NT-proBNP特異性單克隆抗體的制備及鑒定

劉鵬展黃綺玲何小維李文美，張文琪張賽

（1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；2. 廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510663）

NT-proBNP特異性單克隆抗體的制備及鑒定

劉鵬展1黃綺玲2何小維1李文美1，2張文琪1張賽2

（1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640；2. 廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510663）

旨在制備并鑒定抗人NT-proBNP特異性單克隆抗體。采用重組NT-proBNP蛋白免疫Balb/c小鼠，取血清效價(jià)高的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，經(jīng)HAT篩選和有限稀釋法亞克隆，獲得陽性雜交瘤細(xì)胞株，用動物體內(nèi)誘生法制備腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法將抗體純化，并測定抗體的亞類、效價(jià)、特異性及相對親和力。結(jié)果表明，獲得4株能穩(wěn)定分泌抗人NT-proBNP單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1G12、1B2、3D5和2D11。抗體Ig亞類，1G12和1B2為IgG2a型，2D11為IgG1型，3D5為IgG2b型；1G12，1B2和3D5的抗體效價(jià)達(dá)到106，而2D11的效價(jià)僅達(dá)104。特異性好，1G12、1B2、3D5和2D11四株抗體的親和常數(shù)依次為9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012和6.33×1010。成功制備了特異性抗人NT-proBNP單克隆抗體。

NT-proBNP；單克隆抗體；間接ELISA法

N末端B型鈉尿肽原（NT-proBNP）是心肌細(xì)胞在合成多肽類激素B型鈉尿肽（BNP）的過程中所產(chǎn)生無生物活性的直鏈多肽片段［1］。當(dāng)負(fù)荷引起心室壓力變化以及室壁張力的增加時(shí)，心室肌細(xì)胞就會合成和分泌NT-proBNP，因此NT-proBNP濃度的升高可以很好地反映心室結(jié)構(gòu)和功能的改變，以及心臟有無損傷及損傷程度［2］。目前，NT-proBNP已被公認(rèn)為心功能紊亂最敏感和最特異的指標(biāo)，是診斷心力衰竭的一個(gè)具有劃時(shí)代意義的客觀標(biāo)志物［3］。

目前國際上檢測人NT-proBNP常用的是免疫學(xué)方法，主要為NT-proBNP快速診斷試劑，其類型包括多克隆抗體和特異性強(qiáng)、靈敏度高的單克隆抗體。但是市售的NT-proBNP快速診斷試劑基本為國外公司所壟斷，如羅氏及生物梅里埃。而國內(nèi)在NT-proBNP上的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)晚于國外，長期依賴進(jìn)口，給病患帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4］。因此自主研發(fā)制備優(yōu)質(zhì)的抗NT-proBNP商品化單克隆抗體可加快國內(nèi)NT-proBNP快速診斷試劑的研發(fā)。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法制備NT-proBNP單克隆抗體，以期為其快速診斷試劑的開發(fā)提供良好的物質(zhì)條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及試劑 雌性 Balb/c小鼠：6-8周齡，SPF級，中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心；SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞，南方醫(yī)科大學(xué)；帶DSBA標(biāo)簽重組NT-proBNP（hrNT-proBNP-DSBA）、抗人NT-proBNP 單克隆抗體H1、抗人NT-proBNP單克隆抗體H3，廣州萬孚公司提供；小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用ELISA試劑盒，洛陽佰奧通實(shí)驗(yàn)材料中心；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑，美國Sigma公司；其他試劑均是分析純。

1.1.2 儀器 96孔酶標(biāo)板：深圳金燦華；酶標(biāo)儀，Thermo scientific MK3；Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)：美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 NT-proBNP特異性單克隆抗體的制備

1.2.1.1 動物免疫 按照50 μg重組蛋白/只小鼠的劑量將免疫原注射到Balb/c小鼠體內(nèi)進(jìn)行第1次免疫。15 d后，按照25 μg重組蛋白/只小鼠的劑量進(jìn)行第2次免疫。第25天后進(jìn)行第3次免疫（同第2次免疫）。第35天后進(jìn)行第四次免疫（同第3次免疫），免疫完成后7 d用間接ELISA法檢測小鼠血清抗體效價(jià)［5］。

于融合前3 d按每只小鼠100 μg重組蛋白（hrNT-proBNP-DSBA）的劑量，不加佐劑，直接小鼠尾靜脈注射進(jìn)行加強(qiáng)，準(zhǔn)備融合。

1.2.1.2 細(xì)胞融合和陽性克隆孔的篩選 采用PEG誘導(dǎo)的半固體基培養(yǎng)法進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)［6］，將免疫效價(jià)達(dá)融合要求的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按10∶1比例進(jìn)行混合細(xì)胞培養(yǎng)［7，8］。采用間接ELISA法篩選出對hrNT-proBNP-DSBA和hrNT-proBNP均呈陽性的細(xì)胞株［9］。免疫小鼠血清、抗人NT-proBNP單克隆抗體H1和H3分別稀釋1 000倍作陽性對照，未經(jīng)免疫小鼠血清稀釋1 000倍作陰性對照，空白對照為稀釋液。

1.2.1.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的亞克隆 有限稀釋法對篩選出來的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)［10］，間接ELISA法進(jìn)行檢測，選取對hrNT-proBNP檢測結(jié)果是陽性最強(qiáng)的克隆，進(jìn)行連續(xù)亞克直至細(xì)胞陽性率100%，即可定株。

1.2.1.4 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇 用凍存液將2.1.3得到的單克隆雜交瘤細(xì)胞株制成1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，液氮保存。復(fù)蘇時(shí)，取出凍存管，立即放入37℃水浴中，離心去除凍存液，最后移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.1.5 單克隆抗體的生產(chǎn)與純化 選取健康成年F1小鼠，液體石蠟腹腔注射0.5 mL/只。一周后，收集生長狀態(tài)良好的雜交瘤細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞濃度為0.5×106-1×106個(gè)/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL。7-12 d后，采集小鼠腹水。通過正辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水［11］。

1.2.2 單克隆抗體的分析鑒定

1.2.2.1 單克隆抗體亞類的鑒定 將無標(biāo)簽重組蛋白hrNT-proBNP稀釋至0.25 μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行抗原的包被。采用ELISA試劑盒，按照說明書操作測定單克隆抗體亞類。

1.2.2.2 腹水及純化后抗體效價(jià)的測定 用動物體內(nèi)誘生法制備單抗腹水，間接ELISA法進(jìn)行鑒定［12］，經(jīng)Bradford法測定純化后蛋白濃度。再將腹水或蛋白濃度調(diào)整到1 mg/mL，純化后抗體分別用稀釋液稀釋103、104、105、106和107倍，當(dāng)OD450值大于陰性對照值2.1倍以上的稀釋倍數(shù)時(shí)的值作為腹水及抗體的效價(jià)。融合小鼠的血清稀釋1 000倍作陽性對照，未經(jīng)免疫小鼠血清稀釋1 000倍作陰性對照，稀釋液作空白對照。

1.2.2.3 純化后抗體純度的測定 每個(gè)上樣孔加入5 μg左右的抗體蛋白，使用SDS-PAGE電泳法并結(jié)合美國伯樂公司的 Gel DocTMXR+型凝膠成像系統(tǒng)，檢測純化后抗體純度［13］。

1.2.2.4 單克隆抗體特異性鑒定

（1）Western blot鑒定單克隆抗體與特異抗原的反應(yīng)原性：以無標(biāo)簽重組蛋白hrNT-proBNP，采用Western blot法檢測抗原抗體的識別反應(yīng)［14］，排除產(chǎn)生針對帶DSBA標(biāo)簽和其它無關(guān)雜蛋白的抗體。

（2）間接ELISA法測定單克隆抗體與其它心肌標(biāo)志物的交叉反應(yīng)性：在制備針對hrNT-proBNP快診試劑的單克隆抗體時(shí)，必須檢測該抗體與其它心肌標(biāo)志物有無交叉反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)采用間接ELISA法測定單克隆抗體與其它心肌標(biāo)志物的反應(yīng)，包括心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）、肌紅蛋白（Myo）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白I（CTnI）等，以排除這些干擾因素影響。

1.2.2.5 檢測單克隆抗體的相對親和力 采用非競爭ELISA法測定［15-17］親和常數(shù)，用以評價(jià)抗體與抗原結(jié)合的緊密程度，結(jié)合越牢固，則親和力越強(qiáng)。將無標(biāo)簽重組蛋白hrNT-proBNP稀釋至1 μg/mL，進(jìn)行倍比稀釋，連續(xù)稀釋11個(gè)梯度，最后酶標(biāo)儀讀取OD450數(shù)值。選擇4個(gè)最合適的包被濃度，每個(gè)濃度包被2行，重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.6 單克隆抗體細(xì)胞穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將定株的細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)至T25培養(yǎng)瓶中，連續(xù)傳代培養(yǎng)3個(gè)月，每隔半個(gè)月使用間接ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清的抗體效價(jià)，以確定細(xì)胞株分泌抗體能力的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 免疫小鼠血清效價(jià)分析

間接ELISA法測定第4次免疫7 d后小鼠尾靜脈血清的效價(jià)。結(jié)果（圖1）顯示，小鼠均能產(chǎn)生只針對NT-proBNP的抗體，且抗體效價(jià)均達(dá)106，符合融合要求。

2.2 細(xì)胞融合及陽性克隆篩選

本實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5次細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，累計(jì)挑取5 000株左右的雜交瘤細(xì)胞。最終得到4株對hrNT-proBNP-DSBA和hrNT-proBNP均顯陽性的細(xì)胞株，分別命名1G12、1B2、3D5和2D11，檢測結(jié)果如圖2所示。

圖1 第4次免疫后小鼠血清的效價(jià)

圖2 陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選

2.3 四株單克隆抗體亞類的鑒定

單克隆抗體亞類的鑒定結(jié)果（圖3）顯示，1G12和1B2均為IgG2a型，2D11為IgG1型，3D5為IgG2b型。

圖3 四株單克隆抗體的亞類型鑒定

2.4 四株雜交瘤細(xì)胞的腹水及純化后抗體效價(jià)的檢測

采用間接ELISA對小鼠腹水效價(jià)進(jìn)行測定，結(jié)果（圖4）顯示，1G12、1B2和3D5的腹水效價(jià)均能達(dá)到106，而2D11的效價(jià)僅達(dá)104。

圖4 四株腹水的效價(jià)檢測結(jié)果

根據(jù)Bradford法標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得4株純化后抗體1G12、1B2、3D5和2D11的蛋白濃度分別為3.98、4.96、3.18和3.97 mg/mL。將抗體濃度均調(diào)節(jié)至1 mg/mL，測定抗體的效價(jià)，結(jié)果（圖5）顯示，1G12、1B2 和3D5抗體的效價(jià)均能達(dá)到106，而2D11的效價(jià)僅達(dá)104。

圖5 四株單克隆抗體的效價(jià)檢測結(jié)果

2.5 檢測4株純化后單克隆抗體的純度

檢測4株純化后單克隆抗體的純度，結(jié)果（圖6）顯示，4株抗體均可見兩條明顯的主帶，抗體重鏈大約為50 kD，輕鏈約為25 kD。經(jīng)分析測得，單克隆抗體1G12、1B2、3D5和2D11的純度分別為79.8%、86.3%、84.4%和75.3%，均大于75%。

2.6 四株單克隆抗體特異性檢測

2.6.1 單克隆抗體Western blot鑒定結(jié)果 結(jié)果（圖7）顯示，4株單克隆抗體均能與分子量約為8 kD的 hrNT-proBNP產(chǎn)生反應(yīng)，且條帶明顯，無其它雜帶。表明這4株單抗均為抗hrNT-proBNP的單克隆抗體，與間接ELISA法的篩選結(jié)果一致。

圖6 SDS-PAGE電泳分析純化后的抗體純度

圖7 四株單克隆抗體的Western blot分析

2.6.2 單克隆抗體與其它心肌標(biāo)志物的交叉反應(yīng)性檢測 結(jié)果（圖8）顯示，4株單克隆抗體與重組蛋白hrNT-proBNP呈明顯的陽性反應(yīng)，與其它蛋白均無特異性交叉反應(yīng)。

圖8 四株單克隆抗體與其它心肌標(biāo)志物的交叉反應(yīng)性

2.7 四株單克隆抗體相對親和力檢測

單克隆抗體相對親和力檢測結(jié)果（圖9）顯示，1G12、1B2、3D5和2D11四株單克隆抗體識別包被抗原h(huán)rNT-proBNP的親和常數(shù)依次為9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012和6.33×1010。

2.8 四株雜交瘤細(xì)胞株的穩(wěn)定性

雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體能力的穩(wěn)定性的檢測結(jié)果（圖10）表明，4株細(xì)胞均能連續(xù)3個(gè)月穩(wěn)定分泌特異性抗hrNT-proBNP的抗體。

3 討論

BNP隸屬于鈉尿肽家族，是一種肽類激素，具有利尿、利鈉、抗腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)、舒張血管和降低血壓等作用，參與人體水鹽平衡的調(diào)節(jié)。而NT-proBNP則是BNP形成過程中所產(chǎn)生的無生物活性的氨基酸片段，NT-proBNP生物半衰期更長更穩(wěn)定，是比BNP更敏感可靠的指標(biāo)，因此在臨床應(yīng)用上逐漸取代了BNP。正常人體內(nèi)，NT-proBNP 水平極低，外周血的濃度一般小于450 pg/mL，當(dāng)因容量負(fù)荷引起心室壓力的改變以及室壁張力的增加時(shí)，會刺激BNP分泌，因此血液中NT-proBNP濃度的升高能很好地反映心室結(jié)構(gòu)和功能的改變，心臟有無損傷及損傷程度［18］。大量臨床研究表明NT-proBNP在預(yù)測心力衰竭和術(shù)后監(jiān)測方面是代表性標(biāo)志物，是一個(gè)強(qiáng)有力的獨(dú)立預(yù)測因子［19］。近年來NT-proBNP在檢測胎兒PDA和雙胞胎宮內(nèi)生長受限方面也取得了重要的進(jìn)展，成為一個(gè)更加重要的指標(biāo)［20，21］。

圖9 非競爭ELISA法檢測1G12（A）、1B2（B）、3D5（C）和2D11（D）的親和常數(shù)

國際上檢測NT-proBNP最常用的是免疫學(xué)方法，包括雙抗體夾心法，熒光免疫層析法，電化學(xué)發(fā)光法等多種方法，而電化學(xué)發(fā)光法由于特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測線低得到廣泛應(yīng)用。免疫學(xué)方法中診斷試劑盒檢測的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性與抗體的性能如特異性、穩(wěn)定性密切相關(guān)［22］。單克隆抗體由于特異性強(qiáng)，均一性高，生物活性單一和來源穩(wěn)定，易于大量生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)在疾病研究及診斷中的應(yīng)用逐步取代了多克隆抗體。但生產(chǎn)檢測試劑所需要的單抗隆抗體基本上被國外公司所壟斷，價(jià)格昂貴，因此國內(nèi)自主研發(fā)優(yōu)質(zhì)單克隆抗體顯得很重要。制備單克隆抗體基本分為兩種方法，傳統(tǒng)的免疫學(xué)方法和基因工程的方法，傳統(tǒng)免疫學(xué)方法技術(shù)成熟應(yīng)用更為廣泛者，而基因工程技術(shù)由于可獲得大量高活性，高純度，特異性強(qiáng)的抗體的優(yōu)點(diǎn)，在臨床研究中逐步有所應(yīng)用。本研究采用傳統(tǒng)免疫學(xué)方法制備了4株單克隆抗體，本章共進(jìn)行了5次的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，經(jīng)間接ELISA法篩選和亞克隆后，共獲得4株能穩(wěn)定分泌抗人NT-proBNP單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株1G12、1B2、3D5和2D11。采用小鼠體內(nèi)誘生法大量制備單抗腹水并用正辛酸-硫酸銨沉淀法對腹水進(jìn)行純化獲得4株相應(yīng)的單克隆抗體。經(jīng)鑒定，4株單克隆抗體的純度均達(dá)75%以上，且與人H-FABP、Myo、CK-MB、CTnI等4種常見心肌標(biāo)志物的天然蛋白均無交叉反應(yīng)，特異性良好；1G12、1B2和3D5的抗體效價(jià)可達(dá)106，相對親和常數(shù)分別為 9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012；而 2D11的抗體效價(jià)達(dá)104，相對親和常數(shù)為6.33×1010。2D11抗體效價(jià)和親和常數(shù)明顯低于其它3株抗體，針對開發(fā)免疫層析式快速診斷試劑時(shí)，需要高親和力的抗體才能實(shí)現(xiàn)檢測靈敏，快速。這表明2D11極可能不適合應(yīng)用于熒光免疫層析平臺。

利用本實(shí)驗(yàn)室特有的甲基纖維素半固體基培養(yǎng)法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)和篩選，在顯微鏡下直接挑取單細(xì)胞克隆，大大地減少了利用傳統(tǒng)的有限稀釋法進(jìn)行細(xì)胞亞克隆的次數(shù)，極大地提高了抗體制備的工作效率。獲得了4株特異性抗人NT-proBNP的單克隆抗體，豐富了國內(nèi)市場NT-proBNP單抗的種類。NT-proBNP是一種標(biāo)志性的心肌標(biāo)志物，其臨床應(yīng)用價(jià)值必將越來越廣泛。因此針對NT-proBNP不同抗原表位的單克隆抗體也必將逐漸豐富起來，同時(shí)為了增加診斷的準(zhǔn)確性，結(jié)合其它的標(biāo)志物如cTnI等制備復(fù)合型快速診斷試劑在未來必將有更加廣泛的應(yīng)用。國內(nèi)POCT市場對其快速定量試劑診斷的需求必將越來越旺，研發(fā)更多國內(nèi)優(yōu)質(zhì)的NT-proBNP單克隆抗體對沖破國際市場的壟斷，降低成本，減輕病患的負(fù)擔(dān)有更加積極的意義。

圖10 四株雜交瘤細(xì)胞株分泌抗體能力的穩(wěn)定性的檢測

4 結(jié)論

本研究共進(jìn)行了5次的細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，經(jīng)間接ELISA法篩選和亞克隆后，共獲得4株能穩(wěn)定分泌抗人NT-proBNP單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞株1G12、1B2、3D5和2D11。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Preparation and Identification of Monoclonal Antibody Specifically Against Human NT-proBNP

LIU Peng-zhan1HUANG Qi-ling2HE Xiao-wei1LI Wen-mei1，2ZHANG Wen-qi1ZHANG Sai2
（1. School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640；2. Guangzhou Wondfo Biotech Corporation Ltd.，Guangzhou 510663）

This study aims to prepare and identify monoclonal antibodies specifically against human NT-proBNP. Balb/c mice was immunized with labeled recombinant protein NT-proBNP，then the spleen cells with high titer of the mice’s serum were fused with SP2/0 myeloma cells. Further，the positive hybridoma cell lines were established after HAT selection and subcloning by limiting dilution，ascites were prepared by injecting cells to mice’s abdomen，and monoclonal antibodies were purified by caprylic acid-ammonium sulfate precipitation method. Finally，basic functions of these monoclonal antibodies such as subclasses，titers，specificity，affinity constants were analyzed. Four positive hybridoma cell lines stably secreting human monoclonal antibodies of anti-NT-proBNP were screened out，and named as 1G12，1B2，3D5，and 2D11；1G12 and 1B2 belonged to IgG2a，2D11 to IgG1，and 3D5 to IgG2b. The titers of 1G12，1B2 and 3D5 reached 106，while the titer of 2D11 only was 104. The affinity constants of 1G12，1B2，3D5 and 2D11 were 9.32×1011，1.07×1012，2.31×1012，and 6.33×1010，respectively. In conclusion，the monoclonal antibody of specifically against human NT-proBNP was prepared successfully.

NT-proBNP；monoclonal antibodies；Enzyme-linked immunosorbent assay

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.021

2015-08-28

劉鵬展，女，碩士，研究方向：功能碳水化合物材料理論與技術(shù)；E-mail：liupengzhan8023@126.com

何小維，男，博士，研究方向：功能碳水化合物材料理論與技術(shù)；E-mail：Davidxwhe@126.com