聚蘋果酸生產(chǎn)菌株出芽短梗霉菌代謝組學(xué)樣品前處理方法的優(yōu)化

范栩嘉邊艷慧殷海松喬長晟，2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2. 天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津 300457；3. 天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300350；4. 天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津 300350）

聚蘋果酸生產(chǎn)菌株出芽短梗霉菌代謝組學(xué)樣品前處理方法的優(yōu)化

范栩嘉1邊艷慧1殷海松3，4喬長晟1，2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2. 天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津 300457；3. 天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300350；4. 天津市輕工業(yè)化學(xué)研究所有限公司，天津 300350）

為了得到更加準(zhǔn)確和完整的胞內(nèi)代謝物信息，從而更加真實的反映微生物胞內(nèi)代謝情況，基于GC-MS平臺，從淬滅劑、提取劑和溶解劑3個方面對代謝組學(xué)樣品制備過程進(jìn)行了系統(tǒng)性的優(yōu)化。對比了不同淬滅劑對胞內(nèi)代謝物的滲出及細(xì)胞損傷情況，結(jié)果表明60%甲醇/0.9% NaCl效果最佳。研究了不同提取劑、溶解劑的提取和溶解效果，結(jié)果顯示60%甲醇提取效果顯著，吡啶溶解效果突出。最終確定了出芽短梗霉菌代謝組樣品最適前處理方法：預(yù)冷的60%甲醇/0.9% NaCl淬滅細(xì)胞，液氮研磨和反復(fù)凍融破碎細(xì)胞，預(yù)冷的60%甲醇提取，最后采用吡啶溶解提取物并采用MSTFA 40℃衍生90 min。采用該方法可以檢測出300多種代謝組分，包括大量氨基酸、有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。本方法可以有效的應(yīng)用于出芽短梗霉菌代謝組學(xué)樣品的研究。

代謝組學(xué)；出芽短梗霉；GC-MS；樣品前處理

聚蘋果酸（poly malic acid，PMLA）屬于聚酯類聚合物，是一種以蘋果酸為唯一單體的均聚高分子聚合物。PMLA具有高度的水溶性、生物可吸收性、生物相容性、生物可降解性、可化學(xué)衍生性及無免疫原性等優(yōu)良的性能的水溶性脂肪族聚酯，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的功能高分子材料［1，2］。出芽短梗霉相較于其他菌株合成的PMLA產(chǎn)率及分子量較高，故被廣泛選為PMLA生產(chǎn)菌株。目前普遍認(rèn)為微生物發(fā)酵積累 PMLA 是以 L-蘋果酸為前體［3］。蘋果酸的生物合成途徑主要有4種，分別為：（1）丙酮酸途徑；（2）6-磷酸葡萄糖途徑；（3）TCA循環(huán)；（4）乙醛酸循環(huán)。然而對于哪一條途徑是合成PMLA的前體物蘋果酸的主要途徑還沒有一個明確的定論，程若東等［4］通過添加代謝抑制劑推斷出芽短梗霉積累PMLA與TCA循環(huán)和乙醛酸途徑有關(guān)。喬長晟等［5］通過對出芽短梗霉代謝通量及關(guān)鍵酶活性分析推斷丙酮酸羧化途徑和乙醛酸途徑為 PMLA的主要合成途徑。

代謝物組學(xué)（metabolomics/metabonomics）是一種通過定性定量測定生物體代謝產(chǎn)物及種類的變化，分析系列關(guān)聯(lián)代謝物的綜合差異，從而發(fā)現(xiàn)生物系統(tǒng)對基因以及環(huán)境變化響應(yīng)的研究方法。它是伴隨基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的興起而逐漸發(fā)展起來的又一門主要組學(xué)，完善了組學(xué)研究系統(tǒng)。通過在轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白組水平上整體分析環(huán)境干擾或基因，可以更全面地了解并分析某一生物或細(xì)胞全面而復(fù)雜系統(tǒng)的生理生化結(jié)構(gòu)和機(jī)理［6，7］。目前，代謝組學(xué)分析技術(shù)主要采用3種分析方法［8，9］：基于核磁共振的分析方法［10］；基于質(zhì)譜的分析方法，通常情況下與色譜聯(lián)用，如GC-MS、LC-MS、CE-MS等［11］；基于光譜的方法，如傅立葉變換紅外光譜、拉曼光譜等［12，13］。其中，GC-MS技術(shù)因其有完整的標(biāo)準(zhǔn)圖庫，代謝物譜圖可檢索性較強(qiáng)，定性鑒定方便等優(yōu)點，從而備受國內(nèi)外代謝組學(xué)研究人員的青睞并被廣泛應(yīng)用與代謝組學(xué)的研究中。

微生物代謝物組學(xué)需要高效可靠的樣品前處理，這樣才能夠確保胞內(nèi)代謝物分析的準(zhǔn)確性［14，15］。由于實驗菌株間具有差異性，若未進(jìn)行條件優(yōu)化直接使用文獻(xiàn)報道方法進(jìn)行處理，難免會對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。為確保所用實驗樣品真實反映細(xì)胞的特定代謝特征，研究合理有效的細(xì)胞內(nèi)代謝物的提取分離方法就顯得尤為重要。目前常用的方法有，使用冷甲醇和冷乙醇等有機(jī)溶劑，瞬間停止細(xì)胞的代謝，再進(jìn)一步用預(yù)冷的有機(jī)溶劑提取代謝物［16，17］。本研究著重對比分析了細(xì)胞淬滅劑、提取溶劑和溶解劑對出芽短梗霉胞內(nèi)代謝物的影響。從細(xì)胞淬滅、代謝物提取和代謝物溶解3個方面，對出芽短梗霉代謝物組學(xué)樣品前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，為準(zhǔn)確分析出芽短梗霉代謝物組學(xué)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CGMCC3337和Aureobasidium pullulans TKPM10017，天津科技大學(xué)生化工程研究室保藏。

1.1.2 主要試劑 甲氧基銨鹽酸鹽（色譜純）與吡啶（色譜純）；N-甲基 -N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（色譜純），購自SIGMA化學(xué)有限公司。色譜純乙腈、甲醇、乙醇、四氫呋喃、二甲基甲酰胺、氯仿。實驗用水為 Milli-Q超純水。

1.1.3 儀器與設(shè)備 GC/MS 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有7683 自動進(jìn)樣器與 6980 氣相色譜儀（GC，Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）。Milli-Q Advantage A10超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同淬滅方法比較 取對數(shù)生長期后期的發(fā)酵液，離心（7 000 r/min，5 min，4℃），棄上清液。然后用4℃的0.9%生理鹽水洗菌體兩次。分別取 5 mL 不同淬滅液［（1）100%甲醇（-40℃）；（2）60%甲 醇（-40℃）；（3）60%乙 醇（-40℃）；（4）60%甲醇/0.9%氯化鈉（-40℃）］，快速加入裝有沉淀的離心管中，用渦旋震蕩器快速混勻，離心（10 000 r/min，5 min，-4℃），將上清液置于-80℃ 保存直到分析，標(biāo)記為胞外樣本。將淬滅后的細(xì)胞液氮研磨20 min，至細(xì)粉狀，稱取 50 mg 于 1.5 mL 離心管中用于小分子代謝物的提取，每個取樣點取 3個平行，液氮研磨后的樣品加入1 mL 預(yù)冷的提取溶劑（70%的冷甲醇）反復(fù)凍融法提取，將上清液置于-80℃保存直到分析，標(biāo)記為胞內(nèi)樣本。萃取液中加入10μL 1 mg/mL的d4-丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。萃取液冷凍干燥，儲存在-20℃直到GC-MS分析。每個滅活方法做3個重復(fù)。

1.2.2 細(xì)胞完整性的測定 淬滅處理后的細(xì)胞沉淀重懸浮于4 mL 1% PBS 緩沖液（8 g/L NaCl，0.2 g/L KCl，1.44 g/L Na2HPO4和 0.24 g/L KH2PO4），置于冰上。通過檢測 OD600減少值評估細(xì)胞的裂解情況。OD回收率計算公式如下：

其中 OD600，Recovered為淬滅后菌體重懸浮的吸光度；OD600，Original為未經(jīng)淬滅菌體重懸浮的吸光度。

1.2.3 滅活過程中代謝物滲出實驗 取10 mL菌體處于指數(shù)生長期的發(fā)酵液（OD620約為9.0），10 000 r/min，5 min，4℃離心得到菌體再使用0.9%氯化鈉潤洗細(xì)胞一次。將菌體重懸在2 mL不同滅活劑中，6 000 r/min，10 min，-4℃離心得到上清。將水洗后的細(xì)胞重懸在0.9%和2.3% NaCl中離心得到的上清作為陰性對照樣品，將水洗后的細(xì)胞重懸在熱0.9% NaCl（70℃，30 min）中離心得到的上清作為陽性對照樣品。測定上述方法得到的上清在260 nm和280 nm的吸光度，分別代表胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的滲出量。同時測定了滅活后水洗液中的代謝物。

1.2.4 細(xì)胞破碎和胞內(nèi)小分子提取 取對數(shù)生長期后期的發(fā)酵液，離心（7 000 r/min，5 min，4℃），棄上清液。然后用 4℃ 的 0.9%生理鹽水洗菌體兩次。向清洗后的細(xì)胞中加入60%甲醇/0.9%氯化鈉（-40℃），用渦旋震蕩器快速混勻，離心（10 000 r/min，5 min，-4℃），-80℃保存?zhèn)溆?。將淬滅后的?xì)胞液氮研磨 20 min，至細(xì)粉狀，稱取 50 mg 于 1.5 mL 離心管中用于小分子代謝物的提取，每個取樣點取 3個平行，液氮研磨后的樣品加入1 mL 預(yù)冷的不同提取溶劑［（1）100%甲醇；（2）60%乙醇；（3）60%甲醇；（4）甲醇/氯仿（1∶1，V/V）］反復(fù)凍融法提取，將上清液置于-80℃保存直到分析，標(biāo)記為胞內(nèi)樣本。萃取液中加入10 μL，1 mg/mL的d4-丁二酸作為內(nèi)標(biāo)。萃取液冷凍干燥，儲存在-20℃直到GC-MS分析。每個提取方法做3個重復(fù)。

臺肇地區(qū)注水系統(tǒng)節(jié)能降耗工作以注配間降壓節(jié)電為目標(biāo)，通過單井、管線、注配間“兩點一線”開展治理工作，按照地面設(shè)備改造、降壓增注措施、地質(zhì)方案優(yōu)化相結(jié)合的思路，深化注水系統(tǒng)能耗挖潛。鑒于注水井可以按照配注完成情況分為兩類：多數(shù)的正常井，注入壓力高低有別；少數(shù)的欠注井，注入壓力接近泵壓。針對前者，注重從注配間地面設(shè)備改造入手，通過采取分壓注水、安裝變頻器、管線改造等措施，力圖將注入壓力接近的井接入統(tǒng)一柱塞泵；針對后者，注重利用采油工程和油藏工程的手段從單井入手，通過利用酸化解堵、化學(xué)洗井和方案優(yōu)化等措施，力圖將高壓欠注井降壓。

1.2.5 不同溶解劑的比較 將冷凍干燥后的樣品，加50 μL甲氧基銨鹽酸鹽 / 不同溶解劑溶液（吡啶、乙腈、四氫呋喃、二甲基甲酰胺）（20 mg/mL），充分溶解樣品，置于40℃水浴中，反應(yīng)90 min；（2）加80 μL N-甲基 -N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺，混合均勻，置于40℃水浴中，反應(yīng)90 min；（3）將衍生后的樣品 10 000 r/min 離心 5 min；取上清液 100 μL加入進(jìn)樣瓶中，并編號，于室溫放置 2 h，準(zhǔn)備進(jìn)行 GC-MS 檢測。

1.2.6 GC/MS檢測 GC條件［18］：Agilent HP5 30 m ×0.25 mm×0.25 μm毛 細(xì) 管 柱；進(jìn) 樣 口 溫 度：280℃，升溫程序：初始溫度 70℃保持 2 min，以5℃/min 程序升溫至 290℃保持 5 min；載氣：高純氦氣，恒壓模式 91 kPa，流速 1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；柱后分流比 10∶1。

MS 條件［18］：接口溫度：280℃；電離方式：EI；電離方式：電子轟擊電離（EI+）；離子源溫度：250℃；電子轟擊能量：70 eV；電子電流：40 μA；掃描質(zhì)量范圍：50-800 m/z。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 將 GC/MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入 MSD 增強(qiáng)型化學(xué)工作站，提取離子峰并用 NIST08 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對進(jìn)行定性，通過將所有的離子峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積相比使數(shù)據(jù)歸一化，再對數(shù)據(jù)進(jìn)行中心化后導(dǎo)入 SIMCA 軟件進(jìn)行 PCA 分析［19，20］。

2 結(jié)果

2.1 不同溶解劑對代謝物溶解效率的影響

出芽短梗霉胞內(nèi)物質(zhì)種類繁多，其中主要有氨基酸類，有機(jī)酸類，糖類等。因此，分析比較了4種不同的溶解劑吡啶、乙腈、四氫呋喃、二甲基甲酰胺對標(biāo)準(zhǔn)品溶液的溶解效果。運(yùn)用GC-MS分析衍生后不同溶解劑溶解后的標(biāo)品，比較不同溶解劑溶解后樣品的出峰個數(shù)和峰面積。結(jié)果如圖1所示，不同溶解劑溶解后樣品的出峰個數(shù)和峰面積有不同程度的差異，其中四氫呋喃和乙腈效果相對較差，其他兩組效果較好，但二甲基二酰胺溶劑延遲較吡啶長，同時據(jù)文獻(xiàn)報道吡啶能溶解大部分非極性和極性的化合物［21］，因此在代謝組學(xué)文獻(xiàn)中吡啶被廣泛用于提取劑，綜合以上原因選擇吡啶為本實驗的提取劑。

2.2 不同的滅活劑對細(xì)胞滅活效率的影響

測定不同滅活溶液上清液中核酸和蛋白質(zhì)的滲出情況，核酸和蛋白質(zhì)分別在260 nm和280 nm處有特征吸收峰。此外，還測定了滅活后在水洗過程中代謝物的滲出情況。

圖2為不同淬滅劑條件下核酸和蛋白質(zhì)的滲漏情況，以間接反映代謝物的滲出情況。從圖中可以看出，100%甲醇作為淬滅劑時蛋白質(zhì)的滲出情況相對比較嚴(yán)重，證明其不適合作為淬滅劑使用；而采用其他3組淬滅劑使蛋白質(zhì)的滲出得到大幅改善。其中甲醇和氯化鈉組滅活后吸光度最低，表明代謝物滲出最少。同時利用監(jiān)控淬滅處理后細(xì)胞 OD 值的減少來反映整體細(xì)胞水平的細(xì)胞損傷，OD 回收率越大表明細(xì)胞受到的損傷越小。由圖3可知，60%甲醇/0.9%氯化鈉（-40℃）OD 回收率最大，結(jié)果表明低濃度的甲醇相對于高濃度的甲醇可以減輕細(xì)胞的損傷，同時加入鹽溶液可以明顯減輕細(xì)胞的損傷。

綜合上述兩個實驗結(jié)果表明使用有機(jī)溶劑對細(xì)胞滅活過程中有代謝物滲出，其原因可能是冷有機(jī)溶劑對細(xì)胞壁的冷沖擊作用對細(xì)胞壁有一定的破壞性，同時有機(jī)溶劑可以在一定程度上改變細(xì)胞膜的流動性，使得胞內(nèi)代謝物滲出胞外。60%甲醇/0.9% NaCl組相對于其他組分淬滅處理后的OD回收率最大，細(xì)胞完整性最好，并且代謝物滲出最少。綜上所述，選擇60%甲醇/0.9% NaCl為淬滅劑。

圖1 不同溶解劑對各種代謝物峰面積的影響

圖2 不同淬滅劑條件下胞內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的滲出分析

圖3 不同淬滅方法處理后的OD回收率

圖4 不同提取方法處理得到的胞內(nèi)代謝物水平

2.3 不同提取劑對代謝物提取效率的影響

在已鑒定代謝物中隨機(jī)選出部分氨基酸、有機(jī)酸、糖類等物質(zhì)進(jìn)行比較分析，結(jié)果（圖4）顯示，70%甲醇和甲醇/氯仿（1∶1）兩組提取效果較好，但由于氯仿具有一定的毒性，因此選擇70%甲醇為提取劑。

2.4 方法重復(fù)性的考察

平行制備出樣本4份，分別進(jìn)行GC-MS檢測。結(jié)果（表1）顯示，對4個平行樣品進(jìn)行相對定量計算后發(fā)現(xiàn)不同物質(zhì)的相對含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值均小于15%，因此該方法適用于代謝組學(xué)樣品的檢測和進(jìn)一步分析。

表1 各種代謝物的重復(fù)性檢測

3 討論

出芽短梗霉作為聚蘋果酸和普魯蘭多糖的生產(chǎn)菌株，傳統(tǒng)的發(fā)酵優(yōu)化手段已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代工業(yè)的要求，對菌株的定向改造進(jìn)一步提高產(chǎn)物產(chǎn)量降低副產(chǎn)物的產(chǎn)出的要求日益迫切。代謝組學(xué)作為一種系統(tǒng)的研究手段，在目的產(chǎn)物相關(guān)代謝物輪廓分析，代謝物合成途徑的發(fā)現(xiàn)中具有無與倫比的優(yōu)勢。近年來，對于微生物代謝組學(xué)的研究飛速發(fā)展，但尚無出芽短梗霉代謝組學(xué)研究方法的文獻(xiàn)報道，而現(xiàn)存的代謝物組學(xué)研究方法中沒有一種可以滿足所有微生物的研究。所以本研究對出芽短梗霉代謝物樣品制備過程進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。

預(yù)冷的有機(jī)溶劑在接觸細(xì)胞的瞬間就可以使細(xì)胞失去活性，很好的滿足了代謝組樣品制備快速滅活的要求，但是有機(jī)溶劑對于細(xì)胞膜的破壞和對細(xì)胞滲透壓的沖擊使得胞內(nèi)小分子代謝物容易滲出胞外，從而影響實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究比較了4種不同的滅活劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有機(jī)溶劑中加入適合濃度的鹽溶液可以很好的減少胞內(nèi)代謝物的滲出，60%甲醇/0.9% NaCl組代謝物滲出最少并且滅活后細(xì)胞完整性最好，最終選擇60%甲醇/0.9% NaCl為淬滅劑。代謝物組數(shù)據(jù)分析過程中，需要定性和定量盡可能多的物質(zhì)來全面的描述代謝途徑、代謝調(diào)節(jié)及描述機(jī)制。由于代謝物在不同的提取溶劑中的提取效率不同，本研究比較了 4 種提取溶劑的提取效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用70%甲醇提取的胞內(nèi)的代謝物質(zhì)最全面，而且提取含量最高。

4 結(jié)論

本研究以出芽短梗霉的代謝組為研究對象，比較了不同淬滅劑，提取劑和溶解劑條件下代謝物組的分析結(jié)果，最終確定了出芽短梗霉代謝物樣品制備的最適方法：采用60%甲醇/0.9% NaCl溶液淬滅、乙腈∶甲醇∶水（2∶2∶1）提取胞內(nèi)代謝物、含有甲氧基銨鹽酸鹽的吡啶溶液溶解凍干樣品、最后使用N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺對樣品進(jìn)行衍生化。采用本方法從出芽短梗霉中共檢測到300多種代謝物，經(jīng)鑒定包括大量的氨基酸有機(jī)酸和糖類物質(zhì)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of Sample Pretreatment Method for Metabolomics Studies of Aureobasidium pullulans Producing Polymalic Acid

FAN Xu-jia1BIAN Yan-hui1YIN Hai-song3，4QIAO Chang-sheng1，2
（1. Key Laboratory of Industrial Microbiology of Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457；2. Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co.，Ltd，Tianjin 300457；3. School of Biotechnology，Tianjin Modern Vocational Technology College，Tianjin 300350；4. Tianjin Research Institute of Light Industrial Chemistry，Tianjin 300350）

In order to acquire more accurate and complete intracellular metabolite information，and therefore to more realistically reflect the microbial intracellular metabolism，the systematic optimization of metabolomic sample preparation process was carried out from 3 aspects of quencher，extraction and solvent agent based on the GC-MS platform. The leakage of intracellular metabolites and cell injury with different quenchers was compared，and the results showed that 60% methanol/0.9% NaCl had the least leakage. The effects of extraction and solvent agent on relative abundance of metabolite distribution were investigated，and 60% methanol presented the significant extraction effect，and pyridine had the dissolving effect．The optimal sample pretreatment method for metabolomic analysis of Aureobasidium pullulans was determined as follows：pre-cooled 60% methanol/0.9% NaCl as quencher，ground in liquid nitrogen and repeated freezing and thawing for cell disruption，pre-cooled 60% methanol for the extraction of metabolites，and then the extracts were dissolved by pyridine and derivatized for 90 min under MSTFA at 40℃ . By using this optimized protocol，more than 300 kinds of metabolic components were identified by GCMS，including a large number of amino acids，organic acids and sugars. Thus our established method can be used to effectively analyze the A. pullulans metabolites.

metabolomics；Aureobasidium pullulans；GC-MS；pretreatment

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.06.009

2015-10-14

天津市科技支撐計劃重點項目（14ZCZDTG00025）

范栩嘉，男，碩士研究生，研究方向：生物化工；E-mail：gudusafa@163.com

喬長晟，男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn