杜仲幼果和葉片MVA途徑基因表達差異分析

王　淋，烏云塔娜，葉生晶

(1 中國林業(yè)科學研究院 經濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2 國家林業(yè)局杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003；3 國家林業(yè)局 中南林業(yè)調查規(guī)劃設計院，湖南 長沙 410014 )

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杜仲幼果和葉片MVA途徑基因表達差異分析

王淋1,2，烏云塔娜1,2，葉生晶3

(1 中國林業(yè)科學研究院 經濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2 國家林業(yè)局杜仲工程技術研究中心，河南 鄭州 450003；3 國家林業(yè)局 中南林業(yè)調查規(guī)劃設計院，湖南 長沙 410014 )

[摘要]【目的】 杜仲橡膠是一種多萜類物質，而甲羥戊酸(MVA)途徑是合成萜類物質的重要途徑之一。分析杜仲MVA途徑相關基因表達的差異，預測杜仲橡膠合成的主要上游途徑?！痉椒ā?在杜仲幼果和葉片轉錄組測序的基礎上，根據(jù)基因功能注釋和表達分析，確定MVA途徑的系列基因，并對其進行表達差異分析?！窘Y果】 杜仲橡膠合成的MVA途徑共涉及23條Unigene，分別為3條EuACOT、3條EuHMGS、8條EuHMGR、2條EuMK、1條EuPMK和6條EuMDP基因。根據(jù)轉錄組RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)數(shù)據(jù)對基因表達差異進行分析，結果表明杜仲MVA途徑中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在幼果和葉片中的表達量具有顯著差異，其中僅EuMDP9在葉片中的表達量大于幼果，而其余基因在幼果的表達量大于葉片；EuHMGR15和EuHMGR17只在幼果中特異表達?！窘Y論】 MVA途徑絕大部分基因在果實中大量表達，這與果實中杜仲橡膠含量遠超過葉片的現(xiàn)象相吻合，推測杜仲果實MVA途徑為杜仲橡膠合成的主要途徑。

[關鍵詞]杜仲；幼果和葉片；甲羥酸途徑；基因表達差異

杜仲(EucommiaulmoidesOlives) 是中國特有的名貴滋補藥材，具有補肝腎、益筋骨、安胎等多種功效[1]；除此之外，杜仲葉片、果實、樹皮、根中均含有大量的天然膠狀物質——杜仲橡膠 (EucommiaulmoidesRubber，EUR)。杜仲橡膠是溫帶地區(qū)重要的膠源，杜仲樹在溫帶地區(qū)適生面積較廣。杜仲橡膠與天然三葉橡膠的化學成分相同，但化學結構不同，天然橡膠為順式聚異戌二烯，而杜仲橡膠為反式聚異戌二烯，這種獨特的橡塑二重性質決定了杜仲橡膠具有重要的經濟價值[2-3]。杜仲果實和葉片中橡膠含量有明顯差異，一般而言，果實含膠率為10%～12%，葉片含膠率僅為1%～3%[4]。因此，進行不同組織的基因表達與橡膠含量的相關性研究，比較分析橡膠合成相關基因的表達差異，闡明基因表達差異與橡膠含量的動態(tài)變化關系，可以揭示杜仲橡膠合成的基因調控機制。

杜仲橡膠屬于多萜類化合物質，Chaykin等[5]和Lynen等[6]首次提出了萜類物質合成的甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑，且該途徑主要位于細胞質中，又被稱為細胞質途徑。Takeshi等[7]利用同位素標定法標記萜類物質合成MVA 途徑代謝的中間產物發(fā)現(xiàn)，在杜仲的含膠細胞中存在MVA代謝途徑，提出杜仲橡膠生物合成與MVA代謝途徑有關及杜仲橡膠是反式聚異戊二烯的觀點。到目前為止，杜仲中已分離鑒定的萜類物質有16種以上，MVA途徑主要包括6步化學反應：① 3分子的乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶(Acetyl-CoAacethyl transferase，ACOT)的催化作用下生成乙酰乙酰輔酶A；② 乙酰乙酰輔酶A在3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(3-Hydroxyl-3-methylglutaryl-CoAsynthase，HMGS)的催化作用下生成3-羥基-3-甲基戊二酰CoA；③ 3-羥基-3-甲基戊二酰CoA經3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)催化生成甲羥戊酸；④甲羥戊酸在MVA甲羥戊酸激酶(Mevalonate kinase，MK)的磷酸化作用下形成5-磷酸-甲羥戊酸；⑤ 5-磷酸-甲羥戊酸隨后在甲羥戊酸磷酸激酶(5-phosphate-mevalonate kinase，PMK)的作用下生成甲羥戊酸焦磷酸；⑥甲羥戊酸焦磷酸在甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase，MDC)的作用下脫羧生成異戊烯基焦磷酸IPP(IsopentenyI-PP)[8-11]。

近年來，轉錄組研究在RNA水平上可獲得高通量基因表達水平的相關信息，而且是解析基因表達差異、新基因發(fā)掘、基因結構功能研究的有效方法之一[12-13]?；贗llumina/Solexa高通量測序平臺的轉錄組測序技術具有高度自動化、讀取片段多、適合進行各種大小片段的測序、能夠在單核苷酸水平檢測對任意物種的整體轉錄情況等多種功能[14-15]。本研究根據(jù)李鐵柱等[16-17]已構建的杜仲果實和葉片轉錄組數(shù)據(jù)庫，將杜仲幼果和葉片轉錄組中的Unigene根據(jù)GO功能分析得出萜類化合物生物合成的代謝通路，對其幼果和葉片萜類合成MVA途徑基因的表達差異進行了分析，闡明基因表達差異與橡膠含量的動態(tài)變化關系，以期為杜仲萜類化合物尤其是杜仲橡膠的生物合成途徑及其分子調控機理研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

選取中國林業(yè)科學研究院經濟林研究開發(fā)中心(國家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心)國審良種‘華仲6號’杜仲的幼果(授粉后50 d，杜仲橡膠合成第1個高峰期)和葉片(展葉后55 d，橡膠含量較高)為試驗材料，液氮速凍后，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2杜仲樣品RNA的提取

分別取杜仲幼果和葉片約100 mg，采用Omega公司的Plant RNA Kit試劑盒提取杜仲幼果和葉片的總RNA，提取完畢測定總RNA品質，如果A260/A280比值在1.8～2.2，表明提取的RNA符合要求。將杜仲幼果和葉片的RNA(約2 μg)送至深圳華大基因公司進行轉錄組測序及基因功能注釋。

1.3轉錄組測序及Unigene功能注釋方法

深圳華大基因公司采用Illumina技術進行測序，首先是將細胞中的所有轉錄產物反轉錄為cDNA文庫，然后將cDNA文庫中的DNA隨機剪切為小片段(或將RNA片段化后再反轉錄)，這樣可產生了成千上萬的短cDNA reads，然后再進行Illumina測序。獲得序列數(shù)據(jù)后，對測序序列進行拼接組裝，首先使用短reads組裝軟件SOAP denovo做轉錄組從頭組裝，然后利用paired-end reads對Scaffold做補洞處理，最后將Unigene序列與蛋白數(shù)據(jù)庫nr、Swiss-Prot、KEGG和COG做blastx比對(期望值<0.000 01)，取比對結果最好的蛋白確定Unigene的序列方向。Unigene的表達量計算使用RPKM法(Reads Per kb per Million reads)，其計算公式如下：

式中:設RPKM為Unigene A的表達量，則C為唯一比對到Unigene A的reads數(shù)，N為唯一比對到所有Unigene的總reads數(shù)，L為Unigene A的堿基數(shù)[18]。

2結果與分析

2.1杜仲萜類物質合成MVA途徑的代謝位點

將杜仲幼果和葉片Unigene輸入到KEGG數(shù)據(jù)庫，結果發(fā)現(xiàn)MVA合成途徑共有6個基因23條Unigene被注釋，如圖1所示，其中代謝位點2.3.1.9為乙酰乙酰CoA硫解酶 (Acetyl-CoA acethyl transferase，ACOT)，共被注釋3條Unigene，記為EuACOT8-10；代謝位點2.3.3.10為3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)，被注釋3條Unigene，記為EuHMGS4-6；代謝位點1.1.1.34為3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)，被注釋8條Unigene，記為EuHMGR12-19；代謝位點2.7.1.36為甲羥戊酸激酶 (Mevalonate kinase，MK)，被注釋2條Unigene，記為EuMK3-4；代謝位點2.7.4.2為甲羥戊酸磷酸激酶 (5-phosphate-mevalonate kinase，PMK)，被注釋1條Unigene，記為EuPMK3；代謝位點4.1.1.33為甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶 (Mevalonate-5-diphosphate decarboxylase，MDP)，被注釋6條Unigene，記為EuMDP6-11。

圖 1　杜仲MVA途徑代謝位點

2.2杜仲乙酰乙酰CoA硫解酶基因(EuACOT)的確定及表達差異

2.2.1EuACOT的確定從杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片ACOT基因均有3條Unigene被注釋，與油茶(Camelliaoleifera,ADD10719.1)和煙草(Nicotianatabacum,AAU95619.1)的ACOT基因相似性達到82%～91%(表1)，因此命名為EuACOT基因，繼杜仲成熟果實EuACOT1-7基因家族[19]，命名為EuACOT8-10。

表 1　杜仲幼果和葉片EuACOT基因的相關信息

2.2.2EuACOT在杜仲幼果和葉片中的表達量差異乙酰乙酰CoA硫解酶是萜類物質合成MVA途徑的起始酶，對眾多蛋白的乙?；哂行揎椬饔肹20-21]。由圖2可見，EuACOT在杜仲幼果和葉片中均有表達，且在幼果中的表達量均大于葉片；其中EuACOT8和EuACOT10在幼果中的表達量顯著高于葉片。無論在杜仲幼果還是葉片中，EuACOT的表達量大小順序均為EuACOT8>EuACOT10>EuACOT9。

2.3杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰CoA合成酶基因(EuHMGS)的確定及表達差異

2.3.1EuHMGS的確定從杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片HMGS基因有3條Unigene被注釋，與煙草屬觀賞煙(N.langsdorffii×N.sanderae,ABV02025.1)、喜樹(Camptothecaacuminata,ACD87446.1)的HMGS基因相似性達到61%～89%(表2)，因此命名為杜仲的Eu-HMGS基因，繼杜仲成熟果實EuHMGS1-3基因家族[19]，記為EuHMGS4-6。

圖 2　EuACOT基因在杜仲幼果和葉片中的差異表達

Unigene命名UnigenenameUnigene編號UnigeneID長度/bpLength參考序列ID號ReferencesequenceID物種Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuHMGS4103121525ABV02025.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae089EuHMGS51361924ACD87446.1喜樹Camptothecaacuminata087EuHMGS640010558ABV02025.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae7e-6261

2.3.2EuHMGS基因在杜仲幼果和葉片中的表達量差異從圖3可以看出，EuHMGS家族的成員在杜仲幼果和葉片中均有表達，且在幼果中的表達量顯著高于葉片。無論在幼果還是葉片中，其表達量大小順序均為EuHMGS5>EuHMGS4>EuHMGS6。

圖 3　EuHMGS在杜仲幼果和葉片中的差異表達

2.4杜仲3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因(EuHMGR)的確定及表達差異

2.4.1EuHMGR的確定從杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片HMGR基因均有8條Unigene被注釋，與杜仲(E.ulmoides,AAV54051.1)、黃龍膽(Gentianalutea,BAE92730.1)、煙草(N.tabacum,AAB87727.1)、胡黃連(Picrorhizakurrooa，ABC74565.1)、丹參(Salviamiltiorrhiza，ACD37361.1)、黃龍膽(Gentianalutea，BAE92730.1)、喜樹(C.acuminata，P48021.1) 的HMGR基因相似性達到53%～99%(表3)，命名為EuHMGR基因，繼杜仲成熟果實EuHMGR1-11家族基因[19]，命名為EuHMGR12-19。

2.4.2EuHMGR基因在幼果和葉片中的表達量差異從圖4可以看出，家族成員EuHMGR15和EuHMGR17在幼果中特異表達，而其他EuHMGR家族成員在幼果和葉片中均有表達；EuHMGR14和EuHMGR19在葉片中的表達量大于幼果，而其他EuHMGR家族成員的表達量均是幼果大于葉片，其中EuHMGR18在幼果中的表達量顯著高于葉片。

2.5杜仲甲羥戊酸激酶基因(EuMK)的確定及表達差異

2.5.1EuMK的確定從杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片MK基因均有2條Unigene被注釋，與橡膠樹(Heveabrasiliensis,AAL18925.1)的MK基因相似性達到77%～85%(表4)，命名為EuMK基因，繼成熟果實EuMK1-2基因家族[19]，命名為EuMK3-4。

表 3　杜仲幼果和葉片EuHMGR基因的相關信息

Unigene命名UnigenenameUnigene編號UnigeneID長度/bpLength參考序列IDReferencesequenceID物種Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuMK3189271094AAL18925.1橡膠樹Heveabrasiliensis1e-17277EuMK42112480AAL18925.1橡膠樹Heveabrasiliensis6e-3385

2.5.2EuMK在杜仲幼果和葉片中的表達量差異從圖5可以看出，EuMK家族成員在杜仲幼果和葉片中均有表達，且在幼果中的表達量顯著高于葉片，無論是果實還是葉片中，表達量大小均為EuMK3>EuMK4。

2.6杜仲甲羥戊酸磷酸激酶基因(EuPMK)的確定及表達差異

2.6.1EuPMK的確定從杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片PMK基因均有1條Unigene被注釋，與茶(Camelliasinensis,AFC34137.1)的PMK基因相似性達到90%(表5)，故命名為EuPMK基因，繼杜仲成熟果實EuPMK1-2基因家族[19]，命名為EuPMK3。

圖 5　EuMK基因在杜仲幼果和葉片中的差異表達

Unigene命名UnigenenameUnigene編號UnigeneID長度/bpLength參考序列IDReferencesequenceID物種Species期望值E-value相似度/%SimilarityEuPMK3103211817AFC34137.1 茶Camelliasinensis090

2.6.2EuPMK基因在幼果和葉片中的表達量差異從圖6可以看出，EuPMK3基因在杜仲幼果和葉片中均有表達，且在幼果中的表達量大于葉片。

2.7杜仲甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因(EuMDP)的確定及表達差異

2.7.1EuMDP的確定從杜仲幼果和葉片的轉錄組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，杜仲幼果和葉片MDP基因有6條Unigene被注釋，與橡膠樹(Heveabrasiliensis,AAL18927.1，BAF98285.1)、煙草屬觀賞煙(N.langsdorffii×N.sanderae,ABV02028.1)、人參(Panaxginsen,ADI80345.1)的MDP基因相似性達到82%～89%(表6)，命名為EuMDP基因，繼成熟果實EuMDP1-5基因家族[19]，記為EuMDP6-11。

圖 6　EuPMK在杜仲幼果和葉片中的差異表達

Unigene命名UnigenenameUnigene編號UnigeneID長度/bpLength參考序列ID號ReferencesequenceID物種species期望值E-value相似度/%SimilarityEuMDP62961485AAL18927.1橡膠樹Heveabrasiliensis5e-1782EuMDP741324240ABV02028.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae2e-3689EuMDP845009224ABV02028.1觀賞煙Nicotianalangsdorffii×Nicotianasanderae2e-4088EuMDP946901275ADI80345.1人參Panaxginsen1e-2689EuMDP1047529306ADI80345.1人參Panaxginsen1e-2689EuMDP116878952BAF98285.1橡膠樹Heveabrasiliensis9e-16084

2.7.2EuMDP在杜仲幼果和葉片中的表達量差異從圖7 可以看出，EuMDP家族成員在幼果和葉片中均有表達，其中EuMDP6和EuMDP9在葉片中的表達量大于幼果，其余成員表達量均是幼果大于葉片；除了EuMDP6在幼果與葉片中的表達量無顯著差異外，杜仲EuMDP家族其他成員在幼果與葉片中的表達量均存在顯著差異。

圖 7　EuMDP在杜仲幼果和葉片中的差異表達

3討論與結論

本研究結果表明，萜類物質合成MVA途徑共涉及23條Unigene，其中包括3條ACOT(EuACOT8-10)、3條HMGS(EuHMGS4-6)、8條HMGR(EuHMGR12-19)、2條MK(EuMK3-4)、1條PMK(EuPMK3)、6條MDP(EuMDP6-11)。利用RPKM法對杜仲幼果和葉片轉錄組基因表達水平進行計算分析，可以消除基因長度和測序量差異對基因表達豐度的影響[16-17,22]，從而可直接準確地反應基因的表達水平，為分析基因表達情況提供了方便有效的方法。根據(jù)杜仲幼果和葉片轉錄組RPKM數(shù)據(jù)分析，杜仲MVA途徑中的EuACOT8、EuACOT10、EuHMGS4、EuHMGS5、EuHMGS6、EuHMGR18、EuMK3、EuMK4、EuMDP7、EuMDP8、EuMDP9、EuMDP10、EuMDP11基因在杜仲幼果和葉片中的表達量具有顯著差異，EuHMGR15和EuHMGR17在幼果中特異表達。另外，幼果和葉片中表達量具有顯著差異的基因中，僅EuMDP9在葉片中的表達量大于幼果，其余基因在杜仲幼果中的表達量大于葉片。綜上所述，杜仲果實和葉片中均存在萜類合成的MVA代謝途徑，且基因表達量在果實和葉片中具有明顯差異，果實的基因表達量顯著高于葉片，這與果實中杜仲橡膠含量遠超過葉片相一致，推測杜仲橡膠合成的上游途徑主要以MVA途徑為主。

萜類是一大類植物次生代謝產物，結構復雜、種類繁多[23]。MVA途徑相關酶基因主要參與萜類物質的合成，且對光合作用、呼吸作用、生長發(fā)育的調節(jié)，細胞內信號傳導以及細胞膜結構和功能等重要生物學進程有影響，對細胞代謝的諸多方面以及細胞膜的結構和功能發(fā)揮著重要作用。Wititsuwannakul等[24]證明巴西橡膠HMGR基因的表達量與其橡膠含量相關；Chappell[25]等將倉鼠的HMGR基因轉入煙草中，結果提高了總的 HMGR 酶活性，同時甾醇的含量也有一定增加；Ren Chen等[26]將EuIPI基因轉入杜仲，從而提高了轉基因杜仲中反式聚異戊二烯的含量，推測EuIPI的表達調控可提高杜仲產膠量。因此，綜上所述，將MVA途徑相關基因表達量提高或抑制其表達應該會對IPP的表達調控產生影響，亦或是MVA途徑相關基因結合IPP基因一起調控下游杜仲膠合成關鍵基因的表達可以影響反式聚異戊二烯的含量，即合成杜仲膠的含量。

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Differential expression of MVA pathway genes in young fruits and leaves ofEucommiaulmoidesOliver

WANG Lin1,2,WUYUN Ta-na1,2,YE Sheng-jing3

(1Non-timberResearchandDevelopmentCenterofCAF,Zhengzhou,Henan450003,China;2TheEucommiaEngineeringResearchCenterofStateForestryAdministration,Zhengzhou,Henan450003,China;3CentralSouthForestInventoryandPlanningInstituteofStateForestryAdministration,Changsha,Hunan410014,China)

Abstract:【Objective】 Eucommia ulmoides Rubber (EuR) is one type of terpenoids,which can be synthesized by mevalonate (MVA) pathway.This study analyzed the differential expression of genes in MVA pathway in young fruits and leaves of E.ulmoides oliver and predicted main pathways of EuR synthesis.【Method】 According to the high-throughput transcriptome sequencing (RAN-seq) data,functional annotation and expression analysis in E.ulmoides young fruits and leaves,unigenes of MVA pathway were determined,and their expressions were systematically analyzed.【Result】 Twenty-three unigenes in MVA pathway were annotated including 3 acetyl-CoA C-acetyltransferase (EuACTO),3 hydroxymethylglutaryl-CoA synthase (EuHMGS),8 hydroxymethylglutaryl-CoA reductase (EuHMGR),2 mevalonate kinase (EuMK),1 phosphomevalonate kinase (EuPMK),and 6 diphosphomevalonate decarboxylase (EuMDP).Reads Per Kilo bases per Million reads (RPKM) data analysis showed that the expressions of EuACOT8,EuACOT10,EuHMGS4,EuHMGS5,EuHMGS6,EuHMGR18,EuMK3,EuMK4,EuMDP7,EuMDP8,EuMDP9,EuMDP10,and EuMDP11 were significantly different in young fruits and leaves.Only the expression of EuMDP9 in leaves was greater than in young fruits,while the expressions of other genes in young fruits were greater than in leaves.Furthermore,EuHMGR15 and EuHMGR17 were unique in young fruits.【Conclusion】 Most of genes in MVA pathway were abundantly expressed in young fruits,which was consistent with the fact that rubbers form fruits were more than from leaves.Therefore,MVA pathway was considered the main synthetic pathway of EuR.

Key words：Eucommia ulmoides Olives;young fruits and leaves;MVA pathway;differential expression of gene

DOI：網絡出版時間:2016-04-0709:0010.13207/j.cnki.jnwafu.2016.05.013

[收稿日期]2014-09-29

[基金項目]國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201004029)

[作者簡介]王淋(1986-)，女，遼寧鞍山人，博士，主要從事經濟林育種研究。E-mail：174816279@qq.com[通信作者]烏云塔娜(1975-)，女，內蒙古通遼人，教授，主要從事經濟林育種栽培研究。E-mail：tanatanan@163.com

[中圖分類號]Q786

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)05-0097-08

網絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160407.0900.026.html