Rab7蛋白參與了BLP耐受巨噬細胞對細菌清除能力增強的過程*

趙舒祺，　蔡軍偉，　李　雪，　楊　勤，　黃　林，羅海華,　項　靜，　喬　敏，　姜　勇，　劉靖華△

(1貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004； 2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510515)

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Rab7蛋白參與了BLP耐受巨噬細胞對細菌清除能力增強的過程*

趙舒祺1,2，蔡軍偉2，李雪2，楊勤1△，黃林2，羅海華2,項靜2，喬敏2，姜勇2，劉靖華2△

(1貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，廣東 廣州 510515)

[摘要]目的： 探討Rab GTP酶是否參與了對細菌脂蛋白(BLP)耐受的骨髓誘導(dǎo)分化巨噬細胞(BMDMs)殺菌能力增強的過程。方法: 首先利用real-time PCR比較BLP耐受巨噬細胞和非耐受細胞中Rab5a、Rab5b、Rab7、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab32和Rab34的表達變化，篩選出水平升高的Rab7分子；進一步用real-time PCR和Western blot實驗證實Rab7的mRNA和蛋白表達是否在BLP耐受細胞感染大腸桿菌后繼續(xù)升高；接下來用RNAi技術(shù)下調(diào)BLP耐受巨噬細胞Rab7表達，觀察細胞對細菌的吞噬能力及殺滅能力的影響。結(jié)果: 在檢測的10個Rab GTP酶中， Rab7在BLP耐受BMDMs的mRNA水平升高，是非耐受細胞的1.4倍；進一步用real-time PCR和Western blot實驗證實Rab7的mRNA和蛋白表達在BLP耐受細胞感染大腸桿菌后，隨著時間延長均明顯升高；下調(diào)Rab7表達不影響B(tài)LP耐受巨噬細胞對細菌的吞噬能力，但是顯著降低其對細菌的殺滅能力。結(jié)論: BLP耐受通過上調(diào)巨噬細胞Rab7的表達，在增強巨噬細胞對細菌的殺滅過程中發(fā)揮重要作用。

[關(guān)鍵詞]細菌脂蛋白; 耐受； 細菌清除； Rab GTP酶； Rab7蛋白

細菌脂蛋白(bacterial lipoprotein，BLP)是革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌外膜中最豐富的蛋白，主要由生長或裂解的細菌釋放。BLP作為病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的一種，主要是通過Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)啟動天然免疫反應(yīng)。人們發(fā)現(xiàn)動物或體外培養(yǎng)的單核/巨噬細胞等在給予小劑量的BLP預(yù)處理后，對BLP再次刺激時無反應(yīng)或反應(yīng)性明顯降低，表現(xiàn)為炎癥因子分泌減少，機體炎癥損傷減輕，動物在致死劑量內(nèi)毒素再次刺激后的存活率提高，這一現(xiàn)象被稱為BLP耐受(BLP tolerance)[1]。BLP耐受是生物在長期進化過程中形成的一種保護性調(diào)節(jié)機制，是機體防御反應(yīng)的重要組成部分，目前對其機制尚不完全清楚。

在機體(細胞)對BLP的耐受過程中，突出的表現(xiàn)是機體(細胞)對細菌的清除能力增強[2]。機體清除細菌主要是通過包括巨噬細胞在內(nèi)的專職吞噬細胞完成的。吞噬細胞吞噬細菌后首先形成吞噬體，然后吞噬體與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，溶酶體內(nèi)的多種殺菌物質(zhì)和水解酶將細菌殺死并消化，這個過程被稱為吞噬體的成熟。從吞噬體形成到吞噬體與溶酶體融合需要有多種蛋白分子共同參與完成[3]?，F(xiàn)已知Rab GTP酶家族(Rab GTPase family)中的多個Rab分子在吞噬體等膜性細胞器的轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮了重要作用，它們相互協(xié)作共同完成從吞噬起始至細菌清除的整個過程[4]。

為了探討Rab分子是否參與了BLP耐受巨噬細胞對細菌清除能力增強的過程，本研究首先利用定量PCR篩選出在BLP耐受巨噬細胞中表達量高的Rab7，接下來用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Rab7分子的表達，觀察對BLP耐受巨噬細胞吞噬和殺滅細菌能力的影響。

材料和方法

1動物與細胞

雄性SPF級C57BL/6小鼠，8～10周齡，18～20 g，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK(粵)2011-0015。大腸桿菌(E. coli)菌株和轉(zhuǎn)染了pET-14b-GFP(green fluorescent protein)質(zhì)粒的大腸桿菌(GFP- E. coli)由本室保存；小鼠成纖維細胞L929(NCTC clone 929)購自中國科學(xué)院細胞庫。

2主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和OPTI-MEM培養(yǎng)基購自Gibco；TRIzol總RNA提取試劑、LB培養(yǎng)基購自Invitrogen；FastStart Universal SYBR Green Master購自TOYOBO；Rab7抗體和RIPA Buffer購自CST；羊抗兔IgG-HRP和β-actin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Super Signal West Pico化學(xué)發(fā)光底物購自Thermo；引物合成由廣州紐克利公司完成；siRNA合成由GenePharma完成。

3主要方法

3.1骨髓來源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs)的分離、培養(yǎng)及鑒定將L929細胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清，用0.22 μm濾器過濾后與含有20% FBS的DMEM按體積比1∶4比例混勻，配制成BMDMs完全培養(yǎng)基，備用。將8～10周齡、SPF級C57BL/6小鼠處死并置于75%乙醇中浸泡2～3 min后，暴露并分離股骨和脛骨，在超凈臺內(nèi)去除肌肉組織并暴露骨髓腔，用裝有DMEM的注射器沖洗骨髓腔，300×g離心10 min后收集沉淀；用BMDMs完全培養(yǎng)基充分吹打使其分散成單細胞懸液，將上述懸液平鋪至培養(yǎng)瓶中，放于37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第3天、第5天分別更換新的BMDMs完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第7天即可獲得分化成熟的BMDMs[5]。

3.2BLP耐受細胞的制備取分化成熟的BMDMs，給予 0.1 μg/L BLP預(yù)處理24 h，DPBS洗3遍，該部分細胞為BLP耐受的BMDMs；未經(jīng)BLP預(yù)處理的即為非耐受或者naive BMDMs。

3.3細胞吞噬細菌實驗將BMDMs 按每孔 2×105接種至 24 孔細胞培養(yǎng)板中，將GFP-E. coli按一定比例(細胞∶細菌=1∶30)加入 24 孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5% CO2共同孵育15、30 min后，冰DPBS洗5遍，用 0.25%胰蛋白酶消化，800 r/min離心4 min，棄去上清，用冰DPBS充分重懸制成單細胞懸液，流式細胞儀(BD FACSVerse)檢測，以GFP陽性細胞百分數(shù)表示BMDMs吞噬細菌的能力。

3.4殺菌實驗將BMDMs按每孔2×105分別接種至3塊24孔板中，標(biāo)記為1、2、3號，將活的大腸桿菌按一定比例(細胞∶細菌=1∶30)加入24孔細胞培養(yǎng)板中。37 ℃共孵育30 min后，棄去培養(yǎng)上清并用冰DPBS充分洗滌細胞3次，在1號板中加入含0.1% Triton X-100的無菌水(每孔500 μL)于冰上裂解細胞，在2、3號板中加入含10% FBS的DMEM并放入培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)30 min和60 min，與此同時加入慶大霉素(0.1 mg/L)，以殺滅細胞外的細菌。培養(yǎng)結(jié)束時同上用含0.1% Triton X-100的無菌水(每孔500 μL)于冰上裂解細胞，并將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。分別取100 μL以上所得裂解液按10的倍數(shù)梯度稀釋，再取不同層次稀釋液(10-1、10-2、10-3)各100 μL分別均勻涂布于LB平板上，放于37 ℃培養(yǎng)12 h，取出后選取菌落數(shù)量合適(30～300個)的平板計數(shù)并計算出該實驗組細胞內(nèi)所剩余的細菌數(shù)。1號板中所得值即為BMDMs在30 min吞噬的細菌總數(shù)，2號板中所得值為BMDMs發(fā)揮胞內(nèi)殺菌作用30 min后所剩余的細菌數(shù)，3號板中所得值為BMDMs發(fā)揮胞內(nèi)殺菌作用60 min后所剩余的細菌數(shù)，細胞殺菌能力使用細胞內(nèi)殺菌百分比表示，細胞內(nèi)殺菌百分比=2號板中所得值或3號板中所得值-1號板中所得值/1號板中所得值×100%。

3.5Real-time PCR實驗將BMDMs以每孔5×108接種于6孔板， 按上述方法制備naive和BLP耐受的BMDMs。用TRIzol收集并提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此為模板，用real-time PCR(SYBR-Green法)擴增以下10種與吞噬體成熟相關(guān)的Rab GTPases的mRNA水平：Rab5a(NM_025887.4)、Rab5b(NM_177411.4)、Rab7 (NM_001293652.1)、Rab9(NM_019773.2)、Rab9b(NM_176971.2)、Rab11a(NM_017382.5)、Rab11b(NM_008997.3)、Rab12(NM_024448.2)、Rab32(NM_026405.3)和Rab34(NM_001159482.1)。引物序列見表1。Real-time PCR循環(huán)在ABI 7500熒光定量PCR儀中進行，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt方法分析，實驗重復(fù)3次。

3.6Western blot實驗用RIPA裂解液裂解細胞并收集細胞總蛋白，用BCA法進行定量蛋白。取等量蛋白行12%的SDS-PAGE分離蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)5% BSA-TBST溶液室溫封閉2 h后， 1∶1 000稀釋anti-Rab7抗體并4 ℃孵育過夜，然后與1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP室溫孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光底物，利用Kodak IS4000R 圖像工作站(Carestream)進行化學(xué)發(fā)光檢測。

3.7BMDMs電轉(zhuǎn)染與干擾實驗取BLP耐受的BMDMs于15 mL離心管，加入4 mL OPTI-MEM培養(yǎng)基，吹打并重懸細胞團，重復(fù)以上洗滌過程3次后，將BMDMs重懸于OPTI-MEM培養(yǎng)基中計數(shù)后備用。取90 μL BMDMs(1×106)與 10 μL(2 μg) 靶向Rab7的siRNA(siRab7)或者無序siRNA(scrambled siRNA, ScrRNA)混合液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，按電轉(zhuǎn)染儀(NEPA21)操作要求設(shè)置相關(guān)參數(shù)，執(zhí)行相關(guān)電轉(zhuǎn)染程序，結(jié)束后取出電轉(zhuǎn)杯將細胞懸液輕輕吸出均勻鋪于含10% FBS的DMEM(已預(yù)熱)培養(yǎng)板中；重復(fù)以上步驟依次完成所有實驗組的轉(zhuǎn)染。siRab7有3對，序列分別如下: siRab7-1上游序列為 5’-CUCUCAUGAACCAGUAUGUTT-3’，下游序列為 5’-ACAUACUGGUUCAUGAGAGTT-3’； siRab7-2上游序列為 5’-GUGGACGACAGACUUGUUATT-3’，下游序列為 5’-UAACAAGUCUGUCGUCCACTT-3’； siRab7-3上游序列為 5’-CCAGACAAUUGCUCGGAAUTT-3’，下游序列為5’-AUUCCGAGCAAUUGUCUGGTT -3’。 Rab7的干擾效率分別用real-time PCR及Western blot實驗檢測，具體方法同前。選取3條siRNA中干擾效率最高的做后續(xù)實驗。

表1　引物序列

4統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，兩獨立樣本間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗(independent-sample t test)分析；多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，不同處理組間的兩兩比較行 SNK-q 檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

結(jié)果

1Naive和BLP耐受BMDMs對細菌吞噬能力和殺滅能力的比較

實驗發(fā)現(xiàn)，naive組細胞在感染細菌后15 min和30 min GFP陽性細胞百分數(shù)分別為(13.8±1.7)%和(39.8±5.4)%；而BLP耐受組GFP陽性細胞百分數(shù)分別是(25.7±1.7)%和(75.1±0.1)%，與naive組相比BLP耐受組的GFP陽性細胞百分數(shù)顯著增加(P<0.05)；殺菌實驗顯示，30 min 時，BLP 耐受的BMDMs殺滅大腸桿菌的百分比為naive的1.7倍，60 min時為naive的1.6倍(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.Enhanced bacterial uptake and intracellular bacterial killing in BLP-tolerized BMDMs. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs naive.

圖1Naive和BLP耐受BMDMs對細菌吞噬能力和殺滅能力的比較

2Rab分子在BLP耐受BMDMs中的表達

Real-time PCR結(jié)果顯示，與naive組相比，BLP耐受的BMDMs中Rab7表達上調(diào)，是非耐受細胞的1.4倍(P<0.05)，其余Rab分子，包括Rab5a、Rab5b、Rab9、Rab9b、Rab11a、Rab11b、Rab12、Rab32和Rab34的表達減少(P<0.05)，見圖2。

3E.coli刺激對Rab7 mRNA與蛋白表達的影響

結(jié)果顯示，無論是naive細胞還是BLP耐受的細胞在受到E. coli感染后Rab7的mRNA水平均升高，但是BLP耐受BMDMs Rab7的mRNA水平顯著高于naive的BMDMs(P<0.05)；BLP 耐受后 Rab7的蛋白水平相對于naive的BMDMs 明顯增加；隨著大腸桿菌刺激時間的延長，naive BMDMs 內(nèi) Rab7 的表達水平增加，而 BLP 耐受的 BMDMs 內(nèi) Rab7 的表達則一直處于較高水平，見圖3。

Figure 2.The mRNA levels of Rab GTPases in BLP-tolerized BMDMs compared with naive. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs naive.

圖2Rab GTP酶在BLP耐受BMDMs中的表達

4下調(diào)Rab7的表達對BLP耐受細胞細菌吞噬能力的影響

電轉(zhuǎn)染Rab7特異性siRNA下調(diào)Rab7的表達，real-time PCR結(jié)果顯示siRab7-1、siRab7-2和siRab7-3的mRNA水平干擾效率達70%～90%(P<0.05)；Western blot結(jié)果顯示Rab7蛋白水平明顯下調(diào)。吞菌實驗表明，下調(diào)BMDMs中Rab7的表達后，干擾組與對照組相比GFP陽性細胞百分數(shù)無明顯差異，提示干擾Rab7蛋白對細菌的吞噬沒有明顯影響,見圖4。

Figure 3.The expression of Rab7 in naive or BLP-tolerized BMDMs treated with heat-killed E. coli at different time points detected by real-time PCR and Western blot. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs naive.

圖3大腸桿菌刺激naive和BLP耐受BMDMs中Rab7的mRNA與蛋白表達水平變化

Figure 4.Rab7 down-regulation had no influence on bacterial engulfment in BLP-tolerized BMDMs. A: detection ofRab7 interference efficiency by real-time PCR; B: detection of efficiency ofRab7 interference by Western blot; C: detection of bacterial engulfment by flow cytometry; D: positive cells of bacterial engulfment.

圖4下調(diào)Rab7的表達對BLP耐受細胞細菌吞噬能力的影響

5下調(diào)Rab7的表達對BLP耐受細胞細菌殺滅能力的影響

下調(diào)Rab7蛋白的表達后，殺菌實驗顯示，30 min 時對照組BMDMs殺滅大腸桿菌的百分比為干擾組的1.6倍，60 min時為干擾組的1.3倍，表明干擾Rab7后，BMDMs對細菌的殺滅能力均明顯降低(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.Rab7 down-regulation led to the inhibition of intracellular bacterial killing in BLP-tolerized BMDMs. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs ScrRNA.

圖5下調(diào)Rab7的表達對BLP耐受細胞細菌殺滅能力的影響

討論

機體對病原微生物的毒性成分如BLP、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)等的耐受現(xiàn)象是在探索膿毒性休克的發(fā)生機制與治療策略過程中發(fā)現(xiàn)的，是生物在長期進化過程中形成的一種保護性調(diào)節(jié)機制[6]。研究發(fā)現(xiàn)BLP耐受不僅可以防止BLP刺激而且還可以通過交叉耐受防止LPS刺激引起的內(nèi)毒素休克。更重要的是，BLP耐受還能降低動物再次感染大劑量細菌或者盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)所引起的死亡率，而內(nèi)毒素耐受對細菌感染或盲腸結(jié)扎穿刺所致的膿毒癥并不具有保護作用[7]。顯然，BLP耐受與LPS耐受既有相同之處，也有很大不同。探討B(tài)LP耐受的機制不僅有助于了解機體在抗感染過程中的適應(yīng)性應(yīng)答機制，加深我們對膿毒性休克發(fā)生機制的認識，而且有可能為膿毒性休克的防治提供新的思路。

目前，有關(guān)BLP耐受機制的探討主要集中在BLP介導(dǎo)的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改變方面。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細胞再次受到BLP攻擊時，介導(dǎo)BLP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的多個信號分子發(fā)生了改變，如TLR2表達水平下調(diào)、MyD88結(jié)合IRAK1的能力下降、MAPK磷酸化程度降低、NF-κB的活性受抑制等，提示上述信號事件的改變可能是BLP耐受時細胞(機體)炎癥介質(zhì)釋放減少的主要原因[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予小鼠或巨噬細胞(Raw264.7或THP1)小劑量BLP預(yù)處理后，再給予細菌感染，發(fā)現(xiàn)機體或細胞促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-6和IL-1β釋放減少的同時，機體(細胞)對細菌的清除能力增加[9]。這一研究結(jié)果解釋了BLP耐受能保護動物抵抗引起的膿毒性休克的機制，但BLP所引起的機體(細胞)對細菌清除能力增加的具體機制還有待進一步闡明。目前關(guān)于BLP耐受巨噬細胞對細菌清除能力增強的機制研究還不多。巨噬細胞對細菌清除能力主要包括2個部分：對細菌的吞噬能力以及對細菌的殺滅能力。Wang等[10]發(fā)現(xiàn)BLP耐受的中性粒細胞和腹腔巨噬細胞中補體受體3(complement receptor type 3，CR3)與Fc段γ受體III/II(FcγIII/IIR)表達上調(diào)，推測這些與抗菌能力相關(guān)受體的增加可能是BLP耐受機體(細胞)對細菌清除能力增強的主要原因。但是，由于上述受體主要參與細胞對細菌的吞噬過程，所以不能解釋為什么BLP耐受巨噬細胞殺菌能力也同時增強的機制。那么細菌進入機體(細胞)是如何被殺滅的呢？吞噬過程開始的時候，首先是吞噬細胞胞膜內(nèi)陷包裹吞噬物而形成吞噬體，但它并不具備殺滅和降解病原微生物的能力，必須經(jīng)過一系列的生物學(xué)過程實現(xiàn)與溶酶體的融合，成為含有高活性氧化酶、酸化酶和水解酶的吞噬溶酶體，才具備了對吞噬物的清除能力[11-12]。在吞噬體與溶酶體融合為吞噬溶酶體的過程中，需要Rab GTP酶參與完成。研究表明，Rab GTP酶家族中的Rab5、Rab7、Rab10、Rab34等多個成員在吞噬體的轉(zhuǎn)運和與溶酶體的融合過程中發(fā)揮了重要作用，并且它們分工明確、順序出現(xiàn)完成對吞噬體轉(zhuǎn)運全過程的調(diào)控[13]。

為了明確Rab GTP酶是否參與了BLP耐受過程中細胞(機體)對細菌清除能力的增強，本研究首先檢測了10種與吞噬體成熟轉(zhuǎn)運相關(guān)的Rab分子，篩選出在BLP耐受后mRNA水平增加的Rab7，并得到了進一步的實驗驗證。以往的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨噬細胞吞噬細菌成為包含有病原體的囊泡吞噬溶酶體時，Rab7會被募集到這些囊泡上，并與溶酶體有較好的共定位，提示Rab7是調(diào)控吞噬體成熟的關(guān)鍵分子；進一步實驗證明，當(dāng)缺失或突變Rab7時巨噬細胞吞噬體的成熟過程延遲，清除細菌能力降低[14-15]。Rab7在BLP耐受后表達上調(diào)，提示其可能參與了BLP耐受過程中BMDMs對細菌清除能力的增強。為了證明這個推測，接下來我們用RNAi技術(shù)下調(diào)了Rab7的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rab7的表達水平降低后，并不影響B(tài)LP耐受細胞對細菌的吞噬能力，但是明顯降低耐受細胞對細菌的殺滅能力，提示BLP耐受BMDMs清除細菌能力增強可能與Rab7分子表達水平上調(diào)有關(guān)，機體(細胞)通過上調(diào)Rab7分子，加速吞噬體與溶酶體的融合，增強對細菌的殺滅。BLP耐受后其它幾個Rab分子的mRNA表達下調(diào)可能是機體的一種適應(yīng)性調(diào)控機制，目的可能是確保相關(guān)分子如Rab7的表達。本研究結(jié)果不僅有助于了解機體在抗感染過程中的適應(yīng)性應(yīng)答機制，而且為膿毒性休克的防治提供新的思路。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Rab7 is involved in enhanced bacterial clearance by BLP-tolerized macrophages

ZHAO Shu-qi1, 2, CAI Jun-wei2, LI Xue2, YANG Qin1, HUANG Lin2, LUO Hai-hua2, XIANG Jing2, QIAO Min2, JIANG Yong2, LIU Jing-hua2

(1DepartmentofPathophysiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofBasicMedicalScience,SouthernMedicalUniversity,KeyLaboratoryforFunctionalProteomicsofGuangdongProvince,Guangzhou510515, China. E-mail: liujhua@fimmu.com; qinyang@gmc.edu.an)

[ABSTRACT]AIM: To explore whether Rab GTPases are involved in enhanced bacterial clearance by bacterial lipoprotein (BLP)-tolerized macrophages (bone marrow-derived macrophages, BMDMs).METHODS: Real-time PCR was used to compare the mRNA levels of Rab5a, Rab5b, Rab7, Rab9, Rab9b, Rab11a, Rab11b, Rab12, Rab32 and Rab34 between the naive BMDMs and the BLP-tolerized BMDMs. The up-regulation of Rab7 was further confirmed in BLP-tolerized BMDMs infected with E. coli by real-time PCR and Western blot. Following down-regulating the expression of Rab7 using RNA interference (RNAi), the bacterial uptake and intracellular bacterial killing of BLP-tolerized BMDMs treated with E. coli were detected.RESULTS: The mRNA level of Rab7 was significantly increased in BLP-tolerized BMDMs, which was 1.4 folds as high as that in the naive BMDMs, and the mRNA and protein levels of Rab7 in BLP-tolerized BMDMs stimulated with bacteria were further confirmed to be increased. Down-regulating the expression of Rab7 had no effect on phagocytosis of BLP-tolerized BMDMs for bacteria, but the intracellular bacterial killing ability was significantly attenuated. CONCLUSION: BLP tolerance plays an important role during intracellular bacterial killing in macrophages through up-regulating the expression of Rab7.

[KEY WORDS]Bacterial lipoprotein; Tolerance; Bacterial clearance; Rab GTPases; Rab7 protein

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0900- 07

[收稿日期]2016- 01- 29[修回日期] 2016- 03- 03

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81272149; No. 81471901)

通訊作者△劉靖華 Tel： 020-61648172-810； E-mail: liujhua@fimmu.com; 楊勤 Tel： 0851-6908489; E-mail： qinyang@gmc.edu.cn

[中圖分類號]R392.12

[文獻標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.022

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