巨噬細(xì)胞極化在大鼠肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用*

田小霞，　張慧英△，　陳云霞，　李旭炯，　王黎敏，　孟　麗，　來麗娜，　趙中夫，　韓德五，　CHENG Ji

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 1病理生理學(xué)教研室， 2微生物學(xué)教研室， 3生理學(xué)教研室， 4機(jī)能綜合實(shí)驗(yàn)室， 5藥理學(xué)教研室， 6肝病研究所，山西 長(zhǎng)治 046000； 7山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西 太原030001； 8南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院肝病中心， 美國 加利福尼亞州 洛杉磯 90089)

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巨噬細(xì)胞極化在大鼠肝硬化發(fā)生發(fā)展中的作用*

田小霞1，張慧英1△，陳云霞2，李旭炯3，王黎敏4，孟麗2，來麗娜5，趙中夫6，韓德五7，CHENG Ji8

(長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2微生物學(xué)教研室，3生理學(xué)教研室，4機(jī)能綜合實(shí)驗(yàn)室，5藥理學(xué)教研室，6肝病研究所，山西 長(zhǎng)治 046000；7山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西 太原030001；8南加州大學(xué)Keck醫(yī)學(xué)院肝病中心， 美國 加利福尼亞州 洛杉磯 90089)

[摘要]目的： 探討在大鼠肝硬化發(fā)病過程中，巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)及其與腸源性內(nèi)毒素血癥-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)之間的關(guān)系。方法: 36只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和肝硬化模型組。各組動(dòng)物分別于造模第4周末、6周末和8周末處死取材。ELISA法檢測(cè)大鼠血漿中ALT、內(nèi)毒素、Hcy的水平和肝組織勻漿中iNOS、TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10的水平；肝組織切片行HE染色和VG染色；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)大鼠肝組織中Grp78、NF-κB、IRF5、CD86、CD206和TGF-β1 的mRNA表達(dá)。結(jié)果: 與相應(yīng)的正常對(duì)照組相比，肝硬化模型組動(dòng)物血漿中ALT、內(nèi)毒素、Hcy水平和肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)在4周、6周和8周均隨病程進(jìn)展逐漸升高(P<0.05)；肝組織中NF-κB、IRF5 和CD86的mRNA表達(dá)以及iNOS、TNF-α、IL-6的水平均顯著升高(P<0.05)，且它們的變化趨勢(shì)為6周水平最高，4周次之，8周最低；肝組織中CD206 和TGF-β1的mRNA表達(dá)以及Arg-1、IL-10的水平在4周未見明顯變化，在6～8周逐漸升高(P<0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿中內(nèi)毒素水平與肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.01)；血漿中內(nèi)毒素水平和肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)均與肝組織中CD86和CD206 的mRNA表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論: 肝損傷-腸源性內(nèi)毒素血癥-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-巨噬細(xì)胞極化途徑可能是肝纖維化乃至肝硬化發(fā)病的重要機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]肝硬化； 肝纖維化； 巨噬細(xì)胞； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 內(nèi)毒素

肝內(nèi)巨噬細(xì)胞包括肝血竇內(nèi)的枯否細(xì)胞和來自血液的單核細(xì)胞，它們具有可塑性和多能性，在不同微環(huán)境的影響下，可分化為不同表型并表現(xiàn)出功能上的差異，現(xiàn)已明確的2種巨噬細(xì)胞極化類型分別為經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞和選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞，二者是巨噬細(xì)胞一系列功能變化的其中2個(gè)極端狀態(tài)。巨噬細(xì)胞極化發(fā)生在多種生理及病理過程中，對(duì)于維持機(jī)體健康具有十分重要的意義[1-2]。目前的研究表明，巨噬細(xì)胞極化在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[3-5]，而在動(dòng)物模型體內(nèi)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的研究卻不多。本項(xiàng)研究繼續(xù)以復(fù)合致病因素誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型為研究對(duì)象，觀察在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程的不同階段巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)，并初步探討影響巨噬細(xì)胞極化過程的可能機(jī)制。

材料和方法

1主要試劑

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、內(nèi)毒素、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)的ELISA檢測(cè)試劑盒購自上海藍(lán)基生物科技有限公司；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、精氨酸酶-1(arginase-1，Arg-1)和白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)的ELISA檢測(cè)試劑盒購自上?？畦b生物科技有限公司?？俁NA提取試劑RNAiso Plus，反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT Master Mix，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMII購自TaKaRa；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，Grp78)、核因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)、干擾素調(diào)節(jié)因子(interferon-regulatory factor，IRF)5、CD86、CD206、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和18S RNA引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及標(biāo)本制備36只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重180～220 g。隨機(jī)將大鼠分為正常對(duì)照(normal control,N)組和肝硬化模型(model，M)組，每組18只動(dòng)物。肝硬化模型組采用復(fù)合致病因素法復(fù)制[6]：以摻入膽固醇(飼料重量0.5%)的玉米面做飼料，前2周摻入豬油(飼料重量20%)，首次皮下注射CCl4原液(每100g體重0.5mL)，之后每隔3 d皮下注射40% CCl4油溶液(每100 g體重0.3 mL)，以4%(體積比)乙醇作為飲用水。正常對(duì)照組動(dòng)物飼以標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。將每一組動(dòng)物隨機(jī)分為3批，每批6只，分別于造模第4周末、6周末和8周末，全麻、無菌、無內(nèi)毒素條件下取材。腹主動(dòng)脈采集血液，3 000 r/min離心15 min后，吸取血漿，置-80 ℃保存?zhèn)溆?；每次取肝臟同一區(qū)域組織用10% 中性甲醛固定，石蠟包埋，組織切片用于HE染色和VG染色；取部分肝組織立即置于液氮，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃凍存，用于相關(guān)基因的檢測(cè)。

2.2肝組織HE染色和VG染色以石蠟包埋的組織標(biāo)本制備5 μm厚連續(xù)切片，行HE染色和VG染色。

2.3血漿和肝組織勻漿中指標(biāo)檢測(cè)嚴(yán)格按照ELISA試劑盒操作說明，分別測(cè)定血漿中ALT、內(nèi)毒素、Hcy的水平和肝組織勻漿中iNOS、TNF-α、IL-6、Arg-1、IL-10的水平。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR用TaKaRa的RNAiso Plus試劑提取肝組織總RNA。用酶標(biāo)儀檢測(cè)RNA樣品純度(A260/A280值在1.7～2.1)。按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，產(chǎn)物保存于-20 ℃。以cDNA為模板，Primer Express 2.0和Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)引物，具體序列見表1。采用SYBR?Green I 熒光染料實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s,Grp78 62 ℃ 20 s/NF-κB 57 ℃ 15 s/IRF5 58 ℃ 15 s/CD86 58.5 ℃ 20 s/CD206 59.5 ℃ 20 s/TGF-β1 57.5 ℃ 15 s/18S RNA 61.5 ℃ 20 s,72 ℃ 1 min,共35個(gè)循環(huán)。以18S RNA為內(nèi)參照，結(jié)果采用2-ΔΔCt值表示[7]。

表 1　RT-qPCR引物序列

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和組間LSD-t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)分析做相關(guān)性檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1肝組織HE染色和VG染色

各正常對(duì)照組：肝細(xì)胞索排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰。肝硬化模型4周組，可見肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞索排列紊亂，未見明顯的膠原纖維沉積；模型6周組，炎性反應(yīng)進(jìn)一步加重，部分肝小葉結(jié)構(gòu)消失，可見增生的條索狀纖維間隔；模型8周組，纖維組織增生形成纖維間隔，分割正常的小葉結(jié)構(gòu)形成假小葉，見圖1、2。

Figure 1. Pathological changes of liver tissues (HE staining). N: normal control group; M: liver cirrhosis model group.

圖1肝組織HE染色

Figure 2.Pathological changes of liver tissues (VG staining). N: normal control group; M: liver cirrhosis model group.

圖2肝組織VG染色

2血漿中ALT、內(nèi)毒素和Hcy水平變化

與相應(yīng)的正常對(duì)照組相比，隨著病程的進(jìn)展，肝硬化模型組動(dòng)物血漿中ALT、內(nèi)毒素和Hcy的水平逐漸顯著增高(P<0.05)，見表2。

表2　血漿中ALT、內(nèi)毒素和Hcy水平變化

*P<0.05 vs N group.

3肝組織中iNOS、TNF-α、IL-6、Arg-1和IL-10水平變化

肝硬化模型組各個(gè)時(shí)點(diǎn)肝組織中iNOS、TNF-α 和IL-6的水平均顯著高于其相應(yīng)的正常對(duì)照組(P<0.05)，以6周組最高，4周組次之，8周組最低；而肝組織中Arg-1和IL-10的水平在肝硬化4周未見明顯變化，在6周和8周顯著升高(P<0.05)，見表3、4。

表3　肝組織中iNOS、TNF-α和IL-6水平變化

*P<0.05 vs N group.

表4　肝組織中Arg-1和IL-10水平變化

*P<0.05 vs N group.

4肝組織中Grp78、NF-κB、IRF5、CD86、CD206和TGF-β1 mRNA的表達(dá)

與相應(yīng)的正常對(duì)照組相比，肝硬化模型組動(dòng)物肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸升高(P<0.05)；NF-κB、IRF5和CD86的 mRNA表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，其中6周最高，4周次之，8周最低；CD206和TGF-β1的mRNA的表達(dá)在4周組未見明顯變化，在6周和8周組逐漸顯著升高(P<0.05)，見圖3。

5相關(guān)性分析

大鼠血漿中內(nèi)毒素水平與肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.01)；血漿中內(nèi)毒素水平和肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)分別與肝組織中CD86 和CD206的mRNA表達(dá)顯著相關(guān)(P<0.01)，見表5。

討論

研究表明巨噬細(xì)胞極化在維持機(jī)體自穩(wěn)態(tài)，非酒精性脂肪肝、腫瘤等多種疾病的發(fā)病，以及炎癥的發(fā)生、發(fā)展和消解過程中起關(guān)鍵的作用[8]。M1型巨噬細(xì)胞的主要功能是清除細(xì)胞外病原體，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，合成和分泌TNF-α、IL-1、IL-6等促炎細(xì)胞因子，通過iNOS將精氨酸代謝成NO來殺滅病原體；M2型巨噬細(xì)胞的主要功能是抑制炎癥反應(yīng)，參與組織修復(fù)、合成和分泌抗炎細(xì)胞因子IL-10以及通過Arg-1將精氨酸分解成聚胺，參與合成和穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)[9-10]。本研究中復(fù)合致病因素誘導(dǎo)肝硬化模型4周，巨噬細(xì)胞主要分化為M1型，肝臟的變化以炎性反應(yīng)為主；6周，M1和M2型巨噬細(xì)胞的數(shù)量都顯著增多，以M1型為更多，肝臟炎性反應(yīng)加劇，同時(shí)有少量纖維生成；8周，巨噬細(xì)胞主要分化為M2型，M2型巨噬細(xì)胞通過釋放大量的促纖維化細(xì)胞因子，引起肝星狀細(xì)胞過度活化，肝臟發(fā)生細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的纖維修復(fù)反應(yīng)。因此，慢性肝損傷后，肝內(nèi)巨噬細(xì)胞極化的動(dòng)態(tài)變化與肝硬化的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)。

我們前期的研究證實(shí)腸源性內(nèi)毒素血癥(intestinal endotoxemia，IETM)引起的肝組織氧化應(yīng)激和高同型半胱氨酸血癥可以引發(fā)肝臟發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)，進(jìn)而導(dǎo)致Grp78表達(dá)升高，在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[11]。本項(xiàng)研究中肝硬化模型動(dòng)物血漿中內(nèi)毒素、同型半胱氨酸的水平和肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)均隨病程進(jìn)展逐漸顯著升高，而且血漿中內(nèi)毒素水平和肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)存在顯著相關(guān)性，與之前的研究結(jié)果一致。另外血漿中內(nèi)毒素水平和肝組織中Grp78的mRNA表達(dá)與M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD86的mRNA和M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物CD206的mRNA表達(dá)均存在顯著相關(guān)性，提示肝內(nèi)巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)化機(jī)制可能與腸源性內(nèi)毒素血癥-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。另外，NF-κB信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要功能[12]，而IRF5對(duì)M1型巨噬細(xì)胞極化起關(guān)鍵作用[13]，本項(xiàng)研究還檢測(cè)了這2個(gè)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，結(jié)果NF-κBmRNA和IRF5 mRNA表達(dá)與M1型巨噬細(xì)胞的變化趨勢(shì)一致，6周最高，4周次之，8周最低，也呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化過程。

Figure 3. The mRNA levels of Grp78, NF-κB, IRF5, CD86, CD206 and TGF-β1 in the liver tissues. N: normal control group; M: liver cirrhosis model group. Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs N group.

圖3肝組織中Grp78、NF-κB、IRF5、CD86、CD206和TGF-β1的mRNA表達(dá)

表5　各指標(biāo)間相關(guān)性分析

衣霉素(tunicamycin，TM)或毒胡蘿卜素(thapsigargin，TG)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)之后，收集其培養(yǎng)上清液，作用于佛波酯誘導(dǎo)人單核細(xì)胞THP-1分化成的巨噬細(xì)胞，結(jié)果巨噬細(xì)胞Toll樣受體4的表達(dá)減少，NF-κB信號(hào)途徑被抑制，同時(shí)促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β等表達(dá)減少，巨噬細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，巨噬細(xì)胞向M2型分化[14]。這提示從損傷因素作用于肝臟開始至肝硬化4周，IETM逐漸形成，通過高同型半胱氨酸血癥等因素引發(fā)肝臟發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，NF-κB、IRF5等信號(hào)途徑被激活，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化，肝硬化4周以后，在IETM的作用下，肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)到達(dá)一定強(qiáng)度，可能通過某種機(jī)制抑制NF-κB 和IRF5的信號(hào)途徑，同時(shí)促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型分化可能是肝纖維化乃至硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)非常重要的機(jī)制。

在各種實(shí)驗(yàn)性肝損傷模型中，巨噬細(xì)胞的活化總是先于肝星狀細(xì)胞的激活，其分泌的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等與肝臟其它細(xì)胞相互作用，影響肝纖維化乃至硬化的發(fā)生發(fā)展過程[15]。在肝硬化發(fā)生發(fā)展過程中，隨著腸源性內(nèi)毒素血癥-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)程度的不斷增強(qiáng)，巨噬細(xì)胞先分化為M1型，參與肝臟的炎性反應(yīng)，肝硬化4周之后又分化為M2型，參與肝纖維化乃至硬化的發(fā)生發(fā)展，因此減輕腸源性內(nèi)毒素血癥，抑制肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可以抑制肝臟炎性反應(yīng)，減少巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞分化，減緩肝硬化進(jìn)程。本項(xiàng)研究所獲結(jié)果僅涉獵冰山一角，深入開展肝臟疾病-腸源性內(nèi)毒素血癥-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-巨噬細(xì)胞極化途徑在肝纖維化乃至肝硬化中所起作用機(jī)制的研究，將有望對(duì)臨床防治產(chǎn)生積極影響。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of macrophage polarization during development of liver cirrhosis in rats

TIAN Xiao-xia1, ZHANG Hui-ying1, CHEN Yun-xia2, LI Xu-jiong3, WANG Li-min4, MENG Li2, LAI Li-na5, ZHAO Zhong-fu6, HAN De-wu7, CHENG Ji8

(1Department of Pathophysiology，2Department of Microbiology，3Department of Physiology，4Functional Integrative Laboratory，5Department of Pharmacology，6Institute of Hepatology, Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China;7Institute of Hepatology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China;8Research Center for Liver Disease, Keck School of Medicine, University of Southern California, Los Angeles, CA 90089, USA. E-mail: zhanghy2001@163.com

[ABSTRACT]AIM: To explore the state of macrophage polarization and its relation with intestinal endotoxemia-endoplasmic reticulum stress in the development of liver cirrhosis induced by multiple pathogenic factors in rats. METHODS: The male SD rats (n=36) were randomly divided into normal control group and liver cirrhosis model group, and sacrificed at the end of the 4th, 6th and 8th weeks. The rat model of liver cirrhosis was induced by multiple pathogenic factors. The levels of alanine aminotransferase (ALT), endotoxin, homocysteine (Hcy) in the plasma， and inducible nitric oxide synthase (iNOS), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), arginase-1 (Arg-1) and interleukin-10 (IL-10) in the liver tissues were detected by ELISA. Histopathological change of the liver was observed under microscope with the staining of hematoxylin and eosin (HE) and van Gieson (VG). The expression of glucose-regulated protein 78 (Grp78), nuclear factor-kappa B (NF-κB), interferon-regulatory factor 5 (IRF5), CD86, CD206 and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) at mRNA levels in the liver tissues were detected by the method of real-time fluorescence quantitative PCR.RESULTS: Compared with the corresponding normal control group, the levels of ALT, endotoxin, Hcy in the plasma and Grp78 mRNA in the liver tissues in liver cirrhosis model group were significantly and gradually increased (P<0.05). The mRNA expression of NF-κB, IRF5 and CD86, and the protein levels of iNOS, TNF-α and IL-6 in the liver tissues were significantly increased (P<0.05)， and they successively increased from the 4th week to the 6th week and decreased reversely at the 8th week. The mRNA expression of CD206, TGF-β1, Arg-1 and IL-10 in the liver tissues were significantly increased from the 6th week to the 8th week (P<0.05), and no significant difference at the 4th week was observed. The level of endotoxin in the plasma was correlated with the mRNA expression of Grp78 in the liver tissues (P<0.01). Both endotoxin in the plasma and Grp78 mRNA in the liver tissues were correlated with the mRNA expression of CD86 and CD206 in the liver tissues (P<0.01).CONCLUSION: The pathway of liver damage-intestinal endotoxemia-endoplasmic reticulum stress-macrophage polarization may be critical in the pathogenesis of liver cirrhosis induced by multiple pathogenic factors.

[KEY WORDS]Liver cirrhosis; Liver fibrosis; Macrophage; Endoplasmic reticulum stress; Endotoxin

[文章編號(hào)]1000- 4718(2016)05- 0880- 06

[收稿日期]2015- 12- 23[修回日期] 2016- 02- 19

*[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81070339)；山西省國際科技合作計(jì)劃(No. 2010081068)；山西省回國留學(xué)人員科研基金資助項(xiàng)目(No. 211-091)；山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任基金資助項(xiàng)目(No. 2010-09)；長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(No.2010-01)

通訊作者△Tel: 0355-3151441； E-mail： zhanghy2001@163.com

[中圖分類號(hào)]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.019

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