對大蒜多糖得率的影響顯著，而液料比與提取時間，液料比與提取次數(shù)的交互項作用不明顯。大蒜多糖提取最優(yōu)條件最終確定為：提取溫度81℃，液料比14∶1（mL/g），提取時間84min，提取次數(shù)2次。

關(guān)鍵詞：大蒜多糖；Design-Expert；提取工藝；響應(yīng)面；優(yōu)化

多糖又稱多聚糖（polysaccharides），是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈，是一類重要的活性生物大分子，一般由10個以上的單糖組成的高分子碳水化合物，多糖廣泛分布于自然界中［1］。研究發(fā)現(xiàn)，多糖和蛋白質(zhì)、脂類形成的糖蛋白、脂多糖等生物大分子在細(xì)胞與細(xì)胞的信息交流、分泌及蛋白質(zhì)的加工和轉(zhuǎn)移，以及免疫系統(tǒng)分子識別等方面起著非常重要的作用［2］。多糖的性質(zhì)會隨著聚合度的增加，發(fā)生較大的變化，其性質(zhì)和單糖相差也會越來越大，多糖一般為非晶形，沒有甜味，難溶于冷水，可溶于熱水而不溶于乙醇［3］。植物多糖因其細(xì)胞或組織外大多有脂質(zhì)包圍，要使多糖釋放出來，首先要除去表面脂質(zhì)（色素、脂肪酸等脂溶性雜質(zhì)），再用85%乙醇除去單糖、低聚糖和苷類等干擾性成分，然后再用水加熱提取，提取液濃縮后加入乙醇進(jìn)行沉淀即得粗多糖。醇沉的醇濃度根據(jù)多糖的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而不同，一般在70%～85%的范圍，也可通過不同的醇濃度分步沉淀多糖［4-5］。

大蒜為百合科蔥屬植物蒜（Allium sativum L.）的地下鱗莖［7］。中醫(yī)認(rèn)為大蒜辛辣、性溫、能解滯氣、暖脾胃、消癥積、解毒殺蟲、治積滯、腹冷痛、泄瀉、痢疾、百日咳等癥［8］。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也證實(shí)，大蒜有非常好的防病治病功效。大蒜這些藥用保健效果與其所含有的揮發(fā)油、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、蒜酶等酶類、凝集素、蒜氨酸及其分解產(chǎn)物大蒜素及多糖等成分有直接或間接的關(guān)系［9］。近年來，國內(nèi)外大量研究證實(shí)大蒜多糖（ASP）具有多種生理活性，可控制血脂、可選擇性地增殖腸道雙歧桿菌、降低血糖、增強(qiáng)免疫功能；能增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活力，具有護(hù)肝、抗氧化和抗病毒作用，在保健食品和醫(yī)藥中有著較好的開發(fā)前景［1］。大蒜中大蒜多糖的含量較之大蒜功效成分大蒜素高一個數(shù)量級，且大蒜素不穩(wěn)定，需要加工成膠囊或丸劑以保持其藥效，因此開發(fā)活性大蒜多糖更有優(yōu)勢，經(jīng)濟(jì)效益也更為明顯［10］。目前國內(nèi)外對大蒜多糖提取、生物活性方面的研究非?；钴S，但關(guān)于大蒜多糖提取優(yōu)化方面的報道仍然較少。

1　材料與儀器

1.1材料

大蒜：購于揚(yáng)州市邗江區(qū)大潤發(fā)超市。

1.2儀器和試劑

AR2410電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；DS-1高速組織搗碎機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；745型紫外-可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；TDL-5000B型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；RE-52AA系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋：上海市精宏實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；DZF-6050型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、丙酮、無水乙醇、95%無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

2　方法

2.1水煮醇沉法提取大蒜多糖的工藝流程

大蒜→80℃烘干至恒重→粉碎（孔篩0.5 mm）→石油醚回流脫脂［液料比3∶1（mL/g），時間3 h］→55℃烘干→80%乙醇回流→65℃烘干→粉碎→加水?dāng)嚢杞帷x心（5 000 r/min，10 min）→上清液濃縮→加乙醇至75%終濃度→靜止過夜→抽濾→濾渣→真空干燥

2.2測定方法

2.2.1大蒜多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法。利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，后與苯酚生成橙黃色化合物［8］。再以比色法測定。

2.2.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取經(jīng)105℃干燥恒重的葡萄糖500 mg，稀釋定容至100 mL，從中取出1 mL溶液加蒸餾水定容至50 mL，此時葡萄糖濃度為0.1 mg/mL，精密吸取以上濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液各0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3 mL，分別置于20 mL的比色管中，再依次加入蒸餾水使終體積為2 mL，同時吸取2 mL蒸餾水于比色管中作空白對照，然后在以上各管中加入5%苯酚1 mL，搖勻后立即加入5 mL濃硫酸，振蕩，室溫放置20 min后，用分光光度計在490.0 nm處測定其吸光值。

2.2.3大蒜多糖得率的計算

取干燥大蒜多糖10 mg，定容至100 mL，吸取樣品液1.0 mL，加入1 mL蒸餾水，按2.2.2操作，測光密度。

多糖得率Y/%=（WE×CT）/WP×100

式中：WE為的粗提取物的重量，mg；WP為每次試驗(yàn)中使用的預(yù)處理樣品重量，mg；CT為粗提取物中總糖的含量，%。

2.3單因素試驗(yàn)

應(yīng)用水提醇沉法提取大蒜多糖，分別考察浸提時間、料液比、浸提溫度及浸提次數(shù)對大蒜多糖得率的影響。

2.4響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

本試驗(yàn)利用Design-Expert軟件進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計，各因素的試驗(yàn)水平及編碼見表1。

表1　Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計因素水平表Table 1 Variables and levels in Box-Behnken experimental design

試驗(yàn)中考查提取溫度、液料比、提取時間和提取次數(shù)，對大蒜粗多糖的提取率的影響值。表2列出Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計方案及結(jié)果（大蒜多糖得率），整個試驗(yàn)共計29組，其中中心點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5組。

3　結(jié)果與分析

3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以糖濃度為橫坐標(biāo)，490 nm處的光吸收值A(chǔ)490為縱坐標(biāo)，繪制糖濃度-光吸收值標(biāo)準(zhǔn)曲線并回歸出相應(yīng)線性方程。如圖1所示。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的吸光值計算出多糖樣品中總糖含量。

3.2大蒜多糖單因素試驗(yàn)提取工藝條件的選擇

3.2.1浸提時間的選擇

取經(jīng)預(yù)處理的大蒜粉碎干品5.0 g，在浸提溫度80℃，以液料比15∶1（mL/g），在30、60、90、120、150 min 5個不同的時間條件下提取1次，來確定浸提時間對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　提取時間對大蒜多糖得率的影響Fig.2 Effects of extraction time on yield of ASP

由圖2可知，隨著提取時間的延長，大蒜多糖得率先逐漸增大，再逐漸降低，這可能是隨著時間的延長，加快了細(xì)胞的破裂，從而使大蒜多糖更好地溶解到水中，多糖得率增大［11］。但時間超過90 min之后，得率增加不明顯，而且時間的延長可能使大蒜多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，同時綜合成本考慮，提取時間在90 min左右為宜。

3.2.2浸提溫度對多糖得率的選擇

準(zhǔn)確稱取大蒜干品5.0 g，按液料比15∶1（mL/g）浸泡后，在60、70、80、90、100℃5個不同溫度下，通過恒溫磁力攪拌器浸提90 min，提取1次后測定多糖含量，結(jié)果見圖3。

圖3　浸提溫度對大蒜多糖得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on yield of ASP

由圖3可知，不同提取溫度對大蒜多糖得率有較大影響，溫度過低，不利于多糖物質(zhì)的溶出；溫度過高，容易引起多糖降解。在一定提取范圍內(nèi)，大蒜多糖得率隨著浸提溫度的升高而增大，得率達(dá)到最大值，但超過一定范圍后，隨著溫度的上升，多糖反而有下降的趨勢［12］。綜合考慮，選擇浸提溫度為80℃為最佳浸提溫度。

3.2.3液料比的選擇

取經(jīng)預(yù)處理的大蒜粉碎干品5.0 g，在提取溫度80℃條件下，以5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（mL/g）5個不同的液料比進(jìn)行試驗(yàn)，確定液料比對多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4　液料比對大蒜多糖得率的影響Fig.4 Effects of ratio of water to material on yield of ASP

由圖4可知，液料比較小和較大時，多糖得率都有一些偏低，較小時可能是因?yàn)槿軇┝可偈沟梦锪献兊灭こ?，從而影響了多糖得率；較大時可能是因?yàn)槿軇┝看蠼o濃縮帶來不便，從而導(dǎo)致多糖得率降低。因此，綜合考慮，選擇液料比15∶1（mL/g）為最佳料液比。

3.2.4提取次數(shù)的選擇

準(zhǔn)確稱取大蒜粉碎干品5.0 g，在80℃浸提溫度下，以15∶1（mL/g）的液料比進(jìn)行試驗(yàn)，通過恒溫磁力攪拌器浸提90 min，分別浸提1、2、3、4、5次后計算多糖含量，結(jié)果見圖5。

圖5　提取次數(shù)對大蒜多糖得率的影響Fig.5 Effects of extraction times on yield of ASP

由圖5可知，提取次數(shù)的增多能提高大蒜多糖的得率，但提取3次后，殘渣中多糖含量明顯降低，再增加提取次數(shù)已無實(shí)際意義，故從節(jié)省能耗、減少操作工序以及經(jīng)濟(jì)性考慮，優(yōu)化時提取次數(shù)的考察水平分別取1次，2次及3次為宜。

3.3響應(yīng)面法優(yōu)化大蒜多糖提取工藝的選擇

3.3.1模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到以下二元多次回歸方程：

式中：Y表示提取物中多糖的含量，%；X1、X2、X3、X4分別是被測變量提取溫度（℃）、液料比（mL/g）、提取時間（min）、浸提次數(shù)的編碼值。

點(diǎn)擊ANOVA選項卡，可以得到模型的方差分析表及模型方程［9］。結(jié)果列于表3。

表3　多元回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

從表3可以看出，F(xiàn)-檢驗(yàn)顯示回歸模型有較高的F值（F=68.00）和極低的P值（P＜0.000 1），表明本回歸模型是顯著的，變異系數(shù)（Coefficient of variation）是衡量各觀測值變異程度的一個統(tǒng)計量，本模型值為2.38，也表明該模型具有較高的精確性和良好的試驗(yàn)值可靠性。決定系數(shù)（R2）反映出回歸模型的適合度，R2值越接近于1，則試驗(yàn)值與預(yù)測值的相關(guān)性越好。本結(jié)果決定系數(shù)R2值等于0.985 5，表明大蒜多糖得率的試驗(yàn)值與預(yù)測值間有較好的一致性；調(diào)整決定系數(shù)adj-R2等于0.971 0，說明大蒜多糖得率總變異中約97.10%是由獨(dú)立變量決定的［13］。此外，失擬度（Lack of Fit）是衡量模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)不能代表的數(shù)據(jù)，不包括在模型中不能通過隨機(jī)誤差所解釋的回歸或者變化的數(shù)據(jù)。本研究中，失擬度的F值為1.27，P值為0.441 5，失擬度相對于純誤差（pure error）是不顯著的，失擬度的不顯著使得回歸模型具有更高的適合度。預(yù)測殘差平方和（PRESS）為7.07，說明模型解釋變差的能力較強(qiáng)，總體擬合具有統(tǒng)計顯著性。同時可以看出，液料比與提取時間，液料比與提取次數(shù)間的交互作用不顯著。

3.3.2等高線圖和響應(yīng)曲面圖分析

響應(yīng)曲面圖（三維）和等高線圖（二維）是運(yùn)用圖形技術(shù)將這種函數(shù)關(guān)系顯示出來，以供我們憑借直覺的觀察來了解各個變量試驗(yàn)值與響應(yīng)值之間的關(guān)系以及兩個被測變量間交互作用的類型，從而選擇試驗(yàn)設(shè)計中的最優(yōu)化條件。等高線圖的形狀（圓形或橢圓形）反應(yīng)了兩被測變量間交互作用顯著與否，橢圓形等高線表明兩被測變量間交互作用是顯著的，圓形等高線則意味著兩被測變量間交互作用不顯著，可以忽略不計［14］。

點(diǎn)擊Model Graphs，在Graphs Tool選項卡中選擇3D Surface便會出現(xiàn)收率與各影響因素間的響應(yīng)面圖，從響應(yīng)面圖中可以直觀地觀察到各因素對收率的影響規(guī)律，如圖6所示。

圖6　各因素對大蒜多糖得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface plot showing the effect of factors on the yield of ASP

在Graphs Tool選項卡中選擇Contour便會出現(xiàn)收率與各影響因素間的等高線圖，從等高線圖中也可以直觀地觀察到各因素對收率的影響規(guī)律，如圖7所示。

利用Design-Expert軟件，大蒜多糖提取最優(yōu)條件最終確定為：提取溫度80.9℃，液料比14.5∶1（mL/g），提取時間83.7 min以及提取次數(shù)2.18次。在此條件下，大蒜多糖得率預(yù)測值為17.12%?？紤]到操作的方便性，最優(yōu)提取參數(shù)修正為提取溫度81℃，液料比14：1（mL/g），提取時間84 min以及提取次數(shù)2次。

圖7　對大蒜多糖得率影響的等高線圖Fig.7 Contour plot showing the effect of factors on the yield of ASP

在最優(yōu)提取參數(shù)條件下做驗(yàn)證試驗(yàn)，得大蒜多糖的平均得率為16.60%，與預(yù)測值17.12%存在較好的一致性。

4　結(jié)論

在單因素試驗(yàn)設(shè)計的基礎(chǔ)上，對大蒜多糖提取工藝條件進(jìn)行了四因素三水平的響應(yīng)面法設(shè)計，從而建立了大蒜多糖提取率和各因素之間的數(shù)學(xué)模型。結(jié)果表明，提取溫度、液料比、提取時間和提取次數(shù)的一次項，個別交互項及其二次項對大蒜多糖得率的影響顯著，而液料比與提取時間，液料比與提取次數(shù)的交互項作用不明顯。

利用Design-Expert軟件，大蒜多糖提取最優(yōu)條件最終確定為：提取溫度81℃，液料比14∶1（mL/g），提取時間84 min以及提取次數(shù)2次。驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果表明試驗(yàn)值與預(yù)測值間存在較好的一致性，說明本研究所得二元多次回歸方程是準(zhǔn)確的且適用于從大蒜中采用水煮醇沉法提取多糖進(jìn)行預(yù)測。

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Optimization of Extraction Conditions of Polysaccharide from Allium sativum L. Based on Design-Expert

WANG Fu-hua1，DONG Feng-feng2，ZHANG Zhan-jun2，*
（1. Yangzhou Polytechnology Institute，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2. Yangzhou Vocational University，Yangzhou 225009，Jiangsu，China）

Abstract：This paper focused four factors and their interactions on the impact of extraction of polysaccharide from Allium sativum L.，while based Design-Expert software design，optimization conditions of polysaccharide extraction，in order to provide the basis for the development and utilization of polysaccharide. Using Design-Ex－pert software for the four factors and three levels Box-Behnken experimental design，the polysaccharide extracted with hot water extraction and alcohol precipitation，the method of phenol-sulfuric acid to detect the polysaccharide content. Meanwhile，extraction time，solid-liquid ratio，extraction temperature and extraction times were investigated on the impact of polysaccharide yield. On the basis of single factor experiments，using Design-Expert software for the four factors and three levels Box-Behnken experimental design，a mathematical model of polysaccharide textraction rate and various factors were created. The results showed that the extraction temperature，ratio of water to marterial，extraction time and extraction times，individual quadratic interaction term and its impact on the polysaccharide yield significantly，while the interaction term of liquid ratio and extraction time，liquid ratio and extraction times were not obvious. Polysaccharide extract optimum conditions eventually identified as：extraction temperature 81℃，ratio of water to marterial 14∶1（mL/g），extraction time 84 min and extracted times was 2.

Key words：polysaccharide of Allium sativum L.；Design-Expert；extraction conditions；response surface methodology；optimization

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.014

基金項目：江蘇省基礎(chǔ)研究計劃（自然科學(xué)基金）項目（BK20141269）

作者簡介：王富花（1976—），女（苗），副教授，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物提取分離純化。

*通信作者：張占軍（1977—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

收稿日期：2015-03-26