烏桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐鹽性

牛 蓓，宋 君，符 佳，李 銳，郭曉恒，鄒 亮，雍 彬，郭 靜，高孝錦

烏桕Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆及耐鹽性

牛 蓓1，宋 君2，符 佳1，李 銳1，郭曉恒1，鄒 亮1，雍 彬3*，郭 靜1，高孝錦1

(1．成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川成都610106; 2．四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析檢測中心，四川成都610066; 3．四川師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 610101)

利用RT－PCR和RACE技術(shù)，成功獲得了烏桕Cu/Zn超氧化物歧化酶(SsCu/Zn SOD)的cDNA全長．該序列含有486 bp的完整開放閱讀框(GenBank登錄號為KX169161)，編碼161個(gè)氨基酸殘基，推測其相對分子質(zhì)量為16.304 kDa，等電點(diǎn)為6.57．對應(yīng)開放閱讀框的基因組序列含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子．同源性及保守結(jié)構(gòu)域分析顯示SsCu/Zn SOD和其他物種的Cu/Zn SOD有較高的同源性(67.26% ～88.69%)，含有一個(gè)保守的活性區(qū)．構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32－SsCu/Zn SOD在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，誘導(dǎo)出目的蛋白．轉(zhuǎn)化菌的鹽脅迫實(shí)驗(yàn)顯示，其具有抗鹽脅迫的功能．

SsCu/Zn超氧化物歧化酶基因;克隆;原核表達(dá);鹽脅迫

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的抗氧化酶［1］．SOD根據(jù)結(jié)合的金屬離子的不同可以分為三大類，即 Cu/Zn SOD、Fe SOD和Mn SOD［1－2］．在植物中，Cu/Zn SOD是植物體內(nèi)清除超氧陰離子最主要的SOD酶類，主要以同源二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中［2－4］．其含有與SOD活性相關(guān)的Cu離子和穩(wěn)定活性中心結(jié)構(gòu)的Zn離子［5］．該酶與植物的抗旱、抗鹽堿、耐低溫以及耐高溫等多種抗逆性密切相關(guān)，受到多種逆境及激素因子的影響［6］．近年來，不同植物中的超氧化物歧化酶基因被陸續(xù)克?。?，3，5］，有報(bào)道顯示轉(zhuǎn)SOD基因的細(xì)菌［7］和植物［8］在逆境脅迫下，都表現(xiàn)出活性增加或抗性增強(qiáng)的作用．

烏桕為我國四大油料樹種之一，其種子含油量高達(dá)41% ～47%［9］，其中飽和脂肪酸含量約為40%，不飽和脂肪酸含量約占60%［10］，脂肪酸的碳鏈長度主要集中在C17—C20，與普通生物柴油主要成分的碳鏈長度類似［11］．因此烏桕生物質(zhì)能的研究成為近期熱點(diǎn)．由于烏桕具有良好的抗逆性能［12］，而SOD活性高低可以用作植物抗逆性強(qiáng)弱的判斷的標(biāo)準(zhǔn)之一［6－7］．因而，烏桕SOD轉(zhuǎn)性的研究為進(jìn)一步分析其抗逆性的可能機(jī)理，改良育種提供一定的理論基礎(chǔ)．本研究通過RT－PCR及RACE技術(shù)，從烏桕中克隆出Cu/Zn超氧化物歧化酶(Ss-Cu/Zn SOD)的閱讀框及相應(yīng)DNA序列，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析．構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32－Ss-Cu/Zn SOD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，誘導(dǎo)出目的蛋白．并在高鹽脅迫下，對SsCu/Zn SOD基因重組菌的耐受性進(jìn)行探討．

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 烏桕樹葉采集于四川省仁壽縣．幼嫩的葉子采摘后立刻放入樣品保存液中，回實(shí)驗(yàn)室后將樣品凍存于－80℃超低溫冰箱中備用．

1.1.2 菌株及常用質(zhì)粒載體 大腸桿菌(Escherichia coli)Top10、BL21(DE3)、原核表達(dá)載體pET32a(+)均由四川大學(xué)生物資源與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存．克隆載體pEASY－T購自北京全式金生物技術(shù)有限公司．

1.1.3 各種酶、試劑盒及試劑 酶:rTaq酶、Prime-STARTM酶、反轉(zhuǎn)錄酶M－MLV、各種DNA限制內(nèi)切酶均購于TaKaRa公司;試劑盒:膠回收試劑盒、植物基因組DNA提取試劑盒、植物總RNA提取試劑盒購于北京天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)miga公司．瓊脂糖、瓊脂粉、Tris、SDS、IPTG、X－gal購于Fluka，其他化學(xué)藥品為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純和色譜純試劑．

1.1.4 引物 引物均由北京華大基因公司合成，如表1所示．

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table1 Primers used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 烏桕葉RNA的提取 使用北京天根公司植物總RNA提取試劑盒提取烏桕葉片總RNA．用NanoVue超微量分光光度計(jì)測定核酸濃度，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸完整性．

1.2.2 烏桕Cu/Zn SOD基因的克隆 保守區(qū)片段、5'端和3'端RECE片段克隆:通過BLAST對比，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物Cu31和Cu32(表1)．用純化的RNA為模板，以oligo(dT)18為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄．再分別以2個(gè)簡并引物和3個(gè)特異引物(Cu31、Cu32、Cu51、Cu52和Cu53)以及2個(gè)通用引物AP1和 AP2(表1)．通過5'－ RACE和3'－RACE的方法［13］，分別擴(kuò)增得到Ss-Cu/Zn SOD基因的3'端和5'端片段．對擴(kuò)增片段跑膠、回收并測序比對驗(yàn)證其正確性．所有反應(yīng)程序均為:95℃、5 min;35個(gè)循環(huán)(94℃、30 s，55℃、30 s，72℃、1 min)，72℃延伸8 min，16℃保溫．所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，并回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序(北京華大基因公司)．測序結(jié)果在NCBI的Blastn進(jìn)行比對分析，驗(yàn)證克隆片段是否屬于Cu/Zn SOD基因．

閱讀框和相關(guān)DNA序列的克隆:根據(jù)前面所得的3'和5'測序結(jié)果拼接片段，再根據(jù)該片段設(shè)計(jì)引物Cu ORF1和Cu ORF2，采用高保真PrimeSTARTM聚合酶分別以cDNA和DNA為模板，克隆SsCu/Zn SOD基因的閱讀框序列和相關(guān) DNA序列．反應(yīng)程序?yàn)?95℃、5 min;35個(gè)循環(huán)(94℃、40 s，50℃、50 s，72℃、2 min)，72℃延伸10 min，4℃保溫．所得的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，并回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序(北京華大基因公司)．所得序列在NCBI的Blastn進(jìn)行比對分析，驗(yàn)證克隆片段是否屬于SsCu/Zn SOD基因．

1.2.3 烏桕Cu/Zn SOD生物信息學(xué)分析 采用生物軟件:DNAMAN 6.0、Primer Premier 5.0．

使用的網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫和在線分析軟件如下:

Blast:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/ ORF finder:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/gorf/ gorf．html

ComputepI/Mw:http://www．expasy．org/tools/pi_ tool．html

Conserved domains:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/ Structure/cdd/wrpsb．cgi

SWISS－MODEL:http://swissmodel．expasy．org/ Spidey:http://www．ncbi．nlm．nih．gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/

1.2.4 烏桕Cu/Zn SOD基因的原核表達(dá) Cu/Zn SOD基因原核表達(dá)ORF的制備:根據(jù)所得的閱讀框序列，設(shè)計(jì)原核表達(dá)的特異引物Cuyh1和Cuyh2，以cDNA為模板，獲得Cu/Zn SOD基因的原核表達(dá)ORF．PCR程序?yàn)?95℃、5 min;35個(gè)循環(huán)(94℃、30 s，50℃、30 s，72℃、1 min)，72℃延伸10 min，16℃保溫．PCR產(chǎn)物使用DNA純化回收試劑盒回收放入－20℃?zhèn)溆茫?/p>

載體構(gòu)建:用 BamHI和 XhoI內(nèi)切酶將重組pEASY－T－SsCu/Zn SOD質(zhì)粒和pET32載體進(jìn)行雙酶切，膠回收后，用T4連接酶在16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，獲得重組表達(dá)載體pET32－SsCu/Zn SOD．

原核表達(dá):將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32－Ss-Cu/Zn SOD轉(zhuǎn)化到原核表達(dá)菌株BL21(DE3)．轉(zhuǎn)化子于LB培養(yǎng)基中37℃，250 r/m培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6，加入終濃度為1 mM的IPTG，誘導(dǎo)4 h后離心收集菌體，加入上樣緩沖液，振蕩懸浮、破碎離心，取上清進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS－PAGE)電泳檢測．

1.2.5 烏桕Cu/Zn SOD基因重組菌對鹽脅迫的耐受性 將重組菌置于2 mL LB(含有50 μg/mL Amp)液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，取100 μL將其接入10 mL含Amp的液體LB中培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h．按1%比例，取500 μL此培養(yǎng)物和對照菌BL21(DE3)分別移入50 mL含800 mmol/L NaCl液體LB培養(yǎng)基(其中含有 IPTG終濃度為1 mmol/L，Amp 50 μg/mL)中．繼續(xù)培養(yǎng)2 d，每間隔4 h，利用紫外分光光度儀測定OD600值，繪制生長曲線．實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次．

2 結(jié)果與分析

2.1 烏桕SsCu/Zn SOD全長cDNA的克隆 根據(jù)GenBank中登錄的Cu/Zn SOD基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，以烏桕葉cDNA為模板，通過巢式PCR擴(kuò)增得到大約526 bp的3'端片段，如圖1 (A)，將得到的片段回收測序．測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn比對，發(fā)現(xiàn)和其他高等植物的Cu/ Zn SOD基因序列有很高的相似性．因此初步推測獲得的序列為烏桕的SsCu/Zn SOD基因片段．根據(jù)該序列設(shè)計(jì)特異引物，采用TdT末端加尾和巢式PCR的方法獲得了長度大約為397 bp的5'端序列如圖1(B)所示．

將獲得的3'端序列和5'端序列進(jìn)行拼接，得到全長cDNA．用NCBI的ORF finder功能分析后發(fā)現(xiàn)這段序列含有一個(gè)完整的ORF框，長度為486 bp，編碼161個(gè)氨基酸．根據(jù)拼接序列，設(shè)計(jì)一對特異引物Cu ORF1和Cu ORF2對cDNA和DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得486 bp SsCu/Zn SOD ORF序列如圖1(C)和ORF對應(yīng)2 901 bp DNA序列如圖1 (D)．基因GenBank登錄號為KX169161．

圖1 烏桕的SsCu/Zn SOD基因3'端片段、5'端片段、ORF和ORF區(qū)的DNA序列的克隆Fig.1 Amplification of the 3'fragments，the 5'fragments，ORF and genomic DNA of SsCu/Zn SOD gene

2.2 烏桕的SsCu/Zn SOD的生物信息學(xué)分析利用Compute pI/Mw進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)成熟肽的分子量為16．304 kDa，等電點(diǎn)為6．57．同源性比對結(jié)果顯示，烏桕SsCu/Zn SOD全長氨基酸序列和其他物種有較高的同源性(67．26%～88.69%)，具有一個(gè)保守的活性中心序列，其中含有Cu和Zn結(jié)合的位點(diǎn)(圖2(A))．保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果也顯示，活性中心位點(diǎn)包含組氨酸52、54、69、86、126和天冬氨酸89．Cu2+結(jié)合位點(diǎn)是組氨酸52、54、69和126，Zn2+結(jié)合位點(diǎn)是組氨酸69、77、86和天冬氨酸89(圖2 (B))，這和其他已知的Cu/Zn SOD中Cu、Zn離子結(jié)合的配基是一樣的，說明了這些配基對 Cu/Zn SOD發(fā)揮正常功能非常重要［14－15］．通過 Swissmodel構(gòu)建蛋白高級結(jié)構(gòu)模型(圖3)結(jié)果顯示，該蛋白和庫中2q2l.1．A模型序列有68.46%的一致性．其主要包含8個(gè)β折疊和1個(gè)無規(guī)則卷曲．

圖2 烏桕SsCu/Zn SOD氨基酸序列分析Fig．2 Amino acid sequence analysis of SsCu/Zn SOD from S．sebiferum

圖3 SsCu/Zn SOD的結(jié)構(gòu)模擬Fig．3 structure modeling of SsCu/Zn SOD

2.3 烏桕的SsCu/Zn SOD閱讀框相關(guān)的DNA序列分析 將克隆的閱讀框和相關(guān)DNA序列在Spider軟件中進(jìn)行內(nèi)含子和外顯子分析，結(jié)果如圖4顯示，該基因含有7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子，邊界符合AG/GT規(guī)則．其活性中心位點(diǎn)的組氨酸52、54位于第2個(gè)外顯子上，組氨酸69、86和天冬氨酸89位于第3個(gè)外顯子上，組氨酸126位于第5個(gè)外顯子上．

2.4 烏桕SsCu/Zn SOD原核表達(dá) 將SsCu/Zn SOD基因的ORF與pET32a(+)載體進(jìn)行重組，構(gòu)建了原核表達(dá) pET32－SsCu/Zn SOD重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)表達(dá)菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了SDS－PAGE電泳檢測(圖5)．

通過對電泳圖的分析，在IPTG的誘導(dǎo)下，含重組質(zhì)粒的菌中出現(xiàn)了一條大量表達(dá)的蛋白條帶，分子量約為34 kDa，除去載體本身含有17.633 kDa的標(biāo)簽蛋白，即得到一個(gè)約為16 kDa的蛋白質(zhì)，大小和理論預(yù)測值相符．

圖4 SsCu/Zn SOD基因區(qū)外顯子分析Fig．4 Exon analysis of genomic region of SsCu/Zn SOD

圖5 SsCu/Zn SOD重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)Fig．5 SDS－PAGE analysis of recombinant SsCu/Zn SOD protein

2.5 烏桕SsCu/Zn SOD基因重組菌對鹽脅迫的耐受性 為了進(jìn)一步了解該基因的功能，將含有空載pET32的大腸桿菌BL21(DE3)和pET32－SsCu/ Zn SOD載體的重組菌BL21(DE3)，分別在正常條件(培養(yǎng)液中IPTG終濃度為1 mmol/L)下進(jìn)行培養(yǎng)，并繪制生長曲線，如圖6(A)所示．同時(shí)，將另外一組含有空載pET32的大腸桿菌BL21(DE3)和pET32－SsCu/Zn SOD載體的重組菌BL21(DE3)分別在高鹽條件(培養(yǎng)液中含800 mM的 NaCl，IPTG終濃度為1 mmol/L)下進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，繪制生長曲線，如圖6(B)所示．圖6(A)結(jié)果顯示含有重組載體的菌群和含有空載pET32菌群，在正常情況下其生長速度基本接近．而高鹽脅迫下，pET32－SsCu/Zn SOD的菌株比含有空載pET32菌株延滯期縮短，如圖6(B)，生長速度快，說明pET32－Ss-Cu/Zn SOD的菌株對高鹽的抗性比含有空載pET32菌要強(qiáng)．由于pET32－SsCu/Zn SOD的菌株比空載菌株多含有 SsCu/Zn SOD基因，其能在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)出重組 SOD，因而推測其重組SOD在耐鹽上發(fā)揮一定的作用．

圖6 含pET32－SsCu/ZnSOD大腸桿菌對鹽脅迫的耐受性Fig．6 The tolerance to salt stress of E．coli with pET32－SsCu/ZnSOD

3 討論

本研究從烏桕中分離得到一個(gè)Cu/Zn SOD基因．通過同源序列比對及保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)該基因推測的理論蛋白與其他物種中的同源蛋白同源性較高(67.26%～88.69%)，且具有一個(gè)保守的活性中心序列，其中含有Cu2+結(jié)合位點(diǎn)(組氨酸52、54、69和126)和Zn2+結(jié)合位點(diǎn)(組氨酸69、77、86和天冬氨酸89)．同源建模顯示，該蛋白主要由β－折疊組成，α－螺旋很少，結(jié)構(gòu)核心是8股反平行的β－折疊組成具有拓?fù)湫缘耐埃形墨I(xiàn)報(bào)道Cu2+與4個(gè)組氨酸以及一個(gè)水配位，構(gòu)成酶的活性中心，Zn2+與3個(gè)組氨酸的咪唑氮及1個(gè)天門冬氨酸的羧基氧離子配位，形成扭曲的四面體結(jié)構(gòu)［16－17］．除去Zn2+而保留Cu2+的話，SOD仍然保持較高的活性，而除去Cu2+的酶則失活［6］．

大多數(shù)文獻(xiàn)顯示外源SOD基因的轉(zhuǎn)入能增加生物的抗逆性．如曲妍妍的研究顯示番茄中的葉綠體Cu/Zn SOD基因轉(zhuǎn)入進(jìn)煙草中，轉(zhuǎn)基因煙草與對照相比耐低溫脅迫能力增強(qiáng)［18］．S.C.Lee等將Cu/ Zn SOD在水稻中過表達(dá)提高了水稻對冷脅迫的抗性．不過，L.H.Pitcher等［20］將矮牽牛葉綠體Cu/Zn SOD轉(zhuǎn)化煙草后，煙草中Cu/Zn SOD的活性雖提高了30～50倍，卻沒有提高對百草枯或臭氧引起的氧化損傷的耐受性．綜上可知，SOD轉(zhuǎn)基因生物在一定程度上可以提高生物對不同脅迫帶來的氧化損傷的抗性，但不同的生物間存在差別，關(guān)于其活性與抗逆性直接的關(guān)系還需要進(jìn)一步的研究．本研究為初步了解SsCu/Zn SOD的功能，設(shè)計(jì)耐鹽性實(shí)驗(yàn)考察重組表達(dá)菌在高鹽脅迫下的生長情況．實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌與對照相比具有較明顯的生長優(yōu)勢，說明SsCu/Zn SOD蛋白在提高重組菌耐鹽性上具有一定作用．這一結(jié)論與臧潔等人的研究結(jié)論一致．其將鹽角草Cu/Zn SOD基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)Cu/Zn SOD基因的大腸桿菌生長量與對照菌相比有一定的增加［7］．此外，通過構(gòu)建原核表達(dá)載體，成功獲得與預(yù)測分子量相同的目的蛋白質(zhì)，推測該蛋白可能是烏桕 SsCu/Zn SOD天然二聚體的寡聚單體形式．未來的工作將對目的蛋白進(jìn)行純化并驗(yàn)證活性，以求進(jìn)一步了解該蛋白的功能．

致謝 成都大學(xué)自然科學(xué)青年基金(2010XJZ29)及成都大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃孵化培育項(xiàng)目對本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意．

［1］王芳，董樂，戴聰杰，等．楊梅Cu/Zn超氧化物歧化酶基因(MrSOD1)cDNA的克隆及表達(dá)分析［J］．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26(22):27－33．

［2］XIONG W G，BAI L，MUHAMMAD R U H，et al．Molecular cloning，characterization of copper/zinc superoxide dismutase and expression analysis of stress－responsive genes from Eiseniafetida against dietary zinc oxide［J］．Comparative Biochemistry and Physiology，2012，C155(2)，416－422．

［3］馬曉麗．超氧化物歧化酶的研究進(jìn)展［J］．山西職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，20(1):83－86．

［4］董樂．楊梅銅鋅超氧化物歧化酶基因(MrCu/Zn－SOD1)的原核表達(dá)及活性鑒定［J］．基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2012，31(4):349－354．

［5］陳鴻鵬，譚曉風(fēng)．超氧化物歧化酶(SOD)研究綜述［J］．經(jīng)濟(jì)林研究，2007，25(1):59－65．

［6］林慶斌，廖升榮，熊亞紅，等．超氧化物歧化酶(SOD)的研究和應(yīng)用進(jìn)展［J］．化學(xué)世界，2006，47(6):378－381．

［7］臧潔，余梅，王先，等．鹽角草Cu/Zn－SOD基因的克隆及耐鹽性分析［J］．農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，21(7):847－854．

［8］WANG Y C，QU G Z，LI H Y，et al．Enhanced salt tolerance of transgenic poplar plants expressing a manganese superoxide dismutase from Tamarix androssowii［J］．Molecular Biology Reports，2010，37:1119－1124．

［9］CHEN Y，YANG G Z，ZHANG S L，et al．Review of the chemical constituents isolated from Sapium sebiferum(L．)roxb．［J］．Nat Prod Res Dev，1999，11:114–120．

［10］NIU B，YE H X，XU Y，et al．Cloning and characterization of a novel Δ12－fatty acid desaturase gene from the tree Sapium sebiferum［J］．Biotechnology Letters，2007，29(6):959－964．

［11］靳麗，易明晶，陳永勤，等．5種烏桕籽油主要脂肪酸成分的GC－MS分析［J］．湖北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，32(4):443－446．

［12］李盟．水鹽脅迫對4個(gè)樹種生長和生理特性的影響［D］．南京:南京林業(yè)大學(xué)，2011．

［13］HOANG L T，LIANG J S，CARRERAS I，et al．Novel SAA gene products in mice defined by rapid amplification of complementary DNA ends(3'and 5'RACE)［J］．Amyloid－J Protein Folding Disorders，2009，2(2):75－82．

［14］李琳玲，程華，許鋒，等．銀杏葉綠體銅鋅超氧化物歧化酶基因GbCuZnSOD的克隆與表達(dá)［J］．林業(yè)科學(xué)，2010，46(6): 35－42．

［15］吳軍帥，李培環(huán)，李鼎立，等．桃果實(shí)銅鋅超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD的克隆與分析［J］．核農(nóng)學(xué)報(bào)，2013，27(4): 408－417．

［16］馬偉榮，單春會，童軍茂，等．哈密瓜銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn—SOD)基因的克隆及生物信息學(xué)分析［J］．食品工業(yè)科技，2014，35(13):181－185．

［17］Fridovich I．Superoxide dismutases［J］．Ann Rev Biochemistry，1975，44(1):147－159．

［18］曲妍妍．番茄葉綠體LesAPX和Cu/Zn的克隆及功能分析［D］．濟(jì)南:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008．

［19］LEE S C，KWON S Y，KIM S R．Ectopic expression of a cold－responsive Cu/Zn superoxide dismutase gene，SodCc1 in transgenic rice(Oryza sativa L．)［J］．J Plant Biology，2009，52:154－160．

［20］PITCHER L H，BRENNAN E，HURLEY A，et al．Overproduction of petunia chloroplastic copper/zinc superoxide dismutase does not confer ozone tolerance in transgenic tobacco［J］．Plant Physiology，1991，97:452－455．

Cloning and Salt-tolerance Analysis of SsCu/Zn SOD Gene from Sapium Sebiferum

NIU Bei1，SONG Jun2，F(xiàn)U Jia1，LI Rui1，GUO Xiaoheng1，ZOU Liang1，YONG Bin3，GUO Jing1，GAO Xiaojin1

(1．School of Medical，Chengdu University，Chengdu 610106，Sichuan; 2．Center of Analysis and Test，Sichuan Academy of Agriculture Science，Chengdu 610066，Sichuan; 3．College of Life Science，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，Sichuan)

A full-length SsCu/Zn SOD gene from S．sebiferum containing a 486 bp open reading frame encoding 161 amino acid residues was obtained by RT-PCR and RACE technology，and the gene was deposited into GenBank with the accession number of KX169161．The molecular weight and isoelectric point of the mature protein were predicted to be 16．304 kDa and 6．57，respectively．The genomic region corresponding to the open reading frame has 7 exons and 6 introns．The homology modeling analysis showed that Ss-Cu/Zn SOD shared a high degree of sequence similarity with other plant Cu/Zn SOD(67．26% ～88．69%)and a conserved active region．Recombinant plasmid pET32-SsCu/Zn SOD was constructed and expressed in E．coli BL21(DE3)．Salt stress analysis of transformed bacteria indicated that SsCu/Zn SOD might confer transformed bacteria salt-tolerance．

SsCu/Zn SOD gene;cloning;prokaryotic expression;salt stress

Q946

A

1001－8395(2016)05－0743－07

10.3969/j．issn.1001－8395.2016.05．022

(編輯 陶志寧)

2016－04－02

四川省教育廳自然科學(xué)重點(diǎn)基金(12ZB178)

*通信作者簡介:雍 彬，男，博士，主要從事微生物學(xué)、生化與分子生物學(xué)的研究，E－mail:binyong1225@163．com