葛根素預(yù)處理上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷*

黃　華，　丁　菁，　粟　鳳，　張　倩，　陸德琴

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

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葛根素預(yù)處理上調(diào)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)減輕人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷*

黃華，丁菁，粟鳳，張倩，陸德琴△

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室，貴州 貴陽 550025)

[摘要]目的： 探討葛根素(puerarin，PUE)預(yù)處理對缺氧/復(fù)氧(hypoxia reoxygenation，H/R)損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的保護(hù)作用。方法: HUVECs隨機(jī)分為正常對照(control)組、H/R組、單純PUE組和PUE+H/R組(1.0×10-3mol/L PUE預(yù)處理24 h后進(jìn)行H/R)。采用Western blot方法檢測內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白的表達(dá)，化學(xué)比色法檢測組成型一氧化氮合酶(cNOS)的活性，TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡。此外，在PUE預(yù)處理前使用ERK蛋白激酶抑制劑U0126(1.0×10-5mol/L)或PI3K/Akt蛋白激酶抑制劑LY294002(5.0×10-5mol/L)處理細(xì)胞1 h，再進(jìn)行H/R。結(jié)果: 與control組相比，H/R組的eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，PUE預(yù)處理上調(diào)eNOS蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，該上調(diào)作用均可被U0126及LY294002抑制(P<0.05)；與control組相比，H/R組的cNOS活力下降(P<0.05)，PUE預(yù)處理組的cNOS活力增加(P<0.05)；與control組相比，H/R組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著增大(P<0.01)，PUE預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡指數(shù)減小(P<0.01)。結(jié)論: H/R可使HUVECs受損傷，eNOS蛋白表達(dá)及活性降低，細(xì)胞凋亡增加。PUE預(yù)處理可通過ERK1/2信號通路和PI3K/Akt信號通路上調(diào)HUVECs的eNOS蛋白表達(dá)，增強(qiáng)eNOS活性，減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]葛根素； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 缺氧/復(fù)氧； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶

缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury，IRI)廣泛存在于嚴(yán)重創(chuàng)傷與缺血性疾病治療后。研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷是IRI早期的病理改變和始動因素，在IRI發(fā)生、發(fā)展的過程中起著重要的作用。生理情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一氧化氮(nitric oxide，NO)在調(diào)節(jié)血管舒縮、凝血和纖溶，以及防止氧自由基損傷等方面起著重要作用。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是生成NO的關(guān)鍵限速酶，血管系統(tǒng)中的NO主要來源于內(nèi)皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)。已公認(rèn)eNOS/NO功能受損是內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙的一個重要表現(xiàn)，因此eNOS/NO常作為反映血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要指標(biāo)之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)葛根素(puerarin，PUE)具有擴(kuò)張冠狀動脈、抗缺血再灌注損傷、改善血液流變學(xué)等心血管保護(hù)等作用[2]。然而目前有關(guān)PUE對內(nèi)皮細(xì)胞IRI時eNOS功能的影響報道較少。本研究使用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，建立體外培養(yǎng)細(xì)胞H/R損傷模型模擬細(xì)胞IRI，探討PUE預(yù)處理減輕內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)機(jī)制。

材料和方法

1實驗試劑及儀器

HUVECs由貴州醫(yī)科大學(xué)曾柱教授惠贈；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、無酚紅高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco)；低糖DMEM培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、青-鏈霉素(HyClone)；葛根素注射液(成都天臺山制藥有限公司)；NOS活性(分型)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；PVDF蛋白雜交膜(Millipore)；ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒(Thermo)；TUNEL凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物公司)；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)抑制劑U0126、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)抑制劑LY294002(Sigma);兔抗鼠eNOS抗體、兔抗鼠β-tubulin抗體及辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔 Ⅱ 抗(Santa Cruz)；兔抗人 Ⅷ 因子相關(guān)抗原抗體、兔抗人CD34抗體(北京博奧森生物公司)；SABC法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)；BX41顯微鏡(OLYMPUS)。

2主要方法

2.1HUVECs細(xì)胞的培養(yǎng)HUVECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h換液 1 次，當(dāng)細(xì)胞生長接近于80%～90%時，用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，傳代。實驗用傳10代以內(nèi)的細(xì)胞。

2.2細(xì)胞鑒定細(xì)胞爬片后，放入 6 孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至50%時，用無血清培養(yǎng)基靜止12h后，PBS洗滌3次，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體和兔抗人CD34抗體作為Ⅰ抗，按1∶100比例稀釋，SABC法進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。PBS孵育作為陰性對照。鏡下胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。200倍顯微鏡下隨機(jī)取5個視野，計算陽性細(xì)胞率(%)=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.3缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷細(xì)胞模型制備參照文獻(xiàn)[3]，將含體積分?jǐn)?shù)為99.99%的高純氮?dú)饨?jīng)過濾后通入無FBS的低糖DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，調(diào)節(jié)氣體流速為6～8 L/min，通氣2 min，后將上述低糖培養(yǎng)基加入培養(yǎng)瓶內(nèi)，再向培養(yǎng)瓶內(nèi)充氮?dú)猓魉贋?～8 L/min，時間5 min。旋緊培養(yǎng)瓶瓶蓋，封口膠密封瓶口，放入37 ℃孵箱中分別缺氧培養(yǎng)2 h(H2)、4 h(H4)和8 h(H8)。缺氧培養(yǎng)結(jié)束后，所有細(xì)胞更換含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基后，繼續(xù)在常氧條件下(37℃、5% CO2)復(fù)氧培養(yǎng)4 h(R4)。

2.4實驗分組待HUVECs生長融合達(dá)70%～80%左右時，使用無FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基靜止12 h。(1)缺氧/復(fù)氧和PUE預(yù)處理實驗：HUVECs隨機(jī)分為control組、H2/R4組、H4/R4組和H8/R4組，在預(yù)處理實驗中，根據(jù)文獻(xiàn)[4-5]報道的具有明顯內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的PUE劑量，control組和H/R各組均預(yù)先用終濃度1.0×10-3mol/L的PUE預(yù)處理24 h。(2)特異性蛋白激酶抑制劑實驗：取H4/R4組進(jìn)行實驗，抑制劑組在PUE預(yù)處理前先使用ERK1/2抑制劑U0126(終濃度1.0×10-5mol/L)或PI3K/Akt抑制劑LY294002(終濃度5.0×10-5mol/L)預(yù)處理1 h，并分別設(shè)立抑制劑單純用藥和溶媒對照。細(xì)胞隨機(jī)分為control組、H4/R4組、PUE組、PUE+H4/R4組、U0126+PUE+H4/R4、U0126+PUE組、U0126組、LY294002+PUE+H4/R4組、LY294002+PUE組、LY294002組和溶媒對照DMSO組。

2.5Western blot檢測蛋白水平分別收集各組細(xì)胞，加入蛋白裂解液，4 ℃裂解，離心后取上清，BCA法測定蛋白濃度，余蛋白變性后用SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，TBST洗膜10 min×3次，按相應(yīng) Ⅰ 抗比例稀釋(eNOS 1∶750，β-tubulin 1∶4 000)，4℃孵育過夜。次日TBST洗膜后，加入 Ⅱ 抗(1∶5 000)，常溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯影曝光。凝膠成像系統(tǒng)采集圖片并分析灰度值，以β-tubulin為內(nèi)參照，結(jié)果以目的條帶和β-tubulin條帶積分吸光度比值表示，以正常對照組積分吸光度值為100%。以上結(jié)果至少重復(fù)3 批獨(dú)立實驗，每批重復(fù)檢測3次。

2.6化學(xué)比色法檢測HUVECs 組成型NOS(constitutive NOS, cNOS)活性各組在實驗觀察時點(diǎn)結(jié)束時，按試劑盒說明書操作收集、處理細(xì)胞、檢測cNOS活性，即使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基終止消化，重懸，1 000 r/min離心5 min，得到細(xì)胞沉淀。加入PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心6 min，棄上清，重復(fù)洗滌2次。在細(xì)胞沉淀中加入300 μL的PBS，混勻，超聲粉碎細(xì)胞，取上清進(jìn)行蛋白濃度測定和cNOS檢測。所有檢測均復(fù)3孔。

2.7TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡細(xì)胞爬片后，放入25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至40%～50%，用無血清培養(yǎng)基靜止12 h，PUE預(yù)處理及H/R培養(yǎng)方法如前所述。實驗結(jié)束時取出玻片，按照TUNEL試劑盒(POD法)說明書的操作步驟進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測。經(jīng)DAB顯色和蘇木素復(fù)染、脫水封片后，顯微鏡下觀察染色情況。鏡下細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒判定為陽性細(xì)胞。顯微鏡下(×200)隨機(jī)取5個視野，計算細(xì)胞凋亡指數(shù)%=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性者兩兩比較采用SNK-q法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1細(xì)胞鑒定結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量棕黃色顆粒，Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34表達(dá)陽性，陰性對照未見胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，見圖1。計算陽性細(xì)胞率為100%。

2PUE預(yù)處理上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)

如圖2所示，缺氧2 h、4 h和8 h后復(fù)氧4 h(H2/R4、H4/R4和H8/R4)，隨著缺氧時間的延長，各組細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)水平與control組相比逐漸降低(P<0.05)；單純PUE預(yù)處理組eNOS蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，PUE+H/R各組eNOS蛋白表達(dá)水平均高于同時點(diǎn)H/R組(P<0.05)。

Figure 1.The expression of factor VIII-related antigen and CD34 in HUVECs (SABC，×200). A: negative control; B: the positive expression of factor VIII-related antigen; C: negative control; D: the positive expression of CD34.

圖1Ⅷ因子相關(guān)抗原和CD34在HUVECs細(xì)胞中的表達(dá)

Figure 2.The protein expression of eNOS in the HUVECs treated with H/R and/or PUE. Mean±SD. n=9.▲P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs H2/R4 group;△P<0.05 vs H4/R4 group;*P<0.05 vs H8/R4 group;☆P<0.05 vs PUE group.

圖2H/R與PUE預(yù)處理各組eNOS蛋白表達(dá)

3PUE預(yù)處理增加cNOS活性

如圖3所示，與control組相比較，隨著缺氧時間延長，H/R各組細(xì)胞cNOS活性逐漸降低(P<0.05)，與同時點(diǎn)H/R組比較，應(yīng)用PUE預(yù)處理后各組cNOS活性明顯增加(P<0.05)。

Figure 3.The changes of cNOS activity in each group. Mean±SD. n=3.▲P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs H2/R4 group;△P<0.05 vs H4/R4 group;*P<0.05 vs H8/R4 group;☆P<0.05 vs PUE group.

圖3各組cNOS活性的變化

4PUE預(yù)處理減少HUVECs細(xì)胞凋亡

Control組及PUE組細(xì)胞生長良好，僅偶見細(xì)胞凋亡發(fā)生。H4/R4組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯高于control組(P<0.01)；經(jīng)PUE預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低 (P<0.01),見圖4、5。

Figure 4.The apoptosis of HUVECs (TUNEL, ×200). A: negative control group; B: control group; C: H4/R4 group; D: PUE group; E: PUE+H4/R4 group.

圖4HUVECs細(xì)胞凋亡情況5UO126及LY294002抑制PUE預(yù)處理上調(diào)的eNOS蛋白表達(dá)

如圖6所示，與control組相比，H4/R4組eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)，單純PUE預(yù)處理組和PUE+H4/R4組eNOS蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與H4/R4組相比，PUE組和PUE+H4/R4組eNOS蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與單純PUE預(yù)處理組比較，U0126+PUE+H4/R4組、U0126+PUE組、LY294002+PUE+H4/R4組和LY294002+PUE組eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與PUE+H4/R4組比較，U0126+PUE+H4/R4組、U0126+PUE組、LY294002+PUE+H4/R4組和LY294002+PUE組eNOS蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與control組相比，U0126組、LY294002組和DMSO組eNOS蛋白表達(dá)水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。

Figure 5.The apoptotic index of HUVECs in each group. Mean±SD. n=5.▲▲P<0.01 vs control group;##P<0.01 vs H4/R4 group;**P<0.01 vs PUE group.

圖5各組HUVECs細(xì)胞凋亡指數(shù)

討論

當(dāng)IRI發(fā)生時，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能異常發(fā)生時間早于實質(zhì)細(xì)胞的損傷，且內(nèi)皮細(xì)胞受損可引起血栓和粥樣斑塊形成、血管痙攣，進(jìn)一步使實質(zhì)細(xì)胞的損傷加劇，因此有效保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞是預(yù)防和治療IRI損傷的關(guān)鍵。本實驗使用的HUVECs經(jīng)鑒定為高純度內(nèi)皮細(xì)胞，因此可用于模擬血管內(nèi)皮在H/R損傷時結(jié)構(gòu)和功能的改變。

Figure 6.U0126 and LY294002 inhibited the protein expression of eNOS up-regulated by PUE pretreatment. Mean±SD. n=9.▲P<0.05 vs control group;△P<0.05 vs H4/R4 group;#P<0.05 vs PUE group;*P<0.05 vs PUE+H4/R4 group.

圖6U0126及LY294002抑制PUE預(yù)處理上調(diào)的eNOS蛋白表達(dá)

PUE是從豆科植物葛根提取的一種異黃酮成分，是葛根的主要活性成分。近些年研究表明PUE可上調(diào)大鼠心肌缺血模型心肌細(xì)胞eNOS 蛋白的表達(dá)和增加NO的產(chǎn)生[8-9]。本研究采用文獻(xiàn)[4-5]報道的具有明顯內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的PUE劑量1.0×10-3mol/L對HUVECs進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示，與同時點(diǎn)的H/R組比較，PUE預(yù)處理各組使eNOS蛋白表達(dá)明顯增加，cNOS活性明顯增強(qiáng)。

那么PUE是通過哪些細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)及其活性呢？研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)多條信號通路如蛋白激酶A[10]、PI3K/Akt[11]、ERK1/2[12]等均可以使eNOS蛋白表達(dá)增加，而PUE可以通過激活蛋白激酶ERK1/2[13]、PI3K/Akt[14]等信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用。因此本研究在PUE預(yù)處理的基礎(chǔ)上分別加用了ERK1/2特異性抑制劑U0126和PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002，以觀察在H/R過程中PUE是否通過這2條信號通路發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論在正常培養(yǎng)條件下還是H/R培養(yǎng)條件下，PUE上調(diào)eNOS蛋白表達(dá)的作用均被抑制。提示PUE上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)可由ERK1/2信號通路及PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)。

本實驗發(fā)現(xiàn)HUVECs細(xì)胞在H/R后細(xì)胞凋亡指數(shù)較control組明顯增高。這主要是由于在H/R過程中，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，使細(xì)胞內(nèi)大量氧自由基生成，且細(xì)胞抗氧化酶的活性降低，致使內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[15]。而研究發(fā)現(xiàn)PUE可以通過清除氧自由基、增加抗氧化酶活性從而發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用[16]。本研究觀察到，與H/R組比較，PUE預(yù)處理后細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低。

綜上所述，H/R后內(nèi)皮細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)明顯下降及活性顯著減弱、細(xì)胞發(fā)生凋亡，PUE預(yù)處理可通過激活ERK1/2和PI3K/Akt信號通路，使eNOS的蛋白表達(dá)上調(diào)及活性增強(qiáng)，減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Puerarin pretreatment protects human umbilical vein endothelial cells against hypoxia/reoxygenation injury via increasing protein expression of endothelial nitric oxide synthase

HUANG Hua, DING Jing, SU Feng, ZHANG Qian, LU De-qin

(Department of Pathophysiology, Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China. E-mail: dqlu91@hotmail.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the protective effects of puerarin (PUE) pretreatment on hypoxia/reoxygenation (H/R) injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs), as well as its possible mechanism and the signal transduction pathways involved. METHODS: HUVECs were randomly divided into normal control group, H/R group, PUE pretreatment group and PUE+H/R group (1.0×10-3mol/L, PUE pretreated the cells for 24 h before H/R). The protein expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was measured by Western blot. The activity of constitutive NOS (cNOS) was determined via chemical colorimetric methods. Apoptosis of HUVECs was detected by TUNEL assay. In addition, the cells were treated with ERK inhibitor U0126 (1.0×10-5mol/L) or PKB/Akt inhibitor LY294002 (5.0×10-5mol/L) for 1 h before PUE pretreatment, and then H/R was performed.RESULTS: Compared with control group, H/R decreased the protein expression of eNOS (P<0.05), and PUE pretreatment up-regulated it (P<0.05). This effect of PUE was inhibited by U0126 or LY294002 (P<0.05). Compared with control group, the activity of cNOS decreased in H/R group (P<0.05), while it increased after PUE pretreatment (P<0.05). Compared with control group, the apoptotic index significantly increased in H/R group (P<0.01). PUE pretreatment reduced the apoptotic index (P<0.01). CONCLUSION: H/R decreases the protein expression and enzyme activity of eNOS in HUVECs, and induces apoptosis of HUVECs. PUE pretreatment up-regulates the protein expression and enzyme activity of eNOS, and reduces the apoptosis of HUVECs with H/R injury. The protective effect of PUE might be through increasing eNOS protein expression via ERK1/2 and PKB/Akt signaling pathways.

[KEY WORDS]Puerarin; Human umbilical vein endothelial cells; Hypoxia/reoxygenation; Endothelial nitric oxi-de synthase

[文章編號]1000- 4718(2016)05- 0857- 06

[收稿日期]2015- 11- 20[修回日期] 2016- 01- 28

*[基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31460267)；貴州省社會發(fā)展攻關(guān)項目 [黔科合 SY 字(2013)3019號]

通訊作者△Tel： 0851-88416116； E-mail: dqlu91@hotmail.com

[中圖分類號]R363

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.05.015

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