組蛋白化學(xué)修飾改變對c-Myb結(jié)合的影響及其在職業(yè)性苯中毒患者造血損傷中的作用*

施益芬，　陳晶晶，　俞　康

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科， 浙江 溫州 325015)

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組蛋白化學(xué)修飾改變對c-Myb結(jié)合的影響及其在職業(yè)性苯中毒患者造血損傷中的作用*

施益芬，陳晶晶，俞康△

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科， 浙江 溫州 325015)

[摘要]目的： 研究職業(yè)性苯中毒造血損傷患者中與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα啟動子調(diào)控因子c-Myb結(jié)合的組蛋白化學(xué)修飾改變, 證實組蛋白乙?；揎椝礁淖冊诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮一定的作用。方法: 25例職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者為病例組，25例正常人為對照組，提取骨髓單個核細(xì)胞，用染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)探討與c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；图谆降母淖?，RT-PCR法檢測c-Myb的mRNA表達(dá)水平，組蛋白去乙?；?HDAC)試劑盒檢測HDAC活性的變化。結(jié)果: 與正常對照組相比，職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者c-Myb與乙酰化組蛋白H4、H3結(jié)合的水平下降(P<0.01), 而與甲基化組蛋白H3K4和H3K9結(jié)合的水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。與正常對照組相比，職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者c-Myb的mRNA表達(dá)水平降低，HDAC活性明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)論: 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱα啟動子調(diào)控因子c-Myb可能通過組蛋白乙酰化修飾的改變在職業(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮作用。

[關(guān)鍵詞]苯； c-Myb； 組蛋白乙?；?； 組蛋白甲基化； 染色質(zhì)免疫沉淀； 組蛋白去乙酰化酶

苯是一種具有血液毒性和遺傳毒性的重要化工原料。急慢性苯中毒病例報道屢見不鮮。衛(wèi)生部2010年職業(yè)病防治工作和2011年重點(diǎn)工作情況通報中，苯中毒均位列慢性職業(yè)中毒前3位。對造血系統(tǒng)損害的表現(xiàn)是慢性苯中毒的主要特征，長期過量接觸苯可以導(dǎo)致白細(xì)胞和血小板減少、再生障礙性貧血和白血病[1-2]。2012年，國際癌癥研究所重申苯為人類致癌物，能導(dǎo)致急性白血病、骨髓增生異常綜合征、淋巴瘤等。

苯所致造血毒性和白血病的分子機(jī)制尚未被闡明。拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoismerase，TOPO)的研究近年來受到關(guān)注[3-4]。本課題組的前期研究顯示，苯及其代謝物影響骨髓單個核細(xì)胞TOPOⅡα啟動子組蛋白的化學(xué)修飾改變，導(dǎo)致TOPOⅡα表達(dá)及活性下降可能參與了苯所致的造血毒性[3, 5-6]。c-Myb是TOPOⅡα啟動子的重要調(diào)控因子，能明顯增加TOPOⅡα的表達(dá)[7]。本研究探討職業(yè)性苯中毒造血損傷中c-Myb的改變及與組蛋白化學(xué)修飾變化的關(guān)系，通過檢測職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者組蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)活性的改變，證實c-Myb可能通過組蛋白乙?；揎椀母淖冊诼殬I(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮作用，為進(jìn)一步認(rèn)識苯中毒造血損傷的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

材料和方法

1對象

實驗組的骨髓標(biāo)本25份取自職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者，男性9例，女性16例，平均年齡32.5歲(20～56歲)，平均觸苯時間≥6月(6月～5年)。工作環(huán)境中平均苯濃度為87mg/m3(50～1 000mg/m3)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過美國政府工業(yè)衛(wèi)生專家協(xié)會規(guī)定的最高時間加權(quán)平均容許濃度(permissibleconcentration-timeweightedaverage,PC-TWA)及短時間接觸容許濃度(pemissibleconcentration-shorttermexposurelimit,PC-STEL)。對照組的骨髓標(biāo)本25份取自年齡、吸煙、飲酒習(xí)慣等匹配的健康志愿者，男性11例，女性14例；平均年齡33.8歲(19～58歲)。苯中毒再生障礙性貧血患者根據(jù)GBZ68-2002《職業(yè)性苯中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)》診斷。本研究已通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會的認(rèn)證。所有骨髓捐獻(xiàn)者均簽署知情同意書。

2主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco)；淋巴細(xì)胞分離液(天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心)；染色質(zhì)免疫沉淀(chromatinimmunoprecipiation，ChIP) 分析試劑盒、抗乙?；M蛋白H3抗體、抗乙酰化組蛋白H4抗體、抗二甲基組蛋白H3(K9)抗體和抗三甲基組蛋白H3(K4)抗體(Upstate)；體積分?jǐn)?shù)為37%的甲醛(Sigma)；蛋白酶抑制劑(Calbiochem)；TRIzol和PlatinumRPCRSuperMix(Invitrogen)；RT-PCR試劑盒、GeneRulerTM50bpDNALadder(MBIFermentas)；核蛋白提取試劑盒(Thermo)；HDAC活性測定試劑盒(Millipore)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

3主要方法

3.1骨髓單核細(xì)胞懸液的制備取職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者及健康志愿獻(xiàn)髓員的骨髓5mL，肝素(5×104U/L)抗凝，骨髓標(biāo)本與RPMI-1640液1∶1混勻后，淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法(2 000r/min離心10min)分離單個核細(xì)胞層，制備成單個核細(xì)胞懸液。臺盼蘭染色檢測活細(xì)胞率，要求拒染率達(dá)95%以上。骨髓單個核細(xì)胞懸浮培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×109/L。

3.2ChIP檢測ChIP檢測按ChIP分析試劑盒產(chǎn)品說明書進(jìn)行。分別在培養(yǎng)液中直接加入37 %的甲醛，使最終濃度為1 %，37 ℃固定10min, 以交聯(lián)組蛋白和DNA。加入含有蛋白酶抑制劑的SDS細(xì)胞裂解液200μL重懸細(xì)胞, 冰上孵育10min，用超聲將DNA打碎成250～1 000bp(此處提取的DNA片段命名為inputDNA)。用特異性抗體[抗乙?；M蛋白H3抗體、抗乙?；M蛋白H4抗體、抗二甲基組蛋白H3(K9)抗體、抗三甲基組蛋白H3(K4)抗體]沉淀DNA-蛋白復(fù)合物, 用蛋白A瓊脂吸附復(fù)合物, 低鹽免疫復(fù)合體洗液、高鹽免疫復(fù)合體洗液、LiCl免疫復(fù)合體洗液、TE緩沖液洗去非特異性吸附后, 加入5moL/LNaCl65 ℃置4h以解除蛋白/DNA交聯(lián)，沉淀的DNA片段-20 ℃保存?zhèn)溆?此DNA片段命名為ChIPedDNA)。ChIPedDNA通過PCR法對目標(biāo)基因(c-Myb)進(jìn)行分析。

3.3c-MybDNA水平的檢測針對c-Myb的DNA序列設(shè)計引物(表1)。將各組得到的ChIPedDNA分別加入上述引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為:PCRSuperMix12μL，調(diào)控因子上游引物 0.5μL，調(diào)控因子下游引物 0.5μL，上述制得的模板DNA2μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5min；94 ℃ 30s，62 ℃ 30s，72 ℃ 1min，35個循環(huán)；72 ℃10min，4 ℃ 30min。反應(yīng)完成后用1.8%瓊脂糖凝膠電泳并照相，QuantityOne圖像分析系統(tǒng)分析實驗結(jié)果。c-Myb水平變化=(IP苯中毒組/Input苯中毒組)/(IP對照組/Input對照組)。

3.4c-Myb的mRNA水平檢測(1)RNA的提取及cDNA合成：采用TRIzoL法提取總RNA，紫外分光光度計測RNA的純度及濃度(A260/A280居于1.8～2.0之間認(rèn)為合格)。采用隨機(jī)引物法合成cDNA。(2)針對撲異構(gòu)酶Ⅱα啟動子調(diào)控因子c-Myb的mRNA序列設(shè)計引物，引物與GenBank基因序列核對無誤；采用β2-微球蛋白(β2-microglobulin，β2-MG)作為內(nèi)參照(表1)。(3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:PCRSuperMix12μL，上游引物 0.5μL，下游引物 0.5μL，cDNA2μL。反應(yīng)條件為:95 ℃ 5min；95 ℃ 30s，53 ℃(c-Myb)或52 ℃(β2-MG) 30s，72 ℃ 30s，35個循環(huán);72 ℃10min。經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后，QuantityOne圖像分析系統(tǒng)分析實驗結(jié)果。以目標(biāo)基因與β2-MG擴(kuò)增產(chǎn)物吸光度值的比值計算表達(dá)水平。

表1　引物序列

3.5核蛋白的提取分別收集實驗組及對照組的骨髓單個核細(xì)胞，等滲PBS液洗2遍；按照Thermo核蛋白提取試劑盒說明書進(jìn)行抽提，骨髓單個核細(xì)胞離心沉淀后，依次加入CERⅠ液、CERⅡ液劇烈振蕩、冰浴后離心，棄上清，加NER液劇烈振蕩、冰浴后離心，上清液系胞核蛋白。提取的核蛋白用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度后-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.6HDAC活性測定按照HDAC活性測定試劑盒說明書進(jìn)行，使用試劑盒所配套的96孔板，各孔加入 2×HDAC assay buffer 10 μL，各待測樣品、陰性對照和陽性對照各20 μL，吹打混勻后加入4 mmoL/L HDAC substrate 10 μL，37 ℃孵育60～70 min；稀釋activator solution 液20 μL，37 ℃放置10～20 min。在酶標(biāo)儀405 nm波長處讀取吸光度值(A值)。實驗重復(fù)3次，設(shè)復(fù)孔3個，取平均值為最終結(jié)果。HDAC的活性=(實驗組A值-空白對照A值)/蛋白含量(μg)。

4統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，t檢驗來確定兩組之間的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1苯中毒對c-Myb結(jié)合的組蛋白化學(xué)修飾改變的影響

1.1與乙?；M蛋白H4結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與乙?；M蛋白H4結(jié)合的水平較正常對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1、3。

1.2與乙?；M蛋白H3結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與乙?；M蛋白H3結(jié)合的水平較正常對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖1、3。

1.3與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與甲基化組蛋白H3K4結(jié)合的水平較正常對照組無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2、3。

1.4與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的c-Myb水平臨床苯中毒病例組c-Myb與甲基化組蛋白H3K9結(jié)合的水平較正常對照組無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2、3。

2苯中毒對c-Myb mRNA表達(dá)水平的影響

臨床苯中毒病例組c-Myb的mRNA表達(dá)水平較對照組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖4。

Figure 1.The levels of c-Myb binding to acetylated histone detected by ChIP analysis. M: marker; 1: input control; 2: IP control; 3: input benzene; 4: IP benzene.

圖1乙酰化組蛋白結(jié)合的c-Myb

Figure 2.The levels of c-Myb binding to methylated histone detected by ChIP analysis. M: marker; 1: input control; 2: IP control; 3: input benzene; 4: IP benzene.

圖2甲基化組蛋白結(jié)合的c-Myb

Figure 3.Changes of c-Myb binding levels to histones modified by acetylation and methylation. Mean±SD. n=5.**P<0.01 vs control.

圖3c-Myb 結(jié)合的組蛋白乙?；图谆揎椝降淖兓?/p>

Figure 4.The mRNA expression of c-Myb detected by RT-PCR. Mean±SD. n=5.*P<0.05 vs control.

圖4RT-PCR檢測c-Myb 的mRNA水平

3苯中毒對HDAC活性的影響

臨床苯中毒病例組HDAC活性較對照組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖5。

Figure 5.HDAC activity of bone marrow mononuclear cells. Mean±SD.n=10.*P<0.05 vs control.

圖5骨髓單個核細(xì)胞HDAC活性

討論

近年來，苯所致造血毒性已得到廣泛的重視，但其毒性機(jī)制仍遠(yuǎn)未闡明，脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞凋亡、DNA損傷、細(xì)胞微環(huán)境受損、免疫異常均是其可能機(jī)制之一[8-10]。自1996年Frantz等首次提出苯的活性代謝產(chǎn)物抑制TOPOⅡ活性開始，TOPO在苯所致造血毒性中的作用日漸明確[3-4]。

表觀基因機(jī)制在腫瘤的發(fā)生機(jī)制中有著與基因突變機(jī)制同等重要的作用。組蛋白的共價修飾是表觀基因機(jī)制的重要內(nèi)容, 參與調(diào)控多種生物學(xué)事件，主要包括組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、DNA甲基化和染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)中其它成分的修飾。組蛋白乙?；?、甲基化可直接影響一系列細(xì)胞核內(nèi)生物過程，包括基因轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和染色體組裝，調(diào)控基因的表達(dá)[11]。組蛋白乙?；c基因轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)[12]，去乙酰化常見基因轉(zhuǎn)錄沉默[13]，而組蛋白甲基化的功能則因氨基酸殘基類別和它們在組蛋白尾端的位置不同而不盡相同[12]，組蛋白H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活化相關(guān)，而組蛋白H3K9甲基化常見基因轉(zhuǎn)錄沉默[14]。

ChIP技術(shù)是一種在體內(nèi)研究DNA和蛋白質(zhì)相互作用的方法，能夠較真實地反映體內(nèi)染色質(zhì)與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合情況，被大量應(yīng)用于其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子如CRE結(jié)合蛋白[15]及c-Myc等對其靶基因表達(dá)的調(diào)控分析。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)苯所致造血毒性與TOPOⅡα的表達(dá)(含量、活性)下降相關(guān)，而TOPOⅡα啟動子組蛋白乙?；?、甲基化化學(xué)修飾改變是其表達(dá)下降的機(jī)制之一[3,5-6]。在此基礎(chǔ)上，本課題組借助ChIP技術(shù)進(jìn)一步研究TOPOⅡα啟動子調(diào)控因子組蛋白化學(xué)修飾改變在職業(yè)性苯中毒造血損傷機(jī)制中發(fā)揮的作用[16]。

c-Myb是TOPOⅡα啟動子重要的調(diào)控因子，在TOPOⅡα啟動子近端的5’區(qū)存在c-Myb的結(jié)合位點(diǎn)[17]，c-Myb通過與c-Myb結(jié)合位點(diǎn)(-16至-11位點(diǎn))結(jié)合，激活TOPOⅡα的表達(dá)[7]。我們針對c-Myb設(shè)計了相應(yīng)的適合ChIP后產(chǎn)物的引物，來觀察其水平的改變。研究發(fā)現(xiàn)，職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；揎椝浇档?，c-Myb的mRNA表達(dá)水平下降，提示c-Myb結(jié)合的組蛋白乙酰化水平的改變可能參與了TOPOⅡα表達(dá)的降低。

組蛋白乙?；绞且粋€動態(tài)平衡狀態(tài)，由HDAC和組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(histoneacetyltransferases，HAT)共同調(diào)控。Sonnemann等[18]通過臨床收集各種血液腫瘤標(biāo)本，進(jìn)行HDAC活性測定，研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)低乙?；脚cHDAC活性增高有關(guān)，而與HAT活性降低關(guān)系不大。因此，本實驗進(jìn)行了HDAC活性檢測。研究結(jié)果顯示職業(yè)性苯中毒再生障礙性貧血患者HADC活性較對照組明顯升高，提示苯及其代謝產(chǎn)物不僅影響染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)及后續(xù)的基因表達(dá)，也切實影響了表觀遺傳學(xué)調(diào)控酶的活性，與組蛋白化學(xué)修飾改變平行，為c-Myb結(jié)合的組蛋白乙?；礁淖儏⑴cTOPOⅡα表達(dá)減低提供了一定的依據(jù)，極大地支持并論證了本課題組提出的組蛋白化學(xué)修飾水平改變在職業(yè)性苯中毒造血損傷中發(fā)揮作用的假說。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅森)

Effects of c-Myb binding levels to histones modified by acetylation and methylation on hematopoietic damnification in occupational benzene poisoning patients

SHI Yi-fen, CHEN Jing-jing, YU Kang

(Department of Hematology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325015, China. E-mail: yukang62@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of histone modification in the changes of topoisomerase Ⅱα promoter regulatory factor c-Myb binding to histone in the occupational benzene poisoning patients with hematopoietic damnification.METHODS: The bone marrow samples were collected from 25 aplastic anemia patients caused by occupational benzene poisoning and 25 healthy controls. The binding levels of c-Myb to the histone with acetylation or methylation were detected by the technique of chromatin immunoprecipitation (ChIP). The mRNA expression of c-Myb was detected by RT-PCR. The activity of histone deacetylase (HDAC) was measured by the colorimetric HDAC assay kit.RESULTS: Compared with the controls, the binding levels of c-Myb to the acetylated histone H4 and acetylated histone H3 in the occupational benzene poisoning patients decreased (P<0.01), while those to the methylated histone H3K4 and methylated histone H3K9 didn’t obviously change. The mRNA expression of c-Myb in the occupational benzene poisoning patients was significantly down-regulated compared with the controls (P<0.05).The HDAC activity of the bone marrow mononuclear cells in the occupational benzene poisoning patients increased obviously (P<0.05).CONCLUSION: Topoisomerase Ⅱα promoter regulatory factor c-Myb may play an important role in the hematopoietic toxicities of benzene through histone acetylation modification.

[KEY WORDS]Benzene; c-Myb; Histone acetylation; Histone methylation; Chromatin immunoprecipitation; Histone deacetylase

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0907- 05

[收稿日期]2016- 01- 18[修回日期] 2016- 03- 02

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81172613；No. 81502793)；溫州市科委基金資助項目(No. Y20120004； No. Y20150034)

通訊作者△Tel: 0577-55579489； E-mail: yukang62@126.com

[中圖分類號]R135.1； R363.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.023

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net