山菠菜多糖對長時間大強度運動大鼠鐵代謝的影響及分子機制研究

曲 申，鄒曉峰，劉英偉

（吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林長春130024）

山菠菜多糖對長時間大強度運動大鼠鐵代謝的影響及分子機制研究

曲 申，鄒曉峰，劉英偉

（吉林大學(xué)體育學(xué)院，吉林長春130024）

為了探討補充山菠菜多糖對長時間大強度運動大鼠鐵代謝的影響及可能的分子機制，選取30只SD大鼠分為對照組（C組）、運動組（E組）和運動＋干預(yù)組（EI組），利用跑臺運動構(gòu)建長時間大強度運動大鼠模型。從跑臺運動第3周起，大鼠用100 mg／kg的山菠菜提取物懸濁液每天灌服2 m l，灌服3周后測定其血清Hepcidin、TF和鐵狀態(tài)，實時熒光定量PCR技術(shù)檢測肝臟組織中TGF-β1、BMP-2和Smad4基因表達，Western blot法檢測肝臟組織中IL蛋白和JAK／STAT信號通路蛋白表達。結(jié)果：與E組相比，補充山菠菜多糖能夠有效降低血清Hepcidin和TF，改善機體鐵缺乏狀態(tài)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），補充山菠菜多糖可有效抑制TGF-β1／BMP／Smad信號通路，也可通過降低肝臟組織中IL-6蛋白表達，而抑制JAK／STAT信號通路蛋白活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：補充山菠菜多糖可通過抑制TGF-β1／BMP／Smad信號通路及IL-6介導(dǎo)的JAK／STAT信號通路而減少Hepcidin表達，改善長時間大強度運動大鼠鐵缺乏狀態(tài)。

山菠菜多糖；鐵代謝；鐵調(diào)素；TGF-β1／BMP／Smad信號通路；JAK／STAT信號通路

1 問題的提出

鐵作為機體必不可少的微量營養(yǎng)素，在調(diào)控基因表達、蛋白合成、細胞免疫、紅細胞生成、氧氣運輸?shù)榷喾N生理過程中發(fā)揮重要作用［1］。正常生理情況下，機體鐵維持平衡，當(dāng)體內(nèi)出現(xiàn)鐵儲備不足時，直接影響機體氧氣運輸及能量代謝，易出現(xiàn)運動性疲勞，使運動耐力降低［2］。由于運動過程中，尤其是長時間大強度的運動，會有出汗、紅血球溶解、胃腸道出血、血尿等伴發(fā)癥，導(dǎo)致運動者易出現(xiàn)鐵缺乏癥。有研究指出［3］鐵缺乏癥在運動員（尤其是女性）中高發(fā)，從事不同項目的運動員發(fā)病率約為23%～38%，賽季期間甚至更高。鐵缺乏癥若不能得到很好的治療，會引發(fā)缺鐵性貧血，給運動員鍛煉帶來極大的危害［4］。

鐵調(diào)素（Hepcidin）作為調(diào)節(jié)鐵代謝的關(guān)鍵性因子，在維持體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵性調(diào)控作用。研究表明［5］抑制Hepcidin表達可促進腸道吸收鐵，促使結(jié)合鐵釋放而改善機體缺鐵狀態(tài)。有研究指出［6］Smad4和JAK／STAT是調(diào)控肝細胞中Hepcidin表達的重要通路。山菠菜多糖是從山菠菜中提取的物質(zhì)，具有較好的止血、補血功能，也可輔助治療鐵缺乏癥，但具體作用機制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建長時間大強度運動大鼠模型，給予補充山菠菜多糖干預(yù)，觀察其在改善大鼠鐵缺乏癥中的意義及相關(guān)分子作用機制，以期為實際工作提供基礎(chǔ)資料。

2 材料與方法

2.1 研究材料

2.1.1 動物 4周齡雄性SD大鼠30只，體重120～140 g，均無訓(xùn)練運動史，購自河南省試驗動物中心，合格證號SCXK（豫）2011-0003，于吉林大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)。

2.1.2 藥物 研究所需山菠菜提取物（多糖含量約43%）購自西安森冉生物工程有限公司。使用時按照100 mg／kg的劑量將山菠菜提取物配制成懸濁液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.3 試劑盒 Hepcidin ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物科技有限公司）；轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）試劑盒（上海信裕生物科技有限公司）；血清鐵（SI）檢測試劑盒、不飽和鐵結(jié)合力（UIBC）診斷試劑盒和總鐵結(jié)合力（TIBC）測定試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；TGF-β1、BMP-2和Smad4及內(nèi)參引物（生工生物工程（上海）股份有限公司）；Trizol總RNA提取試劑盒（美國invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）；山羊抗大鼠IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3單克隆抗體（上海依科賽生物制品有限公司）；ECL發(fā)光檢測試劑盒（上海索萊寶生物科技有限公司）。

2.1.4 儀器 實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；臺式低溫高速離心機（德國Hettich公司）；普通型離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；Western blot實驗設(shè)備（北京六一儀器廠）。

2.2 實驗方法

2.2.1 動物分組 利用隨機數(shù)字表將所有大鼠隨機分為3組：對照組（C組）、運動組（E組）和運動＋干預(yù)組（EI組），每組各10只。分籠喂養(yǎng)，每籠5只，自然光照，自由飲食飲水，室溫22～24℃，相對濕度45%～55%，保持籠內(nèi)干燥。從第3周起，EI組大鼠每天18：00用灌胃器口腔灌服1次，每次2 m l，C組和E組均給予等量的生理鹽水灌服［7］。

2.2.2 訓(xùn)練方案 E組和EI組大鼠連續(xù)進行6周跑臺運動，坡度0，速度20 m／min，每周運動6 d，休息1 d；前2周作為適應(yīng)性運動階段，每天運動1次，后4周每天運動2次，上午和下午各1次，運動第1 d運動1 min，以后每次增加2 min，最后一天最后1次運動107 min［7］。

2.2.3 取材及指標測定 大鼠于最后1次運動后休息24 h，處死前12 h禁食，用烏拉坦（3 ml／kg）腹腔注射麻醉，達到預(yù)期麻醉效果后，經(jīng)腹主動脈取血標本2份，一份于室溫下靜置30 min，用高速離心機于12000 rpm／min離心15 min，取血清，另一份加入含促凝劑的促凝管中，于室溫下3500 rpm／min離心15 min，取血清，用于血清鐵狀態(tài)檢測，均保存于－20℃冰箱以備檢。打開大鼠胸腔，用DEPC配制的生理鹽水從大鼠升主動脈快速灌流以去除肝臟內(nèi)血液，將肝臟取下后用生理鹽水漂洗，保存于－80℃冰箱中以備檢。①大鼠血清Hepcidin和TF檢測：利用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清中Hepcidin和運鐵蛋白（Tf）濃度。②大鼠血清鐵狀態(tài)檢測：利用ELISA法對大鼠血清SI、UIBC和TIBC濃度進行檢測。③肝臟組織TGF-β1／BMP／Smad信號通路基因檢測：利用實時熒光定量PCR技術(shù)對肝臟組織中TGF-β1、BMP-2和Smad4基因表達進行檢測。肝臟組織研磨后，加入細胞裂解液裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對組織中總RNA進行提取，并檢測純度，取A260／A280≥1.80標本完成后續(xù)實驗。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄獲得模板單鏈cDNA，以cDAN為模板用PCR試劑盒完成PCR。TGF-β1、BMP-2和Smad4及內(nèi)參引物：TGF-β1引物：上游：5’-CTGATAGCGCTGAGTGGCTGT-3’，下游：5’-GTAGTAGACGATGGGCGATGG-3’；BMP-2引物：5’-GTCCTCAGCGAGTTTGAGTTG-3’，下游：5’-GACACCTGGCTTCTCCTCTAAGT-3’；Smad4引物：上游：5’-ACAGACAAGGTGGAGAGAGTGAG-3’，下游：5’-GTGGTACTGGTGGCATTAGACTC-3’；GAPDH內(nèi)參引物：上游：5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游：5’-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3’。PCR反應(yīng)條件：94℃60s，92℃45s，56℃30s，74℃30s，連續(xù)進行38次循環(huán)，每個樣品均設(shè)置3個平行反應(yīng)復(fù)孔。用2-△△Ct法獲得肝臟組織中TGF-β1、BMP-2和Smad4基因表達量。④肝臟組織IL-6蛋白和JAK／STAT信號通路蛋白檢測：利用Western blot法檢測肝臟中IL-6蛋白、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達。將肝臟組織研磨后，加入細胞裂解液裂解，用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA法對蛋白定量。取50μg總蛋白用SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST于4℃條件下封閉120 min，分別將各目標蛋白單克隆抗體（1：800或1：15 000）稀釋后加入，4℃下孵育過夜，用TBST沖洗3次，加入HRP標記二抗（1：2000稀釋），孵育4 h，用ECL發(fā)光檢測試劑盒顯色，利用Quantity One條帶分析軟件分析JIL-6、、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白相對表達量。

2.3 統(tǒng)計處理

所有實驗數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 研究結(jié)果與分析

3.1 長時間大強度運動及補充山菠菜多糖對大鼠血清Hepcidin、TF和鐵狀態(tài)的影響

長時間大強度運動及補充山菠菜多糖多大鼠血清Hepcidin、TF和鐵狀態(tài)的影響見表1。Hepcidin作為維持機體鐵穩(wěn)態(tài)的樞紐性小分子肽類激素，主要由肝細胞合成，其作用機制［8］：一方面可通過作用于腸道刷狀緣上皮細胞，增強細胞內(nèi)吞作用而使鐵通道蛋白被內(nèi)吞降解，從而使腸道對食物中的鐵吸收減少；另一方面可直接作用于肝脾單核－網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞的鐵通道蛋白而減少單核－網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中儲存鐵的釋放，從而減少機體鐵水平。有研究指出［9］，機體中Hepcidin水平不足或出現(xiàn)鐵通道蛋白異常時，均可導(dǎo)致高鐵狀態(tài)的產(chǎn)生。因此，Hepcidin異常表達常是引發(fā)鐵代謝失衡的中心性環(huán)節(jié)。Tf作為一種糖蛋白，主要由肝臟產(chǎn)生，可與鐵可逆性結(jié)合，運輸鐵到紅細胞生成部位合成血紅蛋白或運輸?shù)狡渌课粎⑴c生理代謝，游離Tf增高，是體內(nèi)鐵缺乏的標志［10］。研究結(jié)果顯示，長時間大強度運動可引起大鼠血清Hepcidin水平顯著升高，而高水平的Hepcidin可抑制腸道對鐵的吸收，同時減少單核－網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中儲存鐵向血清釋放，從而使血清TF升高，使機體處于鐵缺乏狀態(tài)。

山菠菜多糖是從山菠菜葉子中提取的多糖類物質(zhì)，具有健脾補血、補氣止血之功效［11］。本研究結(jié)果顯示，長時間大強度運動大鼠補充山菠菜多糖后，血清Hepcidin水平較長時間大強度運動組大鼠顯著降低，而Hepcidin水平降低可增加小腸上皮細胞及單核－網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞中鐵通道蛋白的表達［12］，從而加速腸道對鐵吸收及儲存鐵的釋放，使血清TF水平降低，小鼠鐵缺乏狀態(tài)得到改善，說明補充山菠菜多糖可有效改善長時間大強度運動大鼠鐵缺乏狀態(tài)，與降低Hepcidin表達有關(guān)。

表1 3組大鼠血清Hepcidin、TF和鐵狀態(tài)比較

表1 3組大鼠血清Hepcidin、TF和鐵狀態(tài)比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差，與C組相比，*P＜0.05；與E組相比，＃P＜0.05。表2、表3同。

組別Hepcidin（μg／l）TF（nmol／l）SI（mg／l）UIBC（mg／l）TIBC（mg／l ）C組118.21±13.83 101.57±10.72 5.21±0.98 4.12±0 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 .58 9.21±1.38 E組158.72±11.64*129.84±12.31*3.06±0.31*2.71±0.42*5.69±0.61*EI組129.95±12.14*＃114.42±10.14*＃4.11±0.79*＃3.44±0.49*＃7.51±1.25*＃F 22.151 17.275 44.767 25.119 20.992 P

3.2 長時間大強度運動及補充山菠菜多糖對大鼠肝臟TGF-β1／BMP／Smad信號通路的影響

長時間大強度運動及補充山菠菜多糖對大鼠肝臟TGF-β1／BMP／Smad信號通路的影響見表2。Hepcidin作為機體鐵狀態(tài)重要的負性調(diào)控因子，與機體鐵狀態(tài)密切相關(guān)，Smad4是介導(dǎo)Hepcidin調(diào)控通路中的關(guān)鍵性上游信號因子［13］。研究表明［14］，在由Smad蛋白介導(dǎo)的信號通路中，TGF-β1和 BMP-2在與各自受體結(jié)合而活化后，可使Smad2和Smad3磷酸化而與Smad4結(jié)合，形成共同的復(fù)合體而調(diào)控相關(guān)基因表達發(fā)揮生物學(xué)作用。有研究指出［15］，BMP-SMADs信號通路可調(diào)控肝臟中Hepcidin表達、轉(zhuǎn)錄。實驗結(jié)果顯示，長時間大強度運動會導(dǎo)致TGF-β1、BMP-2和Smad4蛋白表達上調(diào)（P＜0.05）（圖1），使Hepcidin表達增加，從而通過抑制小腸鐵吸收、巨噬細胞鐵釋放及肝鐵動員負性調(diào)控機體鐵穩(wěn)態(tài)［16］。

圖1 3組大鼠肝臟組織中TGF-β1／BM P／Smad信號通路蛋白表達

實驗中發(fā)現(xiàn)，在給長時間大強度運動補充山菠菜多糖后，肝臟組織中TGF-β1、BMP-2和Smad4表達量較長時間大強度運動大鼠顯著降低（P＜0.05），說明補充山菠菜多糖可抑制TGF-β1、BMP-2和Smad4表達，提示山菠菜多糖可能通過抑制TGF-β1／BMP／Smad信號通路而降低肝臟組織中Hepcidin表達，從而使機體鐵穩(wěn)態(tài)得以恢復(fù)。

表2 3組大鼠肝臟組織中TGF-β1／BM P／Smad信號通路蛋白表達比較

表2 3組大鼠肝臟組織中TGF-β1／BM P／Smad信號通路蛋白表達比較

組別TGF-β 1.11±0.08 1.09±0.11 1.07±0.07 E組2.34±0.12*1.52±0.13*1.57±0.09*EI組1.57±0.15*＃1.32±0.12*＃1.26±0.11*＃F 407.158 24.627 65.796 P 1 mRNA BMP-2 mRNA Smad4 mRNA C組0.000 0.000 0.000

3.3 長時間大強度運動及補充山菠菜多糖對大鼠肝臟JAK／STAT信號通路的影響

長時間大強度運動及補充山菠菜多糖對大鼠肝臟JAK／STAT信號通路的影響見表3。目前，關(guān)于Hepcidin表達的調(diào)控機制研究較多，肝細胞中Hepcidin表達調(diào)控過程較為復(fù)雜，研究認為［17］，JAK／STAT、HJV-BMP／SMAD、EPOR-C／EBPα、BMP／SMAD和ERK 4條信號傳導(dǎo)通路均參與了肝臟產(chǎn)生Hepcidin的過程。研究表明［18］，長時間大強度運動會誘導(dǎo)肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和炎性損傷。本研究結(jié)果顯示，E組大鼠肝臟組織中IL-6蛋白表達量顯著增高，提示長時間大強度運動會導(dǎo)致大鼠炎性反應(yīng)增強。

研究發(fā)現(xiàn)［19］IL-6等炎性因子可刺激Hepcidin表達。當(dāng)機體處于炎癥刺激狀態(tài)時，IL-6會大量產(chǎn)生，與其受體IL-6R結(jié)合到gp130分子區(qū)域，會引發(fā)gp130二聚體化，從而使JAK激酶被活化，加速胞內(nèi)STAT3磷酸化而使STAT3二聚體加速產(chǎn)生，STAT3二聚體又可轉(zhuǎn)移至胞核，與相應(yīng)區(qū)域結(jié)合而促使Hepcidin表達［20］。本研究結(jié)果顯示，E組大鼠出現(xiàn)JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達升高（圖2），說明長時間大強度運動大鼠肝臟中JAK／STAT信號通路被激活，提示長時間大強度運動導(dǎo)致IL-6大量表達，其通過激活JAK／STAT信號通路而增加了Hepcidin表達。劉濤方等［21］研究發(fā)現(xiàn)，用山菠菜汁制備酸乳具有抗炎、抗氧化的功效。本研究采用補充山菠菜多糖的方式進行干預(yù)，結(jié)果顯示，補充山菠菜多糖可減少肝臟組織中IL-6、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達，提示山菠菜多糖可能通過抑制肝臟炎癥反應(yīng)而減少IL-6表達，從而抑制JAK／STAT信號通路激活，最終導(dǎo)致Hepcidin表達減少。同時，也有研究指出［22］各信號傳導(dǎo)通路在調(diào)控肝臟組織產(chǎn)生Hepcidin時并不是孤立的，炎性因子IL-6介導(dǎo)JAK／STAT信號通路對Hepcidin的調(diào)節(jié)依賴于完整的BMP／SMAD信號通路，抑制SMAD4活性會減少IL-6對Hepcidin的上調(diào)作用。王金霞等［7］研究發(fā)現(xiàn)，補充山菠菜多糖可通過抑制SMAD4信號通路而減少Hepcidin表達，從而改善長時間大強度訓(xùn)練大鼠鐵缺乏狀態(tài)。我們推測，長時間大強度運動導(dǎo)致Hepcidin表達增加，可能是受肝組織中多條信號通路相互作用的結(jié)果，山菠菜多糖減少Hepcidin表達，亦是通過調(diào)控多條信號通路而實現(xiàn)的。

圖2 3組大鼠肝臟組織中IL-6蛋白和JAK／STAT信號通路蛋白表達

表3 3組大鼠肝臟組織中IL-6蛋白和JAK／STAT信號通路蛋白表達比較

表3 3組大鼠肝臟組織中IL-6蛋白和JAK／STAT信號通路蛋白表達比較

組別2±0.14 E組2.15±0.17*1.61±0.11*1.53±0.08*1.58±0.07*1.49±0.06*EI組1.42±0.12*＃1.24±0.14*＃1.17±0.13*＃1.79±0.11*＃1.68±0.07*＃F 165.491 40.907 44.262 35.270 56.684 P IL-6 JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3 C組1.08±0.09 1.03±0.16 1.05±0.21 1.06±0.15 1.0 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

4 結(jié)論

將山菠菜多糖作為補充，對長時間大強度運動的大鼠進行定量補充，結(jié)果顯示長時間大強度運動可增加大鼠血清Hepcidin和Tf水平，使機體處于鐵缺乏狀態(tài)，而補充山菠菜多糖則可有效降低長時間大強度運動大鼠血清Hepcidin和Tf水平，改善機體鐵缺乏狀態(tài)，其機制與阻斷肝組織中TGF-β1／BMP／Smad信號通路和IL-6介導(dǎo)的JAK／STAT信號通路而抑制Hepcidin表達有關(guān)。

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責(zé)任編輯：郭長壽

Effect of Atriplex Hortensis Polysaccharide on Iron Metabolism in Rats During Prolonged Strenuous Exercise and Molecular Mechanism

QU Shen，ZOU Xiaofeng，LIU Yingwei
（Physical Education College，Jilin University，Changchun 130024，Jilin，China）

In order to investigate the effect of atriplex hortensis polysaccharide on iron metabolism in rats during prolonged strenuous exercise and the possible molecular mechanism.30 SD rats were divided into the control group（group C），exercise group（E group）and exercise＋intervention group（EI group）.The prolonged strenuous exercise rat models were constructed by using treadmill training.In the third week of treadmill training，the rats were gavaged by using 100 mg／kg of atriplex hortensis polysaccharide suspension 2 m l per day.The serum Hepcidin，TF and iron status were tested.The expressions of TGF-β1，BMP-2 and Smad4 genes in liver tissues were detected by using real-time PCR technology.The expressions of IL-6 protein and JAK／STAT signaling pathway proteins in liver tissue were detected by using Western bolt. The results showed that compared with the E group，supplement of atriplex hortensis polysaccharide could effectively reduce serum Hepcidin and TF and improve the body＇s iron deficiency states，which the differences were statistically significant（P＜0.05）.Supplementary atriplex hortensis polysaccharide could inhibit TGF-β1／BMP／Smad signaling pathway，and inhibit the activities of JAK／STAT signaling pathway proteins by reducing the expression of IL-6 protein in liver tissue，which the differences were statistically significant（P＜0.05）.The conclusions indicated that supplement of atriplex hortensis polysaccharide could inhibit TGF-β1／BMP／Smad signaling pathway and IL-6 mediated JAK／STAT signaling pathway to reduce the expressions of Hepcidin，so as to improve the iron deficiency states in rats during prolonged strenuous exercise.

atriplex hortensis polysaccharide；iron metabolism；hepcidin；TGF-β1／BMP／Smad signaling pathway；JAK／ STAT signaling pathway

G804.32

A

1004－0560（2016）05－0063－05

2016-08-12；

2016-09-14

吉林省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)項目（2016C055－3）。

曲 申（1994—），男，碩士研究生，主要研究方向為體育教學(xué)與訓(xùn)練。

劉英偉（1974—），男，副教授，碩士，主要研究方向為體育統(tǒng)計學(xué)和運動人體科學(xué)。