過表達(dá)VHA-c3基因擬南芥對(duì)黑暗、ABA與糖的響應(yīng)

蘇杰郭榮起李國(guó)婧王瑞剛

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，土右旗 014109；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，牙克石 162650）

過表達(dá)VHA-c3基因擬南芥對(duì)黑暗、ABA與糖的響應(yīng)

蘇杰1，2郭榮起2，3李國(guó)婧2王瑞剛2

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，土右旗 014109；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018；3. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，牙克石 162650）

為研究液泡H+-ATPase c亞基基因（VHA-c3）在植物生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫應(yīng)答過程中的作用，構(gòu)建了VHA-c3過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得過表達(dá)VHA-c3的轉(zhuǎn)基因純合體植株，采用半定量RT-PCR技術(shù)分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥中VHA-c3的表達(dá)量，然后對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行暗培養(yǎng)、ABA和糖處理。結(jié)果獲得6個(gè)T2代株系轉(zhuǎn)基因純合體株系，其mRNA表達(dá)量均高于對(duì)照；黑暗條件下，5個(gè)VHA-c3轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)變短；在正常光照下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系主根伸長(zhǎng)和子葉的展開以及5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)對(duì)ABA的抑制不敏感；分別有5個(gè)和6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)對(duì)葡萄糖和蔗糖的抑制不敏感。推測(cè)VHA-c3可能影響根細(xì)胞的擴(kuò)展，并可能參與ABA和糖介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

擬南芥；VHA-c3；黑暗；ABA；糖

液泡H+-ATPase（V-ATPase）分布于液泡膜、高爾基體、內(nèi)涵體、質(zhì)膜等真核細(xì)胞分泌系統(tǒng)膜上，是一種轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的酶［1，2］。它們?cè)谥参锛?xì)胞的生長(zhǎng)、離子平衡及逆境脅迫（如干旱、鹽和重金屬等）應(yīng)答方面起重要作用［3］。V-ATPase是一種寡聚酶，由13個(gè)亞基組成，有V1和V0兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。V1域位于胞質(zhì)中，由8個(gè)亞基（A、B、C、D、E、F、G和H）構(gòu)成，為催化區(qū)域，參與ATP的水解；V0域與膜結(jié)合，由亞基a、c、c'、c''、d和e組成，為質(zhì)子傳導(dǎo)區(qū)域［4］。其中，V-ATPase c（VHA-c）亞基以六聚體形式形成環(huán)形結(jié)構(gòu)，是膜V0域的主要組件，且對(duì)V1域與膜的組裝起重要作用，是質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的通道［5］。研究表明，c亞基與植物生長(zhǎng)［6］和抗非生物脅迫［7-9］有關(guān)。

模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）VHA-c亞基由5個(gè)同源基因，即VHA-c1、VHA-c2、VHA-c3、VHA-c4和VHA-c5編碼［10］。有關(guān)擬南芥VHA-c基因的研究已有很多報(bào)道。其中對(duì)于VHA-c3基因的研究顯示，VHA-c3的表達(dá)具有組織特異性且與植物響應(yīng)非生物脅迫有關(guān)。Padmanaban 等［11］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥VHA-c3基因在根尖中呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)。徐萍等［12］揭示VHA-c3 基因在擬南芥的果莢、花、葉、莖和根中都有表達(dá)，但在葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它的組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在VHA-c3基因起始密碼子上游2 812-2 234 bp之間的區(qū)域內(nèi)存在著控制該基因高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。郭榮啟等［13］同樣利用GUS報(bào)告基因，研究了VHA-c3基因的植物組織及器官定位發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同長(zhǎng)度VHA-c3基因上游存在著控制基因在氣孔表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。在逆境及非生物脅迫響應(yīng)方面，Padmanaban等［11］利用dsRNAi發(fā)現(xiàn)VHA-c3對(duì)鹽脅迫敏感。徐萍等［14］的研究揭示擬南芥VHA-c3參與了抗鹽和ABA脅迫反應(yīng)。邸娜等［15］發(fā)現(xiàn)擬南芥VHA-c3基因?qū)ν庠醇に兀ㄈ鏘AA、ABA和ACC）以及鹽脅迫和滲透脅迫有響應(yīng)。于秀敏等［16］揭示4℃低溫和光照促進(jìn)VHA-c3表達(dá)。另外，在礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)調(diào)節(jié)方面，Ca2+和MS營(yíng)養(yǎng)成分促進(jìn)擬南芥VHA-c3的表達(dá)［17］。

基于以上對(duì)VHA-c3基因的研究，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建該基因的過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，采用半定量RT-PCR技術(shù)分析轉(zhuǎn)基因擬南芥中VHA-c3的表達(dá)量；同時(shí)，對(duì)轉(zhuǎn)基因純合體進(jìn)行暗培養(yǎng)、ABA處理和糖處理并觀察其表型，旨為研究VHA-c基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育及非生物脅迫應(yīng)答的功能提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 野生型Columbia生態(tài)型擬南芥，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒 根癌農(nóng)桿菌GV3101、大腸桿菌DH5α和pCHF3載體由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.3 主要試劑 Taq酶、DNA marker和反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自大連寶生物公司，各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自NEB公司，抗生素購自BBI公司，RNaseA、pGM-T、DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒購自北京天根公司，引物合成和測(cè)序工作由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆及過表達(dá)載體構(gòu)建 擬南芥基因組DNA提取采用CTAB法［18］。VHA-c3基因克隆采用PCR法，PCR引物P1為：5'-GGTACCAGAATCGCCTGAGAGATG-3'（Kpn I）和P2為：5'-GGATCCTGACAAACAATATAAGAAGATC-3'（BamH I）。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性1 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸6 min。

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化采用電擊法［19］，過表達(dá)質(zhì)粒載體pCHF3-c3轉(zhuǎn)化到的農(nóng)桿菌GV3101細(xì)胞中，取50 μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂于LB固體培養(yǎng)基（含25 μg/mL Gent和100 μg/mL Spect）上，28℃培養(yǎng)36 h，篩選陽性轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行菌落PCR和雙酶切鑒定，驗(yàn)證正確后得到重組菌GV3101/pCHF3-c3。

1.2.2 擬南芥轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因純合體的獲得 將經(jīng)驗(yàn)證正確后得到的重組菌GV3101/pCHF3-c3于LB固體培養(yǎng)基（同上）平板上劃線，28℃培養(yǎng)48 h。挑取5-6個(gè)單克隆于5 mL的LB液體培養(yǎng)基（含25 μg/mL Gent和100 μg/mL Spect）中培養(yǎng)，28℃震蕩培養(yǎng)過夜。次日，取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液重新接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基（同上）中，28℃震蕩培養(yǎng)至OD600為1.2-1.6。將菌液于4 000 r/min，離心15 min，收集菌體，將菌體用LB液體培養(yǎng)基重懸浮，所得懸浮液OD600為0.8，用于擬南芥的轉(zhuǎn)化。

采用浸花法［20］轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，利用30 μg/mL的Kan對(duì)轉(zhuǎn)基因植株T2代進(jìn)行篩選，鑒定出純系用于本研究的各項(xiàng)分析。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)量 提取野生型和VHA-c3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因純系擬南芥的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。再分別以野生型和過表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合體的cDNA為模板，對(duì)actin（At3g12110）和VHA-c3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。actin引物為P3：5'-ATGGCAGATGGTGAAGACATTCAG-3'和P4：5'-GAAGCACTTCCTGTGGACTATTGA-3'，VHA-c3引物為P5：5'-CATATTTTAAGATCCAGAATCGCCTGAGAG-3' 和P6：5'-TTCGGCTCTGGACTGACCAGCTCGGGAGGA-3'。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min［11］。將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析（Syngene公司凝膠成像儀）。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因植株暗培養(yǎng) VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時(shí)種在1/2MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株ABA處理 （1）VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時(shí)種在1/2MS培養(yǎng)基中，4℃春化3 d，再于22℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)，48 h后轉(zhuǎn)移至含不同濃度ABA（0、4、8和12 μmol/L）的1/8MS培養(yǎng)基上，16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng)4 d，統(tǒng)計(jì)主根長(zhǎng)度。（2）VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體和野生型擬南芥種子同時(shí)種在含有不同濃度ABA（0、0.5、1和2 μmol/L）的1/2MS培養(yǎng)基中，4℃春化3 d后于22℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)2 d，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株糖處理 VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體和野生型種子同時(shí)分別種在含葡萄糖或蔗糖（濃度均為0%、4%、5%和6%）的1/2MS培養(yǎng)基中，4℃春化3 d后于22℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)其萌發(fā)率。

2 結(jié)果

2.1 VHA-c3基因的克隆及過表達(dá)載體pCHF3-c3的構(gòu)建

以擬南芥基因組DNA為模板，以P1、P2為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小為1 636 bp基因片段VHA-c3，PCR產(chǎn)物與pGM-T載體連接后測(cè)序。驗(yàn)證目的片段正確后，將陽性質(zhì)粒pGM-T-c3和表達(dá)載體pCHF3用KpnⅠ和BamHⅠ雙酶切，膠回收VHA-c3基因和pCHF3載體，連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，提取陽性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，進(jìn)行KpnⅠ和BamHⅠ的雙酶切驗(yàn)證，證明重組表達(dá)載體pCHF3-c3構(gòu)建成功。用電擊法將重組質(zhì)粒pCHF3-c3轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，挑選培養(yǎng)在含Spect和Gent的LB固體培養(yǎng)基上的單克隆，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)呈陽性，證明重組質(zhì)粒pCHF3-c3已經(jīng)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中。

2.2 VHA-c3轉(zhuǎn)基因植株的篩選

重組質(zhì)粒pCHF3-c3經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。篩選后獲得30個(gè)T1代轉(zhuǎn)基因株系，進(jìn)一步篩選獲得6個(gè)T2代轉(zhuǎn)基因純合體株系，分別是：c3-8-3、c3-11-1、c3-12-5、c3-16-8、c3-21-1和 c3-22-6。

2.3 VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體半定量RT-PCR鑒定

以野生型為對(duì)照，采用半定量RT-PCR對(duì)VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體進(jìn)行檢測(cè)（圖1）。將WT的VHA-c3的轉(zhuǎn)錄水平定為100%，c3-16-8的mRNA表達(dá)水平較強(qiáng)（表達(dá)量為181%）；c3-8-3、c3-11-1和c3-12-5的mRNA表達(dá)水平居中（表達(dá)量分別為159%、141% 和 163%）；c3-21-1和 c3-22-6的 mRNA表達(dá)水平較弱（表達(dá)量分別為103%和106%）。

圖1 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合體VHA-c3基因的mRNA表達(dá)水平

2.4 VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體暗培養(yǎng)后根的變化

在正常光照培養(yǎng)下，VHA-c3過表達(dá)純合體與野生型擬南芥差異不明顯。將轉(zhuǎn)基因純合體暗培養(yǎng)5 d后測(cè)量根長(zhǎng)，結(jié)果（圖2，圖3）顯示，有5個(gè)株系的平均根長(zhǎng)比對(duì)照分別短11%、31%、9%、21%和15%。表明在黑暗條件下，VHA-c3基因過量表達(dá)抑制了根的生長(zhǎng)。

2.5 ABA處理下VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體的變化

2.5.1 VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體主根伸長(zhǎng)和子葉的變化 經(jīng)ABA處理后，有3個(gè)VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體株系的主根相對(duì)伸長(zhǎng)量比對(duì)照增加。ABA濃度越高，轉(zhuǎn)基因純合體和野生型主根生長(zhǎng)被抑制的程度及子葉的黃化程度越大，且VHA-c3轉(zhuǎn)基因株系子葉的展開程度要高于對(duì)照（圖4，以c3-12-5為例）。在4 μmol/L ABA濃度下，3個(gè)株系主根的相對(duì)伸長(zhǎng)量平均比對(duì)照分別增加3%、1%和16%；在8 μmol/L ABA濃度下，分別增加1%、6%和16%；在12 μmol/L ABA濃度下，分別增加6%、1%和10%（圖5）。

圖2 VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體在暗培養(yǎng)下根長(zhǎng)變短

圖3 暗培養(yǎng)條件下VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體根伸長(zhǎng)變短

圖4 不同濃度ABA處理下的轉(zhuǎn)基因系c3-12-5

圖5 ABA處理下VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體主根相對(duì)伸長(zhǎng)量

2.5.2 VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體種子萌發(fā)率的變化 當(dāng)用濃度大于2 μmol/L的ABA處理VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體時(shí)，幾乎所有種子的萌發(fā)全部被抑制；當(dāng)ABA濃度介于0-2 μmol/L時(shí)，有5個(gè)過表達(dá)純系和野生型種子的萌發(fā)受到抑制，且當(dāng)ABA濃度增大時(shí)，種子萌發(fā)率均下降。在不同濃度ABA抑制下，這5個(gè)轉(zhuǎn)基因純系的萌發(fā)率均大于對(duì)照：在0.5 μmol/L ABA下，5個(gè)株系的萌發(fā)率比對(duì)照增加32%、15%、25%、2% 和9%；在1 μmol/L ABA下，萌發(fā)率增加量分別為98%、80%、60%、30%和68%；在2 μmol/L ABA濃度下，增加量分別為106%、79%、73%、30%和58%（圖6）。

以上結(jié)果表明，VHA-c3基因的過表達(dá)使根、子葉和種子對(duì)ABA變得不敏感。

圖6 ABA處理下VHA-c3過表達(dá)純合體種子的萌發(fā)率

2.6 不同濃度糖處理下VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體種子萌發(fā)率的變化

濃度小于4%的Glc或Suc對(duì)VHA-c3過表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合體和野生型種子的萌發(fā)影響較??；當(dāng)濃度大于6%時(shí)，種子幾乎不萌發(fā)。在濃度介于4%-6% Glc和Suc處理下，分別有5個(gè)和6個(gè)株系的種子萌發(fā)率高于WT（圖7-A，7-B），具體表現(xiàn)為：

在Glc處理下，濃度為4%時(shí)，這5個(gè)株系的種子萌發(fā)率平均分別比WT增加6%、10%、6%、11%和13%；濃度為5%時(shí)，平均增加15%、27%、22%、25%和29%；濃度為6%時(shí)，平均增加2%、6%、37%、45%和55%。

在Suc處理下，濃度為4%時(shí)，6個(gè)株系的種子萌發(fā)率平均分別比WT增加10%、15%、2%、9%、7%和10%；濃度為5%時(shí)，平均增加12%、19%、11%、5%、9%和13%；濃度為6%時(shí)，平均增加13%、3%、11%、17%、14%和14%。

這說明VHA-c3基因的過表達(dá)使種子對(duì)糖的敏感度降低。

圖7 不同濃度葡萄糖（A）和蔗糖（B）處理下VHA-c3轉(zhuǎn)基因純合體株系種子萌發(fā)率

3 討論

3.1 VHA-c3可能對(duì)根細(xì)胞擴(kuò)展起作用

人們對(duì)V-ATPase亞基在細(xì)胞擴(kuò)展方面的研究發(fā)現(xiàn)，A亞基和E亞基的轉(zhuǎn)錄水平分別在棉花纖維細(xì)胞［21］的伸長(zhǎng)過程或在擴(kuò)展的大麥葉子［22］中增加；C亞基表達(dá)量的減少導(dǎo)致擬南芥突變株det3發(fā)育不良，可能機(jī)制是V-ATPase活性受不同植物激素的調(diào)控，原因在于C亞基對(duì)油菜素內(nèi)酯誘導(dǎo)的細(xì)胞擴(kuò)展是必不可少的［23］；對(duì)轉(zhuǎn)基因胡蘿卜的分析表明，通過抑制A亞基的表達(dá)，其葉子細(xì)胞變?。?4］。Padmanaban等［11］研究發(fā)現(xiàn)VHA-c1對(duì)細(xì)胞擴(kuò)展起重要作用，原因在于VHA-c1啟動(dòng)子在根的伸長(zhǎng)區(qū)及其它不斷增大的組織中的活性很高，同時(shí)通過dsRNA干擾介導(dǎo)的突變株VHA-c1在暗培養(yǎng)下根和下胚軸長(zhǎng)度變短。Zhou等［6］研究過表達(dá)星星草VHA-c轉(zhuǎn)基因擬南芥時(shí)發(fā)現(xiàn)在正常條件和鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株的根長(zhǎng)、鮮重、高度和莢子數(shù)量均大于野生型，經(jīng)檢測(cè)V-ATPase的活性增大，解釋VHA-c在植物生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要作用的機(jī)制是c亞基影響了V-ATPase依賴的內(nèi)涵體的運(yùn)輸。

本研究中多數(shù)VHA-c3過表達(dá)純合體在暗培養(yǎng)下根變短，且在ABA處理下根的相對(duì)伸長(zhǎng)增加，這些結(jié)果也揭示VHA-c3對(duì)根細(xì)胞擴(kuò)展的可能作用。推測(cè)可能是因?yàn)閂HA-c3基因的上游調(diào)控區(qū)存在光敏感元件（如ACE、AE-box、GAG、GATA、TCCC-motif、TCT-motif等）和激素響應(yīng)元件（如ABRE、AuxRR-core、TGA-box、TCA-element、TGACG-motif、TATC-box、P-box、GA-motif等），黑暗信號(hào)和外源ABA的刺激可能直接或間接調(diào)控了轉(zhuǎn)基因植株VHA-c3的表達(dá)，從而影響c亞基的表達(dá)量，使根細(xì)胞的V-ATPase活性改變，影響了V-ATPase依賴的內(nèi)涵體的運(yùn)輸，最終影響根細(xì)胞的擴(kuò)展。當(dāng)然這一機(jī)制還需要進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.2 VHA-c3可能參與ABA和糖介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

ABA是一種參與種子休眠、芽休眠、葉及根的伸展及葉片脫落等生理活動(dòng)的植物激素。研究表明，許多植物在響應(yīng)ABA過程中V-ATPase活性及H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性增加［25］，而且已有報(bào)道稱ABA可以誘導(dǎo)V-ATPase c亞基［7，12］。本研究50%的轉(zhuǎn)基因純系主根伸長(zhǎng)和子葉的展開以及80%的轉(zhuǎn)基因純系的種子萌發(fā)對(duì)ABA的抑制不敏感，推測(cè)VHA-c3的過表達(dá)影響了V-ATPase活性和H+轉(zhuǎn)運(yùn)活性，進(jìn)而影響了擬南芥的種子萌發(fā)及子葉和根的生長(zhǎng)。

另外，很多植物響應(yīng)ABA的生理過程與糖有關(guān)。有人研究了擬南芥的RGS（The regulator of G-protein signaling）蛋白，對(duì)AtRGS1過表達(dá)純合體種子在萌發(fā)階段分別進(jìn)行ABA和葡萄糖處理，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)純合體種子的萌發(fā)率都較野生型高，說明它對(duì)二者均不敏感［26］。類似地，Chen等［27］發(fā)現(xiàn)在種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)方面，對(duì)ABA不敏感的突變體hy5對(duì)糖的抑制同樣是不敏感的。原因是外源ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制致使種子營(yíng)養(yǎng)缺乏，而糖通過提供能量和營(yíng)養(yǎng)克服了ABA對(duì)種子萌發(fā)的抑制，從而緩解代謝的抑制作用［26，27］。本研究發(fā)現(xiàn)VHA-c3過表達(dá)純系對(duì)ABA不敏感后，對(duì)其種子進(jìn)行了葡萄糖和蔗糖處理，得到了類似的結(jié)果，即80%以上的過表達(dá)純系的種子萌發(fā)對(duì)糖不敏感。綜合本實(shí)驗(yàn)ABA、葡萄糖和蔗糖處理的結(jié)果，VHA-c3轉(zhuǎn)基因植株對(duì)以上3種處理均不敏感，這說明VHA-c3可能參與了ABA和糖介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，至于其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究利用過表達(dá)對(duì)擬南芥VHA-c3基因進(jìn)行了研究，對(duì)過表達(dá)純合體進(jìn)行了黑暗、ABA、葡萄糖和蔗糖處理，它們的表型與野生型存在差異。這將為探討VHA-c3基因乃至V-ATPase在植物發(fā)育、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及抗非生物脅迫的功能方面提供線索。

4 結(jié)論

通過構(gòu)建VHA-c3過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化野生型擬南芥，獲得了過表達(dá)VHA-c3的轉(zhuǎn)基因純合體。采用半定量RT-PCR技術(shù)分析了轉(zhuǎn)基因擬南芥中VHA-c3的表達(dá)量，驗(yàn)證了其mRNA的高表達(dá)水平。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行暗培養(yǎng)、ABA和糖處理，結(jié)果顯示，黑暗條件下，83%的VHA-c3轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)變短；在正常光照下，半數(shù)以上的轉(zhuǎn)基因株系在主根伸長(zhǎng)、子葉的展開以及種子萌發(fā)方面對(duì)ABA的抑制不敏感；83%以上的轉(zhuǎn)基因株系在種子萌發(fā)方面對(duì)糖（葡萄糖和蔗糖）的抑制不敏感。推測(cè)VHA-c3可能影響根細(xì)胞的擴(kuò)展，并可能參與ABA和糖介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Responses of Overexpressed Arabidopsis VHA-c3 to Dark，ABA and Sugar

SU Jie1，2GUO Rong-qi2，3LI Guo-jing2WANG Rui-gang2
（1. School of Vocational and Technical，Inner Mongolia Agricultural University，Tuyouqi 014109；2. School of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018；3. Agricultural Sciences of Hulunbeier in Inner Mongolia，Yakeshi 162650）

For studying the role of vacuole H+-ATPase subunit c gene（VHA-c3）in plant growth and abiotic stress response，an over-expression vector of VHA-c3 was constructed and introduced into wild-type Arabidopsis thaliana. The expression levels of VHA-c3 in the transgenic homozygote’s plants were detected by semi-quantitative RT-PCR，then the transgenic homozygote were treated by dark，ABA and sugar. The results indicated that 6 lines of homozygous T2 transgenic plants were obtained，and their corresponding transcript levels were increased. The root lengths of 5 lines were reduced among the dark-grown seedlings. Among the ABA-treated seedlings，3 lines were insensitive in primary root growth and the extent of cotyledon unfolding，and 5 lines were insensitive in seed germination. When treated by glucose and sucrose，5 lines and 6 lines reduced the sensitivity in seed germination，respectively. These results indicate that VHA-c3 may affect the cell expansion of root，and be involved in the signal transduction pathways mediated by ABA and sugar.

Arabidopsis thaliana；VHA-c3；dark；ABA；sugar

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.013

2015-09-14

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30460018），內(nèi)蒙古自治區(qū)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（201503004）

蘇杰，女，碩士，講師，研究方向：植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：sujie_1546@163.com

王瑞剛，男，博士，教授，研究方向：植物生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：ruigangwang@126.com