家蠅核糖體蛋白S18基因的克隆及表達(dá)模式研究

胡亞盧誠(chéng)魏川川修江帆，2吳建偉，2

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2. 貴州博康生物工程有限公司，貴陽(yáng) 550004）

家蠅核糖體蛋白S18基因的克隆及表達(dá)模式研究

胡亞1盧誠(chéng)1魏川川1修江帆1，2吳建偉1，2

（1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550004；2. 貴州博康生物工程有限公司，貴陽(yáng) 550004）

旨為證實(shí)核糖體蛋白S18（Ribosomal protein S18，RPS18）基因在家蠅體內(nèi)的表達(dá)穩(wěn)定性。從構(gòu)建家蠅幼蟲(chóng) cDNA文庫(kù)中篩選到核糖體蛋白S18基因，以cDNA為模板，通過(guò) PCR 擴(kuò)增，獲得RPS18基因完整編碼序列（登錄號(hào)：KT006855），運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因及其編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。構(gòu)建 pET28a/RPS18重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Transetta（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白純化，制備多克隆抗體并進(jìn)行抗血清特異性分析。應(yīng)用RT-PCR、qPCR及Western-blot從轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上分析RPS18基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期和三齡幼蟲(chóng)不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，RPS18基因ORF全長(zhǎng)459 bp，編碼152個(gè)氨基酸，理論分子量為17 590.5 Da，等電點(diǎn)為10.48；將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta（DE3）中，純化得到RPS18蛋白；將該純化蛋白免疫大白兔獲得多克隆抗體，His單抗鑒定及抗血清特異性分析顯示，其均可見(jiàn)單一條帶；RT-PCR、qPCR及Westernblot分析表明，RPS18基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及幼蟲(chóng)不同組織均能夠穩(wěn)定表達(dá)；綜合分析表明，該基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及幼蟲(chóng)不同組織均保持較好的表達(dá)穩(wěn)定性。

核糖體蛋白S18（RPS18）；家蠅；內(nèi)參基因；原核表達(dá)；表達(dá)模式

管家基因又稱持家基因，是所有細(xì)胞中均表達(dá)的一類基因，其產(chǎn)物是對(duì)維持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的［1，2］。該基因一直處于活性轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，表達(dá)水平受環(huán)境因素影響較小，而且是在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)，或幾乎全部組織中持續(xù)表達(dá)，它的表達(dá)只受啟動(dòng)序列或啟動(dòng)子與RNA聚合酶相互作用的影響，而不受其他機(jī)制調(diào)節(jié)。管家基因被認(rèn)為在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平方面保持恒定，其通常作為內(nèi)參基因校正上樣量及上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［3］。隨著對(duì)昆蟲(chóng)功能基因研究的不斷深入，為了獲得真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)通常采用內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)校正和均一化［4］，從而對(duì)內(nèi)參基因的研究顯得極為重要，目前通常以微管蛋白基因（α-tubulin、TUA、β-tubulin、TUB）［5］、核糖體蛋白（如RPSs、RPLs）［6］、肌動(dòng)蛋白（如βactin）［7］、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）［8］、轉(zhuǎn)錄延伸 因 子 基 因（Transcription elongation factors，EF-1α）、多聚泛素酶基因（ubiquitin，UBQ）、18S核糖體RNA（18S ribosomal RNA，18S rRNA）［9］等管家基因作為內(nèi)參基因評(píng)估昆蟲(chóng)基因的表達(dá)［10］。

目前在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的核糖體蛋白（Ribosomal protein，RP）有80多種，廣泛分布于各種組織中，核糖體蛋白的命名與蛋白在核糖體的大小亞基有關(guān)。小亞基核糖體蛋白命名為S1-S31，大亞基核糖體蛋白命名為L(zhǎng)1-L44［11］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，多種 RP除組成核糖體、參與蛋白質(zhì)生物合成之外，還具有其他的功能［12］，如在哺乳動(dòng)物和果蠅中，RPS3有核酸內(nèi)切酶的作用，RPS2基因突變引起卵子發(fā)育停滯，RPS10參與轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的抗終止作用，RPS12參與RNA的加工過(guò)程［13］。核糖體蛋白S18是真核生物核糖體40S亞基的組成蛋白之一，是一種高度保守的蛋白質(zhì)，屬于核蛋白S13超家族成員，由于穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞）中，而且其表達(dá)量近似，并無(wú)顯著性差別，近年來(lái)已有實(shí)驗(yàn)將其作為內(nèi)參基因進(jìn)行研究［14］。

家蠅（Musca domestica）呈世界性分布，是重要的媒介昆蟲(chóng)，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，有強(qiáng)大的先天性免疫系統(tǒng)及生長(zhǎng)代謝調(diào)節(jié)功能［15-17］。近年來(lái)，對(duì)于家蠅功能基因的系統(tǒng)研究已成為研究熱點(diǎn)，從核酸和蛋白水平評(píng)估基因的時(shí)空表達(dá)變化是研究功能基因的基礎(chǔ)。在家蠅中，僅在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行優(yōu)化選擇研究［18］，但對(duì)于蛋白翻譯水平，到目前仍未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)家蠅核糖體蛋白S18（RPS18）基因完整開(kāi)放閱讀框序列進(jìn)行基因克隆及原核表達(dá)，并通過(guò)RT-PCR、qPCR及采用Western-blot從轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上分析其在家蠅不同發(fā)育時(shí)期和不同組織中的表達(dá)情況，評(píng)估RPS18基因作為家蠅內(nèi)參基因的可靠性，旨在為今后進(jìn)行家蠅功能基因的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物材料與菌種 家蠅由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室常規(guī)飼養(yǎng)；清潔級(jí)新西蘭大白兔，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；宿主菌感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1和Transetta（DE3）購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；載體pMD18-T和pET28a（N端6×His蛋白純化標(biāo)簽）購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、rTaq酶、MiniBEST小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，DNA Marker DL2000、羊抗兔IgG/HRP、抗His標(biāo)簽抗體、protein marker、總RNA提取試劑TRIzol Reagent、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、EZ-buffers H10*TBST buffer購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；卡那霉素；RPS18抗體由實(shí)驗(yàn)室自制；所用引物由上海生工生物工程公司合成。JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司），PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)Eppendorf公司），冷凍高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），凝膠成像系統(tǒng)IQuant400（美國(guó)Amersham Pharmacia公司）。

1.2 方法

1.2.1 家蠅幼蟲(chóng)總RNA的提取及cDNA合成 總RNA的提取按照TaKaRa公司TRIzol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。分別對(duì)家蠅不同發(fā)育時(shí)期（卵、一齡幼蟲(chóng)、二齡幼蟲(chóng)、三齡幼蟲(chóng)、蛹、雌蠅、雄蠅）和三齡幼蟲(chóng)不同組織（體壁、馬氏管、脂肪體、腸道、唾液腺）提取總RNA，總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)，GeneQuant公司核酸定量分析儀測(cè)定A260/280比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)分別合成cDNA第一鏈，三齡幼蟲(chóng)作為基因克隆的模板。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI公布的家蠅基因組RPS18基因預(yù)測(cè)序列，篩選到編碼該基因的ORF序列，運(yùn)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆引物（F1、R1），成熟肽原核表達(dá)引物（F2、R2）。以上引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其序列如下：F1：5'-ATGTCGCTCGTTATCCCAGAAAAG-3'，R1：5'-TTACTTCTTCTTGGATACACCGACA-3'；F2：5'-CGCGGATCCATGTCGCTCGTTAT-3'，R2：5'-CCC AAGCTTTTACTTCTTCTTGGAT-3'。

1.2.3 pMD18-T/RPS18克隆載體的構(gòu)建 以上述家蠅幼蟲(chóng)cDNA為模板，應(yīng)用基因克隆引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物檢測(cè)：2%的瓊脂糖凝膠電泳。用DNA凝膠回收試劑盒，純化PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp+抗性的LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，次日挑單克隆進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，送生物公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 利用瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy，http://ca.expasy.org/）提供的生物信息學(xué)工具分析家蠅RPS18基因的特點(diǎn)；運(yùn)用NCBI Blast對(duì)基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，用ProtParam分析蛋白等電點(diǎn)、分子質(zhì)量；ProtScale分析蛋白質(zhì)的疏水性；SignaIP4.1分析信號(hào)肽位點(diǎn)；免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)分析資源IEDB Analysis Recource網(wǎng)站（http://tools. immuneepitope.org/tools/bcell/iedb_input）分析抗原表位。

1.2.5 pET28a/RPS18表達(dá)載體的構(gòu)建 以pMD18-T/RPS18質(zhì)粒為模板，應(yīng)用表達(dá)引物（F2、R2）擴(kuò)增RPS18序列，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物檢測(cè)：2%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒回收純化，將純化的PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET28a重組，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Kan+抗性的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后，用質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒，測(cè)序并鑒定。

1.2.6 家蠅RPS18重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化及Western-blot鑒定 將重組質(zhì)粒pET28a/RPS18轉(zhuǎn)入Transetta（DE3）。挑取陽(yáng)性克隆接種于5 mL LB培養(yǎng)液中37℃，200 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。取菌液3 mL于100 mL LB培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)。當(dāng)OD600檢測(cè)值是0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，34℃，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。用12% SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白表達(dá)情況。誘導(dǎo)菌液離心10 000 r/min，10 min收集菌體，裂解緩沖液重懸菌體，超聲裂解懸浮液（160 W，超聲2 s，間歇5 s，循環(huán)數(shù)90）。懸浮液4℃、13 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀，根據(jù)Ni-IDA Agarose蛋白純化說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行純化，12% SDSPAGE判斷重組蛋白的可溶性。用兔來(lái)源的抗6×His單克隆抗體（1∶2 000）為一抗，羊抗兔IgG-HRP（1∶2 000）為二抗，進(jìn)行Western blotting鑒定純化的家蠅RPS18融合蛋白。

1.2.7 多克隆抗體的制備及抗血清特異性分析 將純化好的重組蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，600 μg分為4次注射，蛋白質(zhì)與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻，皮下多點(diǎn)注射新西蘭大白兔，初次注射量為300 μg。加強(qiáng)免疫每次間隔10 d，蛋白質(zhì)與等體積的不完全弗氏佐劑充分混勻，皮下多點(diǎn)注射新西蘭大白兔，注射量為100 μg，4次免疫后間隔7 d再進(jìn)行采血，并分離血清。500 μL/管分裝，-80℃保存。同時(shí)以注射PBS的新西蘭大白兔作為陰性對(duì)照。

以新西蘭大白兔抗家蠅RPS18重組蛋白血清和初次免疫前新西蘭大白兔陰性血清為一抗（1∶20），以羊抗兔IgG-HRP為二抗（1∶2 000），進(jìn)行Western blotting分析家蠅RPS18重組蛋白的免疫原性。1.2.8 RPS18基因轉(zhuǎn)錄水平研究 通過(guò)RT-PCR方法，以家蠅不同發(fā)育時(shí)期（卵、一齡幼蟲(chóng)、二齡幼蟲(chóng)、三齡幼蟲(chóng)、蛹、雌蠅、雄蠅）和三齡幼蟲(chóng)不同組織（體壁、馬氏管、脂肪體、腸道、唾液腺）cDNA為模板，用F1、R1為引物擴(kuò)增RPS18序列，PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物檢測(cè)：2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)家蠅不同發(fā)育時(shí)期和不同組織RPS18基因的表達(dá)。

RPS18的qPCR，按照TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTMII（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明，使用ABI PRISM 7500（ABI，USA）進(jìn)行Real-time PCR，每個(gè)反應(yīng)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL、cDNA 2.0 μL；滅菌蒸餾水補(bǔ)足體積。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，確認(rèn)qPCR的熔解曲線鑒定產(chǎn)物的特異性。

1.2.9 RPS18基因翻譯水平研究 提取不同發(fā)育時(shí)期（卵、一齡幼蟲(chóng)、二齡幼蟲(chóng)、三齡幼蟲(chóng)、蛹、雌蠅、雄蠅）家蠅及家蠅三齡幼蟲(chóng)不同組織（體壁、馬氏管、脂肪體、腸道、唾液腺）總蛋白，用Western-blot檢測(cè)RPS18的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 家蠅pMD18-T/RPS18克隆載體構(gòu)建

選用克隆引物進(jìn)行PCR 鑒定重組質(zhì)粒，結(jié)果（圖 1第1泳道）顯示，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，確定插入片段連接方向正確。

圖 1 pMD18-T/RPS18及pET28a/RPS18重組質(zhì)粒 PCR鑒定

2.2 生物信息學(xué)分析

家蠅RPS18蛋白基因全長(zhǎng)為459 bp，編碼152個(gè)氨基酸（圖2）。 序列已上傳 NCBI GenBank，登錄號(hào)：KT006855。ExPASy中 ProtParam預(yù)測(cè)RPS18的理論分子量17 590.5 Da，其等電點(diǎn)為10.48。280 nm處的摩爾消光系數(shù)為 16 960 M-1cm-1，0.1%濃度的ABS為0.964。若其成熟肽N-末端為蛋氨酸時(shí)，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)織紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30 h，在酵母和大腸桿菌中表達(dá)的半衰期分別>20 h和>10 h。在溶液中RPS18 的不穩(wěn)定指數(shù)為47.41，其性質(zhì)不穩(wěn)定，RPS18的疏水指數(shù)為90.99，疏水性較高（圖3）。

圖2 RPS18基因開(kāi)放閱讀框cDNA序列及對(duì)應(yīng)編碼的氨基酸序列

圖3 ProtScaler軟件RPS18的疏水性分析

2.3 家蠅pET28a/RPS18表達(dá)載體構(gòu)建

選用組合引物：表達(dá)目的基因上游+下游組合；質(zhì)粒 T7啟動(dòng)子+質(zhì)粒T7終止子；目的基因上游+質(zhì)粒T7終止子；質(zhì)粒T7啟動(dòng)子+目的基因下游進(jìn)行PCR鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果（圖 1第2、3、4、5泳道）顯示，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，顯示表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 家蠅pET28a/RPS18重組蛋白表達(dá)、純化鑒定及抗體制備

2.4.1 家蠅pET28a/RPS18重組蛋白表達(dá)及純化將鑒定為陽(yáng)性的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到表達(dá)菌株Transetta（DE3）中，經(jīng)終濃度為0.25 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)18 h獲得重組蛋白。SDS-PAGE電泳分析結(jié)果（圖4）顯示，在約21 kD處有外源蛋白表達(dá)條帶出現(xiàn)（pET28a載體His標(biāo)簽及部分載體蛋白大小約為3.2 kD），與預(yù)期分子量一致。將蛋白進(jìn)行純化，結(jié)果（圖3第7泳道）證明目的蛋白純化成功。

圖4 12% SDS-PAGE分析pET28a/RPS18在大腸桿菌Transetta（DE3）中表達(dá)純化效果

2.4.2 HIS單克隆抗體檢測(cè)RPS18重組蛋白 用兔來(lái)源的抗6×His單克隆抗體作為Western-blot中的一抗，其能夠識(shí)別家蠅RPS18純化蛋白，出現(xiàn)特異性目的條帶，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)RPS18基因原核重組表達(dá)成功，重組蛋白帶有His純化標(biāo)簽（圖5第1、2、5、6、9、10泳道）。

2.4.3 RPS18重組蛋白抗血清特異性檢測(cè) 將純化的RPS18重組蛋白分別與重組蛋白免疫的新西蘭大白兔的抗血清相互作用，在約21 kD（圖6第1、2、5、6、9、10泳道）可見(jiàn)一明顯的免疫反應(yīng)條帶，其大小與預(yù)測(cè)RPS18重組蛋白分子量相近，陰性對(duì)照血清（圖6第3、4、7、8、11、12泳道）在相應(yīng)的位置未識(shí)別出條帶，說(shuō)明制備的多克隆抗體能與RPS18蛋白產(chǎn)生特異的免疫印跡反應(yīng)。

圖5 His單克隆抗體鑒定純化的RPS18重組蛋白的表達(dá)

圖6 RPS18重組蛋白的抗血清特異性分析

2.5 RPS18基因轉(zhuǎn)錄水平的研究

2.5.1 RT-PCR檢測(cè)RPS18基因的表達(dá) 以家蠅不同發(fā)育時(shí)期和三齡幼蟲(chóng)不同組織cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，均能擴(kuò)增出特異性條帶（圖7，圖8），說(shuō)明RPS18基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及不同組織間呈一致性表達(dá)，且表達(dá)量較為穩(wěn)定。

2.5.2 qPCR檢測(cè)RPS18基因的表達(dá) 通過(guò)軟件GraphPad Prism 5，采用CT值法對(duì)RPS18基因在家蠅生活史中各齡期及不同組織中的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并以CT Value為縱坐標(biāo)、各齡期或三齡幼蟲(chóng)不同組織為橫坐標(biāo)作圖。結(jié)果表明，RPS18基因的qPCR分析，CT值線性范圍為19-21之間（圖9，圖10）。

圖7 家蠅不同組織RPS18基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖8 家蠅不同發(fā)育時(shí)期RPS18基因的擴(kuò)增結(jié)果

圖9 RPS18基因在家蠅生活史不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)

圖10 RPS18基因在家蠅三齡幼蟲(chóng)不同組織的表達(dá)

圖11 家蠅不同組織RPS18蛋白的表達(dá)

圖12 家蠅不同發(fā)育時(shí)期RPS18蛋白的表達(dá)

2.6 RPS18基因翻譯水平的研究

將提取的家蠅不同發(fā)育時(shí)期及三齡幼蟲(chóng)不同組織總蛋白進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果（圖11，圖12）顯示，約在21 kD處均顯示有目的蛋白。

3 討論

選擇理想的內(nèi)參基因?qū)Λ@得準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果是至關(guān)重要的，選擇適當(dāng)?shù)膬?nèi)參基因以減少檢測(cè)標(biāo)本間的差異是必須的［19］，因此內(nèi)參基因的表達(dá)水平應(yīng)相對(duì)穩(wěn)定且受環(huán)境影響較小。家蠅孳生于雜亂菌叢的環(huán)境中傳播疾病，是重要的媒介昆蟲(chóng)，其免疫防御、免疫協(xié)助得到很多研究者的關(guān)注，而目前為止沒(méi)有一個(gè)內(nèi)參基因能夠作為家蠅功能基因研究的參照和參考依據(jù)，但對(duì)于其他昆蟲(chóng)（如娥［20］發(fā)現(xiàn)β-tubulin和β-actin基因在金紋細(xì)蛾不同發(fā)育階段蟲(chóng)態(tài)間表達(dá)最穩(wěn)定；β-actin和18S基因在金紋細(xì)蛾成蟲(chóng)不同組織間表達(dá)最穩(wěn)定；蚊［21］rspL40、BTF3在不同組織中表達(dá)最穩(wěn)定，rspL40、rsp5在吸血不同時(shí)相表達(dá)最穩(wěn)定）已有關(guān)于穩(wěn)定內(nèi)參基因的相關(guān)報(bào)道，此外對(duì)于家蠅內(nèi)參基因的研究?jī)H限于轉(zhuǎn)錄水平［18-22］，且在不同組織及發(fā)育時(shí)期能夠穩(wěn)定表達(dá)，與本研究結(jié)果一致，對(duì)于翻譯水平，到目前仍未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本研究從家蠅幼蟲(chóng)cDNA 文庫(kù)中篩選到核糖體蛋白S18基因序列，全長(zhǎng)459 bp，編碼152個(gè)氨基酸，理論分子量為17 590.5 Da，等電點(diǎn)為10.48。成功克隆了RPS18基因，并插入pET28a表達(dá)載體，選用pET系統(tǒng)是因?yàn)樵撦d體具有很強(qiáng)的表達(dá)重組蛋白的能力，而本實(shí)驗(yàn)選用的pET28a載體本身包含His序列，使載體表達(dá)的重組蛋白含有His融合標(biāo)簽，獲得高純度和高濃度的重組蛋白，并成功制備血清抗體，His單抗鑒定及抗血清特異性分析其均可見(jiàn)單一條帶。本研究從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上對(duì)家蠅不同發(fā)育時(shí)期、三齡幼蟲(chóng)不同組織間RPS18基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示RPS18基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及幼蟲(chóng)不同組織間均能夠穩(wěn)定表達(dá)。綜合分析顯示，該基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及幼蟲(chóng)不同組織均保持了較好的表達(dá)穩(wěn)定性，同時(shí)在一定程度上證明此次家蠅內(nèi)參基因篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，但對(duì)于不同脅迫條件（冷、熱刺激、微生物感染等）下該基因的穩(wěn)定性有待進(jìn)一步研究。本研究將為今后家蠅基因表達(dá)的研究提供依據(jù)和參照，為進(jìn)一步對(duì)家蠅功能基因的研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建pET28a/RPS18重組原核表達(dá)載體并表達(dá)出RPS18蛋白，獲得純化蛋白及其抗體。在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上證明，RPS18基因在家蠅不同發(fā)育時(shí)期及幼蟲(chóng)不同組織間均保持了較好的表達(dá)穩(wěn)定性，同時(shí)證實(shí)此次家蠅內(nèi)參基因的篩選結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Cloning and Expression Pattern of Ribosomal Protein S18 Gene in Musca domestica

HU Ya1LU Cheng1WEI Chuan-chuan1XIU Jiang-fan1，2WU Jian-wei1，2
（1. Basic Medical College，Medical University of Guizhou，Guiyang 550004；2. Guizhou Bokang Bioengineering Co.，Ltd，Guiyang 550004）

This research is to confirm the expression stability of ribosomal protein S18（RPS18）gene in Musca domestica. The complete coding sequence（Registration number in NCBI：KT006855）of RPS18 gene was obtained via PCR amplification using the cDNA of RPS18 gene from the cDNA library of M. domestica larva as a template，further the gene and its encoding protein were predicted and analyzed by bioinformatics method. The constructed recombinant plasmid of pET28a/RPS18 was transferred into Escherichia coli Transetta（DE3）for the induced expression and protein purification，and the polyclonal antibody was prepared as well as the specificity of antiserum was analyzed. The transcription and translation expressions of RPS18 gene at different growth stages of the M. domestica larva and in the different tissues of 3-year larva were analyzed by RT-PCR，qPCR and Western blot. The results showed that the RPS18 ORF was 459 bp in length encoding 152 amino acids with a predicted molecular mass of 17 590.5 Da and pI of 10.48. The recombinant plasmid was transferred into E. coli Transetta（DE3），and the purified protein RPS18 was acquired. The purified protein was immunized to rabbits，then the polyclonal antibody was harvested，and the single band was visualized by both His single resistance identification and antiserum specificity analysis. The analysis by RT-PCR，qPCR and Western blot indicated that RPS18 genes expressed stably in different growth stages and different tissues of the larva. In conclusion，comprehensive analysis suggests that the gene may maintain solid stability in different growth stages of M. domestica and different tissues of larva.

ribosomal protein S18；Musca domestica；reference genes；prokaryotic expression；expression pattern

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.019

2015-09-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81360254），國(guó)家科技部支撐計(jì)劃課題子課題（2011BAC06B12），貴州省科技廳聯(lián)合基金項(xiàng)目（黔科合LH字［2014］7076號(hào)），貴州省衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)項(xiàng)目（gzwjkj2014-2-100），貴州省高等學(xué)校創(chuàng)新能力提升計(jì)劃（07060151306）

胡亞，女，碩士研究生，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)免疫及應(yīng)用；E-mail：hooyaa@126.com

吳建偉，男，博士生導(dǎo)師，研究方向：醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)免疫及應(yīng)用；E-mail：wjw@gmc.edu.cn