Paenibacillus spp. BD3526發(fā)酵小麥麩皮生產(chǎn)凝乳酶

杭鋒，洪青，陶源，王欽博，劉振民，陳衛(wèi)*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫, 214122)　2(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

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Paenibacillusspp. BD3526發(fā)酵小麥麩皮生產(chǎn)凝乳酶

杭鋒1,2，洪青2，陶源1，王欽博2，劉振民2，陳衛(wèi)1*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫, 214122)2(乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海，200436)

摘要對(duì)Paenibacillus spp. BD3526凝乳酶的發(fā)酵條件和凝乳性能進(jìn)行了研究，探討了不同培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間、碳源、氮源和裝液量對(duì)凝乳酶活力和活菌數(shù)的影響，并與商業(yè)化的小牛皺胃酶、重組凝乳酶、Rhizomucor miehei來源凝乳酶進(jìn)行凝乳性能比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：發(fā)酵時(shí)間、碳源、氮源和裝液量對(duì)BD3526凝乳酶活力(milk-clotting activity, MCA)和蛋白水解活力(proteolytic activity, PA)均有不同程度的影響。選用小麥麩皮培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵至24 h時(shí)，MCA達(dá)到最大至3 279.76±67.11 SU/mL，凝乳性能強(qiáng)，PA值在整個(gè)發(fā)酵期間變化不大；添加碳源或氮源會(huì)不同程度地降低MCA值；裝液量為30 mL時(shí)，發(fā)酵上清液中菌體濃度最高、MCA達(dá)到6 000 SU/mL。與商業(yè)化的凝乳酶相比，BD3256凝乳酶在凝乳過程中未使凝乳塊產(chǎn)生過度水解，也無(wú)乳清析出現(xiàn)象，具有應(yīng)用到干酪生產(chǎn)中的潛力。

關(guān)鍵詞Paenibacillus spp.；凝乳酶；小麥麩皮；凝乳酶活力；蛋白酶活力

凝乳酶(milk-clotting enzyme, MCE)是制作干酪時(shí)凝固牛乳用的酶制劑，通過水解κ-酪蛋白中的Phe105-Met106肽鍵導(dǎo)致牛乳凝結(jié)[1]。傳統(tǒng)干酪加工中使用的凝乳酶是小牛皺胃酶，具有高凝乳酶活性與低蛋白水解活力的特性[2]。隨著世界干酪產(chǎn)業(yè)規(guī)模的不斷擴(kuò)大，小牛皺胃酶的供應(yīng)量已無(wú)法滿足干酪生產(chǎn)的需求。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在動(dòng)物、植物、基因工程及微生物四大方面進(jìn)行了大量研究，以尋找小牛皺胃酶的替代物。

微生物來源凝乳酶因生產(chǎn)成本低，具有更加廣泛的生化多樣性以及簡(jiǎn)便的基因改造方法，被認(rèn)為最有可能成為小牛皺胃酶替代物。目前研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)凝乳酶的微生物以真菌為主，如Rhizomucorspp.、Mucorspp.、Aspergillusspp.等，同時(shí)部分Bacillusspp.等細(xì)菌也能夠產(chǎn)凝乳酶[3-6]。然而，微生物凝乳酶通常具有較高的蛋白水解能力(proteolytic activity, PA)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解并轉(zhuǎn)化為乳清，對(duì)干酪得率具有負(fù)面作用，因此只有部分適于干酪生產(chǎn)[7]。如嗜熱菌Rhizomucormiehei產(chǎn)生的MCE的MCA/PA比值較小牛皺胃酶低，但PA和耐熱性較小牛皺胃酶強(qiáng)，導(dǎo)致了干酪得率降低，55 ℃熱處理30 min殘存PA達(dá)95%，成熟過程中對(duì)酪蛋白進(jìn)行非特異性水解，造成干酪苦味形成及質(zhì)構(gòu)缺陷；隨乳清排除的MCE對(duì)乳清蛋白也存在過度水解現(xiàn)象，降低了經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值。但也有研究發(fā)現(xiàn)，純化的真菌MCE與小牛凝乳酶混合物較單獨(dú)的小牛凝乳酶在干酪成熟和風(fēng)味形成具有優(yōu)勢(shì)。

目前，有關(guān)類芽孢桿菌(Paenibacillusspp.)產(chǎn)凝乳酶的研究報(bào)道較少，本文從西藏羌塘草原牧民牦牛乳中分離出1株P(guān)aenibacillusspp.BD3526，對(duì)其發(fā)酵小麥麩皮產(chǎn)凝乳酶的影響因素、凝乳活力、蛋白水解活力進(jìn)行研究，同時(shí)與商業(yè)化的小牛皺胃酶、重組凝乳酶、R.miehei來源凝乳酶的凝乳性能進(jìn)行了比較，為該菌所產(chǎn)凝乳酶在干酪生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

1.1.1菌株

Paenibacillusspp. BD3526(CGMCC No.8333=DSM No.28815)從西藏羌塘草原牦牛乳中分離。

1.1.2實(shí)驗(yàn)材料

小麥麩皮(蛋白質(zhì)18.6%，脂肪6.2%，總碳水化合物63.9%，水分7.89%，灰分3.38%)，購(gòu)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；脫脂乳粉(脂肪33.4%，脂肪0.8%，乳糖54.1%，礦物質(zhì)7.9%，水分3.8%)，新西蘭恒天然公司；干酪素，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；福林酚試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；小牛皺胃酶，阿敏生物；R.miehei來源凝乳酶Marzyme?150 MG，杜邦丹尼斯克；Aspergillusnigervar.awamori重組凝乳酶Chy-Max?，Chris Hansen；其他試劑均為分析純。

1.1.3培養(yǎng)基

脫脂乳培養(yǎng)基：配置100 g/L的脫脂乳溶液，經(jīng)充分溶解和水化后，于118 ℃滅菌15 min。

脫脂乳瓊脂培養(yǎng)基：150 g/L脫脂乳和1.67 g/L瓊脂溶液118 ℃各自滅菌15 min，冷卻至45 ℃后，脫脂乳和瓊脂溶液按1∶9的體積比無(wú)菌混勻并傾注平板。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH7.0。

TYC液體培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白胨15，蔗糖50，酵母膏5.0，L-胱氨酸0.2，乙酸鈉20，Na2SO40.1，NaCl 1.0，Na2HPO4·12H2O 2.0，NaHCO32.0，pH7.3。

30 g/L麩皮培養(yǎng)基：稱取1.5 g小麥麩皮至250 mL三角瓶中并加入50 mL去離子水(不同裝液量條件下小麥麩皮質(zhì)量按比例稱取)，121 ℃，滅菌20 min后配用。

1.1.4主要儀器

XB.K.25血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；HZQ-X500C搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴槽，英國(guó)Grant公司；Olympus BX60顯微鏡，日本Olympus公司；Specord 205分光光度計(jì)，德國(guó)耶拿公司；Sorvall Stratos臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1Paenibacillusspp. BD3526的保存與活化

Paenibacillusspp. BD3526原始菌株已提交中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC No.8333)和德國(guó)微生物菌種保藏中心保藏(DSM No.28815)，實(shí)驗(yàn)室采用凍干脫脂乳管保存于-80 ℃；原始菌株使用前采用脫脂乳培養(yǎng)基活化2次，BD3526接種于脫脂乳中30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)20 h作為種子液備用。

1.2.2Paenibacillusspp. BD3526培養(yǎng)方法

配置30 g/L的小麥麩皮為產(chǎn)酶培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝樣分別為20、30、40、50和60 mL，接種體積分?jǐn)?shù)3%的種子液，30 ℃、180 r/min條件培養(yǎng)48 h，分別測(cè)定0、3、6、9、12、15、18、24、36和48 h發(fā)酵液中活菌數(shù)、發(fā)酵上清凝乳酶活力和蛋白酶活力。

1.2.3碳源和氮源對(duì)凝乳酶活力的影響

以30 g/L的小麥麩皮為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加5 g/L的葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽糊精和可溶性淀粉；分別添加3 g/L的胰蛋白胨、酵母抽提物、酪蛋白水解物、酪蛋白胨、豆粕、尿素、玉米漿、糖蜜、(NH4)2SO4、KNO3，并以未添加碳源的麩皮培養(yǎng)基作為對(duì)照。250 mL三角瓶裝樣50 mL，接種量為3%，30 ℃、180 r/min條件培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵上清MCA。

1.2.4凝乳酶活力的測(cè)定

采用Arima方法進(jìn)行凝乳酶活力測(cè)定[8]。配置100 g/L含有0.01 mol/L的CaCl2脫脂乳，充分水化后用1 mol/L的HCl調(diào)節(jié)至pH 6.0。取10 mL脫脂乳溶液于試管中并在35 ℃水浴中孵育10 min，將0.5 mL未稀釋或采用0.05 mol/L、pH 6.0的PBS稀釋一定倍數(shù)的發(fā)酵上清加入至35 ℃的脫脂乳中，每15 s將樣品取出并傾斜45°觀察樣品組織狀態(tài)，以形成不連續(xù)顆粒的時(shí)間計(jì)作凝乳時(shí)間。1個(gè)凝乳酶單位(SU)定義為：35 ℃條件下，使1 mL脫脂乳在40 min發(fā)生凝乳所需酶量[9]，并按照公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：T，凝乳時(shí)間，s；VS，底物體積，mL；VE，酶液體積，mL；D，稀釋倍率。

1.2.5蛋白酶活力的測(cè)定

以酪蛋白為底物，采用Folin-Ciocalteu phenol方法進(jìn)行蛋白水解活力測(cè)定。將0.5 mL未稀釋或經(jīng)一定倍數(shù)稀釋的發(fā)酵上清加至2.5 mL 12 g/L的酪蛋白溶液中(用0.05 mol/L pH 6.0的PBS配置)，混合均勻并在35 ℃水浴10 min后，加入2.5 mL 0.44 mol/L TCA終止反應(yīng)，于4 ℃、10 000×g離心5 min取上清。取1 mL上清液加入2.5 mL(0.28 mol/L)的NaOH溶液和按1∶1比例稀釋0.75 mL的Folin-Ciocalteu phenol試劑，35 ℃水浴孵育15 min后，測(cè)定A660 nm[10]。配置100 μg/mL的酪氨酸溶液，分別測(cè)定0，20，40，60，80和100 μg/mL酪氨酸溶液的A660 nm，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。1個(gè)蛋白水解活力定義為1 min釋放1 μmol/mL酪氨酸所需的酶量。

1.2.6活菌數(shù)的測(cè)定

種子液與發(fā)酵液中菌體濃度采用血球板計(jì)數(shù)法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7Paenibacillusspp. BD3526 凝乳酶與商業(yè)化凝乳酶的比較

分別將商業(yè)化的小牛皺胃酶、重組凝乳酶、R.miehei來源凝乳酶配置成160 SU/mL的酶液，將BD3526發(fā)酵上清液稀釋至160 SU/mL，按照方法1.2.4凝乳并將凝乳時(shí)間控制在10 min，并在10，20，40，60，90 min觀察其組織狀態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1BD3526產(chǎn)酶培養(yǎng)基的篩選

以脫脂乳平板法(菌落周圍形成酪蛋白水解圈和沉淀圈)從西藏羌塘草原采集的牦牛乳中篩選得到1株具有產(chǎn)凝乳酶潛質(zhì)的細(xì)菌，經(jīng)生理生化、細(xì)胞脂肪酸組成、G+C含量、同源雜交(數(shù)據(jù)未公布)和16S rRNA等方法進(jìn)行鑒定，確定該菌株屬Paenibacillusspp.，命名為Paenibacillusspp. BD3526。其16S rRNA序列已提交GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/758205658，編號(hào)：KM978955.1)。

將BD 3526于LB、TYC、100 g/L脫脂乳和30 g/L小麥麩皮培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，上清液中MCA分別為8.30±0.81、9.21±0.75、274.28±3.29和2483.17±68.35 SU/mL。小麥麩皮是微生物發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶理想的培養(yǎng)基質(zhì)，且發(fā)酵生產(chǎn)的凝乳酶具有最高的MCA/PA[11,12]，為此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)過程中均采用小麥麩皮作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基。

2.2BD3526凝乳酶的凝乳性能

將種子液(約5×108CFU/mL)按體積分?jǐn)?shù)3%接種至30 g/L的小麥麩皮培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，發(fā)酵上清中的MCA達(dá)到2483.17±68.35 SU/mL，具有較高的凝乳酶活力和良好的凝乳特性(圖1)。

圖1　BD 3526于30 g/L小麥麩皮培養(yǎng)基發(fā)酵上清凝乳效果Fig.1　Skim milk clotted by the supernant of BD 3526 clutivated in 30 g/L wheat bran broth(注：未添加凝乳酶的脫脂乳為空白對(duì)照)

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BD3526凝乳酶在干酪制作中的應(yīng)用潛力，考察是否存在過度水解的問題，比較了BD3526凝乳酶(發(fā)酵上清)與商業(yè)化凝乳酶添加至脫脂中10，20，40，60和90 min后凝乳組織狀態(tài)(圖2)。

1-小牛皺胃酶；2-重組凝乳酶；3-R.miehei來源凝乳酶；4-BD3526發(fā)酵上清液圖2　BD 3526凝乳酶與商業(yè)化凝乳酶凝乳效果比較Fig.2　Comparison of the protein hydrolysis between BD3526 milk-clotting enzyme (MCE) and commercial coagulants(注：0.5 mL凝乳酶(160 SU/mL)添加至10 mL 100 g/L脫脂乳中10 min(A)、40 min(B)、60 min(C)和90 min(D)后的凝乳狀態(tài))

不同來源的凝乳酶(160 SU/mL)添加至脫脂乳10 min(圖2，A)和40 min(圖2，B)后，凝乳組織狀態(tài)良好，未發(fā)生酪蛋白水解和乳清析出的現(xiàn)象；60 min時(shí)(圖2，C)，R.miehei和BD3526凝乳酶組的凝乳已發(fā)生較為顯著的酪蛋白水解和乳清析出的現(xiàn)象；90 min時(shí)(圖2，D)，所有凝乳均發(fā)生了酪蛋白水解的現(xiàn)象，R.miehei和BD3526凝乳酶組的酪蛋白水解和乳清析出的程度較小牛皺胃酶和重組凝乳酶組更強(qiáng)一些。為了避免酪蛋白和乳清蛋白發(fā)生過度水解，干酪生產(chǎn)過程中凝乳時(shí)間一般控制在40 min左右，本實(shí)驗(yàn)中凝乳酶活力較實(shí)際生產(chǎn)中提高了4倍，在40 min時(shí)BD3526凝乳酶與商業(yè)化凝乳酶相比未使凝乳發(fā)生過度水解和乳清析出的現(xiàn)象，說明該菌株來源的凝乳酶具有較低的PA。

2.3發(fā)酵過程中菌體濃度和酶活變化

為確定BD3526在小麥麩皮培養(yǎng)基中MCA、PA與菌體濃度的關(guān)系，在30 ℃、180 r/min搖床發(fā)酵條件下，分別測(cè)定了其在30 g/L小麥麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)0，3，6，9，12，15，18，24，36和48 h的發(fā)酵液中菌體濃度和發(fā)酵上清的MCA、PA(圖3)。發(fā)酵上清液中蛋白水解活力采用福林-酚法測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.700 82x+0.015 90(R2=0.999 49)。

■菌體濃度；●MCA；◆PA圖3　發(fā)酵過程中菌體濃度和酶活變化Fig.3　Biomass, MCA and PA during the fermentation

由圖3可見，BD3526接種至麩皮培養(yǎng)基中0～3 h為延滯期，此后進(jìn)入了生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，15 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h則進(jìn)入衰亡期；而發(fā)酵上清中的MCA和PA從9 h開始迅速增加，MCA至24 h達(dá)到最大值(3 279.76±67.11 SU/mL)，此后呈逐漸下降的趨勢(shì)；而PA的變化趨勢(shì)亦與MCA相似，但較為穩(wěn)定，因此，作為凝乳酶重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一的MCA/PA則主要由MCA決定，并在24 h達(dá)到最大值(表1)。微生物蛋白酶往往由于氮源和碳源的脅迫作用在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期產(chǎn)生[13]，發(fā)酵上清從9 h開始具有MCA并在24 h時(shí)達(dá)到最大，說明BD3526凝乳酶是在對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期后期分泌表達(dá)的。

表1　發(fā)酵過程中凝乳酶活力和蛋白水解能力的變化

2.4碳源對(duì)發(fā)酵上清液MCA的影響

不同碳源對(duì)發(fā)酵上清MCA的影響如圖4所示，添加5 g/L的葡萄糖組、乳糖組和麥芽糖組發(fā)酵上清中的MCA顯著低于對(duì)照組；蔗糖組、麥芽糊精組和可溶性淀粉組發(fā)酵上清中的MCA與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。在補(bǔ)充葡萄糖、乳糖和麥芽糖的發(fā)酵上清中的MCA均顯著降低，且各組菌體濃度較對(duì)照組低(數(shù)據(jù)未給出)，酶活高低與菌體濃度有一定的相關(guān)性，這可能是由于該菌在補(bǔ)充碳源的情況下不存在碳源脅迫的情況，菌體快速增殖而酶產(chǎn)量降低了，這一現(xiàn)象與M.miehei[14-15]和M.circinelloides[16]在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的條件下，凝乳酶產(chǎn)量降低相似。

Glu-葡萄糖; Lac-乳糖; Suc-蔗糖; Mal-麥芽糖; MD-麥芽糖糊精; SS-可溶性淀粉圖4　碳源對(duì)發(fā)酵上清液凝乳酶活力的影響Fig.4　Effects of carbon sources on MCA in the supernatants(**-P<0.01)

2.5氮源對(duì)發(fā)酵上清MCA的影響

不同氮源添加對(duì)發(fā)酵上清MCA的影響如圖5所示。BD3526在補(bǔ)充氮源的麩皮培養(yǎng)基中發(fā)酵上清的MCA活力均顯著低于空白組(P<0.01)，其中，尿素組和KNO3組的發(fā)酵上清中的MCA僅為71.14±9.90 SU/mL和41.01±2.11 SU/mL?；诿笇W(xué)的結(jié)構(gòu)特性，微生物凝乳酶應(yīng)當(dāng)在蛋白類物質(zhì)存在的條件下更利于合成，如足夠蛋白質(zhì)作為氮源補(bǔ)充可促進(jìn)A.nigerLBA02在最初48 h發(fā)酵過程中MCE產(chǎn)量[12]。然而BD3526在有限的氮源的條件下卻更利于合成微生物凝乳酶，補(bǔ)充無(wú)機(jī)和有機(jī)氮源均會(huì)顯著抑制酶產(chǎn)量。該特性與B.subtilisnatto和Mucormiehei在補(bǔ)充無(wú)機(jī)氮源MCE產(chǎn)量顯著降低的現(xiàn)象類似[10, 17]，但與Mucormiehei選取小麥麩皮、小麥面粉和脫脂乳[17]，Mucorbaciliformis選取小麥麩皮[18]作為有機(jī)氮源的條件下MCE產(chǎn)量提高不同。Penicilliumoxalicum[19]和Aspergillusversicolo[10]在添加酵母抽提物和蛋白胨或烘焙酵母作為氮源有利于MCE的合成，而玉米漿和豆粕均不利于P.oxalicumMCE產(chǎn)量的提高；以酪蛋白為補(bǔ)充氮源對(duì)T.indicae-seudaticaeN31的凝乳酶產(chǎn)量無(wú)影響[11,20]。

通過對(duì)生長(zhǎng)曲線的比較發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充氮源組(除尿素組和KNO3組)的活菌數(shù)的增殖速度在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期較空白組略快，但至穩(wěn)定期時(shí)的菌體較空白組低，如24 h空白組菌體濃度為9.25×108CFU/mL，硫酸銨組為7.42×108CFU/mL；KNO3組(3.68×108CFU/mL)和尿素組(2.48×108CFU/mL)的菌體濃度均顯著低于較空白組，可能是硝酸鹽代謝產(chǎn)生的亞硝酸鹽對(duì)菌體生產(chǎn)具有抑制作用(BD3526硝酸鹽還原能力為(+))，而脲酶(-)可能導(dǎo)致尿素對(duì)菌體生長(zhǎng)具有抑制作用。

2.6搖瓶裝液量對(duì)菌體濃度和酶活的影響

搖瓶培養(yǎng)中的氧傳遞系數(shù)(KLa)隨著裝液量的增加而降低、轉(zhuǎn)速的提高而增加[21]。為了考察培養(yǎng)基中的溶解氧對(duì)菌體增殖和發(fā)酵上清中的MCA和PA的影響，將250 mL三角瓶的裝液量由60 mL逐漸降低至20 mL(麩皮培養(yǎng)基濃度為30 g/L)，考察了30 °C和180 r/min的培養(yǎng)24 h后，各組發(fā)酵液中菌體濃度以及發(fā)酵上清中的MCA和PA(圖6)。

圖6　搖瓶裝液量對(duì)菌體濃度和酶活的影響Fig.6　Effect of liquid volume on biomass mass concentration, MCA and PA

由圖6可知，裝液量對(duì)24 h發(fā)酵液中菌體濃度、MCA和PA均有顯著的影響，其中，30 mL裝液量時(shí)，發(fā)酵液中的菌體濃度最高(1.10×109CFU/mL)，此時(shí)的MCA和PA均具有最高值；隨著裝液量的提高，發(fā)酵液中菌體濃度呈逐漸下降的趨勢(shì)，MCA和PA也呈下降趨勢(shì)，MCA降低則更為顯著：由6 000 SU/mL(裝液量30 mL)降低至3 000 SU/mL(裝液量60 mL)；由此，可以推測(cè)裝液量的減少增加了培養(yǎng)基中溶氧水平，促進(jìn)了BD3526增殖，進(jìn)而增加了MCA和PA的表達(dá)。但裝液量為20 mL時(shí)，此時(shí)菌體濃度為各組最低(6.0×108CFU/mL)，而此時(shí)的MCA和PA僅較30 mL組略低，這可能是此時(shí)剪切力較大導(dǎo)致細(xì)胞的破裂和胞內(nèi)目標(biāo)蛋白酶的釋放所致。

3結(jié)論

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)類芽孢桿菌(Paenibacillusspp.)產(chǎn)凝乳酶的研究報(bào)道還較少，本研究考察了Paenibacillusspp. BD3526生產(chǎn)凝乳酶的培養(yǎng)介質(zhì)，對(duì)其發(fā)酵小麥麩皮產(chǎn)凝乳酶的影響因素(發(fā)酵時(shí)間、碳氮源和裝液量)、凝乳活力、蛋白水解活力進(jìn)行研究，同時(shí)與商業(yè)化小牛皺胃酶、重組凝乳酶、R.miehei來源凝乳酶的凝乳性能進(jìn)行了比較，結(jié)論如下：

(1)Paenibacillusspp. BD3526在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)凝乳酶差異顯著，小麥麩皮是該菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶理想的培養(yǎng)基質(zhì)。整個(gè)發(fā)酵期間，上清中酶活隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，在24 h具有最高的MCA，但PA變化不大。

(2)發(fā)酵時(shí)間和碳、氮源能夠影響B(tài)D3526產(chǎn)酶能力，補(bǔ)充碳源或氮源會(huì)不同程度的降低MCA。

(3)提高溶氧水平有利于菌體生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)量。裝液量30 mL時(shí)，上清發(fā)酵液中MCA和PA均達(dá)到最大，裝液量的增加會(huì)降低溶解氧水平，進(jìn)而導(dǎo)致菌體濃度和MCA的顯著下降。

(4)與商業(yè)化凝乳酶相比，BD3256凝乳酶具有較高的MCA/PA值和良好的凝乳特性，凝乳過程中未出現(xiàn)凝乳過度水解和乳清析出的現(xiàn)象，具有很高的應(yīng)用潛力。

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Study on milk-clotting enzyme produced byPaenibacillusspp. BD3526 in wheat bran broth

HANG Feng1,2，HONG Qing2，TAO Yuan1，WANG Qin-bo2，LIU Zhen-min2，CHEN Wei1

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2(State Key Laboratory of Dairy Biotechnology, Dairy Research Institute, Bright Dairy and Food Co., Ltd., Shanghai 200436,China)

ABSTRACTProteinase with milk-clotting activity (MCA) produced by Paenibacillus spp. BD3526 in fermented wheat bran broth were studied. The effects of different mediums, fermentation time, carbo sources, nitrogen sources and liquid volume in flask on MCA and proteolytic activity (PA) were discussed in this paper. The results indicated that MCA reached 3279.76±67.11 SU/mL and showed excellent coagulation property after fermentation in wheat bran broth for 24 hours. Addition of carbo source and nitrogen source would reduce MCA. The biomass, MCA and PA reached maximum when liquid volume in flask was 30 mL. No excessive hydrolysis of curds and whey syneresis were found after 40 minutes of coagulation of curd with BD3526 enzyme in comparison with the commercial coagulants, which suggested that it would have a great potential application in the cheese production.

Key wordsPaenibacillus spp.；coagulant；wheat bran；milk-clotting activity(MCA); proteolytic activity; PA

收稿日期：2015-08-03，改回日期：2015-09-14

基金項(xiàng)目：上海市科委啟明星人才計(jì)劃(14QB1400200)；國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃(2013BAD18B02)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601007

第一作者：博士研究生，高級(jí)工程師(陳衛(wèi)教授為通訊作者，E-mail:chenwei66@jiangnan.edu.cn)