堿性成纖維細(xì)胞生長因子-殼聚糖載體誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的機制

段紅梅，王聰，楊朝陽，，郝鵬，尚俊奎，李曉光，

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堿性成纖維細(xì)胞生長因子-殼聚糖載體誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的機制

段紅梅1，王聰2，楊朝陽1，2，郝鵬2，尚俊奎2，李曉光1，2

［摘要］目的探討堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）-殼聚糖載體誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞高比例向神經(jīng)元分化的潛在機制。方法純化后神經(jīng)干細(xì)胞分別與單純殼聚糖、可溶性bFGF和bFGF-殼聚糖載體共培養(yǎng)。在共培養(yǎng)3 h、24 h、3 d和7 d后，Nestin、β-Ⅲtubulin、微管相關(guān)蛋白2（MAP2）和成纖維細(xì)胞生長因子受體1（FGFR1）的免疫熒光雙標(biāo)記觀察受體的表達(dá)情況；實時熒光定量PCR （qRT-PCR）及Western blotting分別檢測不同時間點神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)后相關(guān)基因的RNA水平變化。結(jié)果誘導(dǎo)后3 h，F(xiàn)GFR1的表達(dá)量在三組中無明顯差異；誘導(dǎo)后24 h，bFGF-殼聚糖載體組FGFR1的表達(dá)量顯著高于單純殼聚糖組和可溶性bFGF組（P＜0.001）；誘導(dǎo)后3 d和7 d，F(xiàn)GFR1的表達(dá)量在單純殼聚糖組和可溶性bFGF組顯著減少（P＜0.001），而在bFGF-殼聚糖載體組仍維持較高水平；qPT-PCR及Western blotting結(jié)果顯示，bFGF-殼聚糖載體組中與Erk/MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著高于單純殼聚糖組和可溶性bFGF組（P＜0.001）。結(jié)論bFGF-殼聚糖載體通過緩釋bFGF，可能上調(diào)FGFR1的表達(dá)，進(jìn)而激活Erk/MAPK信號通路，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元的分化。

［關(guān)鍵詞］堿性成纖維細(xì)胞生長因子；殼聚糖；神經(jīng)元；神經(jīng)干細(xì)胞；分化；大鼠

［本文著錄格式］段紅梅，王聰，楊朝陽，等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子-殼聚糖載體誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的機制［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（5）:528-534.

作者單位：1.北京航空航天大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，北京市100191；2.首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京市100069。

CITED AS:Duan HM，Wang C，Yang ZY，et al.Mechanism of basic fibroblast growth factor-chitosan carrier inducing neural stem cells to differentiate into neurons［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（5）:528-534.

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是來源于神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞群落［1］，最初由Reynolds和Richards于1992年從成年鼠的紋狀體和海馬中分離得到。Gage曾將NSCs的特性概括為：可以生成神經(jīng)組織，或者來源于神經(jīng)系統(tǒng)；具有自我更新能力；通過不對稱分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞［2］。后來的研究表明，成年動物內(nèi)源性NSCs主要存在于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層［3］（subgranular zone，SGZ）、側(cè)腦室下區(qū)［4］（subventricle zone，SVZ）、脊髓中央管室管膜區(qū)［5］（central canal，CC）。

許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如腦［6］、脊髓損傷［7］、腦卒中［8］和神經(jīng)退行性疾病［9］等，通過將NSCs移植入受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以使受損組織的結(jié)構(gòu)和功能得到恢復(fù)［10-12］。因此，NSCs的誘導(dǎo)分化研究成為近年來研究的熱點。

先前的研究表明，通過向培養(yǎng)基內(nèi)添加胎牛血清［13］、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)素3等神經(jīng)營養(yǎng)因子［14］，可以激活神經(jīng)發(fā)生相關(guān)信號通路，誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化。同時，我們先前的研究也證實，bFGF-殼聚糖載體可以誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化，并形成功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［15］。但關(guān)于其誘導(dǎo)分化的機制研究較少。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），即FGF-2，是成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）家族的一員，具有促進(jìn)神經(jīng)組織生長發(fā)育、血管生成、創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)等作用［16-17］。關(guān)于bFGF的受體（fibroblast growth factor receptor，F(xiàn)GFR），到目前為止被確認(rèn)的有5種［18］。bFGF與細(xì)胞膜上的FGFR結(jié)合，使FGFR變成二聚體，催化自身的磷酸化，進(jìn)而使bFGF的受體激活，將胞外信號傳遞至胞內(nèi)，激活絲裂原活化蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases/mitogen activated protein kinase，Erk/MAPK）信號通路，實現(xiàn)將胞外信息傳遞至胞內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用［17］。Erk、c-jun、c-fos 為Erk/MAPK信號通路中的關(guān)鍵因子。Erk1/2平時位于胞漿內(nèi)，一旦被激活，則迅速穿過核膜，磷酸化下游多種核轉(zhuǎn)錄因子如Erk-1、c-Myc等，間接激活jun和fos［19］。

本實驗利用免疫熒光染色和qRT-PCR技術(shù)探索bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元分化的潛在機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組

40只新生24 h Wistar大鼠，SPF級，首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，許可證號：SYXK（京）2013-0004。

1.2實驗方法

1.2.1 NSCs的分離培養(yǎng)

新生24 h Wistar大鼠，冰凍麻醉，75A酒精消毒，于超凈臺取出脊髓，置D-hanks液（GIBCO）中清洗3次。解剖顯微鏡（OLYMPUS）下剝離硬脊膜，剪碎脊髓，吸管輕輕吹打為單細(xì)胞懸液，以1×105細(xì)胞/cm2的濃度種植于含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（COSTAR）內(nèi)。培養(yǎng)基成分（體積比）：96.8A DMEM/F12（GIBCO）、2A B27（INVITROGEN）、0.1A bFGF（20 ng/ml，SIGMA）、0.1A EGF（20 ng/ml，SIGMA）和1A青鏈霉素（SIGMA）。細(xì)胞置5A CO2培養(yǎng)箱（SANYO）中37℃培養(yǎng)。每3天半量換液1次。細(xì)胞懸液1000 r/min離心5 min，棄1/2培養(yǎng)基，細(xì)胞沉淀吹打混勻，加入等量新鮮培養(yǎng)基。1周左右形成NSCs球傳代。P3-P4時，相差倒置顯微鏡（B1X71，OLYMPUS）下觀察NSCs形態(tài)。

1.2.2NSCs的誘導(dǎo)分化

取P3-P4神經(jīng)球，以350球/cm2的密度種植于包被有左旋多聚賴氨酸（SIGMA）的蓋玻片上。單純殼聚糖組向培養(yǎng)基中加入10 mg/ml殼聚糖（SIGMA），可溶性bFGF組向培養(yǎng)基中加入20 ng/ml bFGF（SIGMA），bFGF-殼聚糖載體組向培養(yǎng)基中加入10 mg/ml bFGF-殼聚糖載體。每3天半量換液1次。

1.2.3免疫熒光

在誘導(dǎo)后3 h、24 h，分別行Nestin/FGFR1的免疫雙標(biāo)染色；誘導(dǎo)后3 d，Tuj1/FGFR1的免疫雙標(biāo)染色；誘導(dǎo)后7 d，MAP2/FGFR1的免疫雙標(biāo)染色。

免疫熒光染色的過程如下：4A多聚甲醛4℃固定40 min，0.3A TritonX-100破膜5 min，1A NGS室溫封閉30 min，加入相應(yīng)一抗，37℃孵育2 h，加入Al-exa594和Alexa488標(biāo)記的山羊抗小鼠或兔的熒光二抗（1∶300，INVITROGEN），37℃避光孵育1 h，Hoechst 33342（1∶1500，SIGMA）復(fù)染核，50A PB甘油封片，激光共聚焦掃描顯微鏡（SP8，LEICA）下觀察照相。

該部分實驗涉及的一抗和稀釋比例如下：兔來源FGFR1（1∶100），小鼠來源Nestin（1∶100），小鼠來源Tuj1（1∶150），小鼠來源MAP2（1∶150）。

1.2.4圖像分析

參考先前發(fā)表的計算受體數(shù)量的方法，并對其進(jìn)行改進(jìn)［20］。用Image-Pro Plus 6.1軟件計算各時間點受體的表達(dá)量。

1.2.5qRT-PCR

1.2.5.1RNA提取及cDNA合成

在誘導(dǎo)3 h、24 h、3 d和7 d時，分別收集三種誘導(dǎo)條件下的細(xì)胞，5×109細(xì)胞量加1 ml Trizol充分混勻，室溫靜置5 min；每加1 ml Trizol需加0.2 ml氯仿，輕輕振蕩15 s，室溫放置15 min；12000 g/min，4℃，離心15 min；吸取上清液，加入等體積異丙醇，12000 g/min，4℃，離心10 min，棄上清，見白色沉淀；加入1 ml 70A乙醇輕輕洗滌沉淀，12000 g/ min，4℃，離心5 min，棄上清，盡量吸干液體；吹干；加入RNase free water，溶解RNA 10 min。利用NANODROP 2000測量RNA濃度，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。具體反轉(zhuǎn)錄體系如下：1 μg RNA，1 μg Anchored Oligo（dT）Primer，10 μl 2×TS Reaction Mix，1 μg Enzyme Mix，gDNARemovergDNA Remover，6 μl RNase-free Water。

1.2.5.2引物設(shè)計及qRT-PCR

從NCBI-Gene Bank中查找cDNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由上海生工股份有限公司進(jìn)行引物合成，具體引物序列見表1。qRT-PCR選用Roche Lightcycler 480系統(tǒng)，依次經(jīng)過95℃，5 min，預(yù)變性；95℃，10 s，變性；59℃，55 s，退火延伸；共進(jìn)行40循環(huán)。具體反應(yīng)體系如下：1 μl PCR上游引物，1 μl PCR下游引物，10 μl Lightcycler 480 SYBR Green I Master，1 μl cDNAs，1 μl ddH2O。

1.2.6Western blotting

分別收集三種誘導(dǎo)條件下各時間點的細(xì)胞，具體實驗步驟參考先前發(fā)表的文章［21］。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

表1　用于qRT-PCR分析的引物序列

2　結(jié)果

2.1免疫熒光染色

NSCs分別在單純殼聚糖、可溶性bFGF和bFGF-殼聚糖載體三種誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)后3 h，F(xiàn)GFR1的表達(dá)均維持較高水平，組間差異不明顯（圖1），此時，NSCs尚未從神經(jīng)球內(nèi)爬出，故無法統(tǒng)計單個細(xì)胞表達(dá)FGFR1的數(shù)量。

誘導(dǎo)后24 h，bFGF-殼聚糖載體組細(xì)胞膜上受體的數(shù)量顯著多于單純殼聚糖組和可溶性bFGF組（P＜0.001）。見圖2和圖5。

在誘導(dǎo)后3 d和7 d，單純殼聚糖組和可溶性bFGF組細(xì)胞膜上受體的數(shù)量顯著減少（P＜0.001），而bFGF-殼聚糖載體組細(xì)胞膜上受體的數(shù)量仍然維持在較高水平。見圖3、圖4、圖6和圖7。

圖1　NSCs誘導(dǎo)3 h后Nestin和FGFR1的表達(dá)（免疫熒光染色）

圖2　NSCs誘導(dǎo)24 h后Nestin和FGFR1的表達(dá)（免疫熒光染色）

圖3　NSCs誘導(dǎo)3 d后Tuj1和FGFR1的表達(dá)（免疫熒光染色）

圖4　NSCs誘導(dǎo)7 d后MAP2和FGFR1的表達(dá)（免疫熒光染色）

圖5　NSCs誘導(dǎo)24 h后FGFR的數(shù)量

圖6　NSCs誘導(dǎo)3 d后FGFR的數(shù)量

2.2qRT-PCR及Western blotting

在三種誘導(dǎo)條件下，隨著誘導(dǎo)時間的不斷延長，在bFGF-殼聚糖載體組中FGFR1及Erk/MAPK信號通路關(guān)鍵因子Erk、c-jun、c-fos的表達(dá)量顯著高于其他兩組（P＜0.001）。見圖8和圖9。

圖9　Western blotting檢測NSCs分化過程中關(guān)鍵因子蛋白水平的變化

3　討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)和再生一直是難以攻克的世界難題。將NSCs移植入損傷區(qū)來修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷成為近年來研究的熱點。我們實驗室建立了一個體外NSCs誘導(dǎo)分化模型，通過向純化的NSCs中加入適量的bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)其分化為多種神經(jīng)細(xì)胞，如神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，并且分化為神經(jīng)元比例較高。

殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，其具有良好的生物相容性和可降解性，因此將殼聚糖作為藥物緩釋系統(tǒng)具有極大的優(yōu)勢［22-23］。bFGF-殼聚糖載體對bFGF具有緩釋作用，能夠長時間緩慢釋放bFGF［24］。而單純bFGF的半衰期較短［25］，僅9～10 min，單獨存在易被降解。因此我們實驗室采用bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化。

本研究形態(tài)學(xué)的結(jié)果表明，bFGF-殼聚糖載體通過緩慢釋放的bFGF長時程激活細(xì)胞表面的FGFR，使細(xì)胞持續(xù)表達(dá)FGFR，并維持在較高水平。這可能是bFGF-殼聚糖載體誘導(dǎo)NSCs高比例向神經(jīng)元分化的主要機制。qRT-PCR及Western blotting的結(jié)果進(jìn)一步驗證形態(tài)學(xué)的結(jié)果，同時證明bFGF-殼聚糖載體可能通過活化Erk1/2-MAPK信號通路，上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子Erk、c-fos和c-jun，啟動細(xì)胞的增殖、分化。

綜上所述，干細(xì)胞的移植治療是目前研究的熱點。我們自發(fā)研制的bFGF-殼聚糖載體，通過緩釋bFGF誘導(dǎo)NSCs表面的FGFR1數(shù)量增加，可能會上調(diào)Erk/MAPK信號通路，來完成NSCs高比例向神經(jīng)元的分化過程。這將為NSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供新的思路。

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Mechanism of Basic Fibroblast Growth Factor-chitosan Carrier Inducing Neural Stem Cells to Differentiate into Neurons

DUAN Hong-mei1，WANG Cong2，YANG Zhao-yang1，2，HAO Peng2，SHANG Jun-kui2，LI Xiao-guang1，2
1.Department of Biomedical Engineering，School of Biological Science and Medical Engineering，Beihang University，Beijing 100191，China；2.Department of Neurobiology，Capital Medical University，Beijing 100069，China

Correspondence to LI Xiao-guang.E-mail:lxgchina@sina.com

Abstract：Objective To investigate the potential mechanism of basic fibroblast growth factor（bFGF）-chitosan carrier to induce neural stem cells to differentiate into neurons.Methods After purification，the neural stem cells were cocultured with chitosan，soluble bFGF and bFGF-chitosan carrier.Three hours，twenty-four hours，three days and seven days after induction，immunofluorescence staining of Nestin，beta tubulin III，microtubule-associated protein-2（MAP2），and fibroblast growth factor receptor 1（FGFR1）were used to observe the expression of FGFR1；real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）and Western blotting were used to detect RNA and protein level changes after induction.Results Three hours after induction，there was no significant difference in the expression of FGFR1 among three groups.Twenty-four hours after induction，the expression level of FGFR1 was significantly higher in the bFGF-chitosan carrier group than in the chitosan group and the soluble bFGF group（P＜0.001）；three days and seven days after induction，the expression of FGFR1 decreased significantly in the chitosan group and soluble bFGF group（P＜0.001），however，it was still higher in the bFGF-chitosan carrier group；moreover，the expression of genes associated with the pathway of extracellular regulated protein kinases/mitogen activated protein kinase（Erk/MAPK）was significantly higher in the bFGF-chitosan carrier group than in the chitosan group and soluble bFGF group（P＜0.001）.Conclusion bFGF-chitosan carrier might upregulate the expression of FGFR1，then activate Erk/MAPK signal pathways，and finally promote the differentiation of neural stem cells into neurons.

Key words:basic fibroblast growth factor；chitosan；neuron；neural stem cell；differentiation；rats

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.05.009

［中圖分類號］R318.5

［文獻(xiàn)標(biāo)識碼］A

［文章編號］1006-9771（2016）05-0528-07

基金項目：1.國家“863”計劃項目（No.2012AA020506）；2.國家自然科學(xué)基金面上項目（No.31271037）；3.國家自然科學(xué)基金國際合作與交流項目（No.31320103903）；4.“十二五”國家科技支撐計劃項目（No.2012BAI17B04）；5.高等學(xué)校全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項資金資助項目（No.201356）；6.國家國際科技合作專項項目（No.2014DFA30640）；7.國家自然科學(xué)基金委員會資助項目（No.31130022）。

作者簡介：段紅梅（1983-），女，河南駐馬店市人，博士研究生，主要研究方向：生物材料在細(xì)胞誘導(dǎo)及脊髓損傷修復(fù)過程中的作用。通訊作者：李曉光（1959-），男，吉林長春市人，博士，教授，主要研究方向：應(yīng)用組織工程學(xué)的方法修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。E-mail:lxgchina@sina.com。

收稿日期：（2016-03-28修回日期：2016-04-26）