沙棘葉黃酮對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

李淑珍，武 飛，楊 寧，陳月林

沙棘葉黃酮對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用

李淑珍1，武 飛2，楊 寧1，陳月林1

(1．烏蘭察布醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000; 2．烏蘭察布中心醫(yī)院，內(nèi)蒙古烏蘭察布012000)

當(dāng)今用于治療肝臟疾病的藥物，長(zhǎng)期服藥會(huì)給患者帶來負(fù)作用，因此尋找新型、安全的天然植物源保肝活性物質(zhì)具有重要意義．探討沙棘葉黃酮對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用，為探索保肝藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)．通過小鼠灌胃給藥，用四氯化碳(CCl4)制備急性肝損傷模型，用比色法檢測(cè)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(AKP)活性和肝臟過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量，計(jì)算肝指數(shù)和進(jìn)行病理學(xué)顯微切片觀察．實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出:沙棘葉黃酮中劑量組(100 mg/kg)可明顯降低損傷小鼠血清AKP、GPT、GOT含量和肝臟MDA含量，提高肝臟POD、SOD活性．說明一定劑量的沙棘葉黃酮對(duì)小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)理可能與黃酮的抗脂質(zhì)過氧化作用有關(guān)．

沙棘葉黃酮;肝損傷;小鼠模型;保肝作用

肝臟是人體最大的腺體．肝豐富的血供和獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)使其代謝極為活躍，不僅是機(jī)體重要的代謝器官，而且還具有分泌、排泄和解毒等重要功能．而今用于治療肝臟疾病的藥物，長(zhǎng)期服用有時(shí)會(huì)給患者帶來負(fù)作用，因此尋找新型安全的天然植物源保肝活性物質(zhì)具有重要意義［1－5］．沙棘(Hippophe rhamnoids L．)為胡頹子科植物，其干燥成熟果實(shí)系蒙古族、藏族習(xí)用藥材，作為傳統(tǒng)中藥自古以來就有廣泛應(yīng)用，1997年被列入中國(guó)藥典治療多種疾病［6］．沙棘果黃酮類化合物具有保肝作用［7］，據(jù)研究證明沙棘葉更富含黃酮類化合物，并且從葉中提取黃酮具有原料來源廣泛，成本低廉的優(yōu)勢(shì)［8］．但對(duì)于沙棘葉的研究所見文獻(xiàn)甚少，如能拓展對(duì)沙棘葉黃酮的研究，可以有效地促進(jìn)內(nèi)蒙古沙棘資源的綜合利用．本文以沙棘葉作為材料，探討葉黃酮的保肝作用，為保肝藥物的探索提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為內(nèi)蒙古沙棘資源的合理利用提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 藥品與試劑 沙棘葉黃酮精制品，總黃酮含量14．89%，由本實(shí)驗(yàn)室制備;在配制灌胃液前濃縮成總黃酮含量為68．12%的濃縮液．聯(lián)苯雙酯，浙江萬邦藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)A02150803)．四氯化碳，上海長(zhǎng)江化工廠生產(chǎn)，分析純，用前配成0．1%大豆油溶液．谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、堿性磷酸酶(AKP)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所．

1．2 儀器 722分光光度計(jì)(上海電子光學(xué)技術(shù)研究所)，BECKMAN全自動(dòng)生化分析儀．

1．3 動(dòng)物分組與處理 昆明種雄性小鼠60只，體重(20±2)g，由內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào):scxk(蒙)2002－0001．將小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只．分別是正常對(duì)照組、CCl4模型組、聯(lián)苯雙酯組、黃酮高、中、低劑量組，各組每天灌胃給藥1次．正常對(duì)照組和CCl4模型組灌胃150 mg/kg的蒸餾水，聯(lián)苯雙酯組灌胃150 mg/kg的聯(lián)苯雙酯溶液，黃酮高、中、低劑量組灌胃劑量分別為150、100和50 mg/kg的沙棘葉黃酮溶液，連續(xù)7 d．末次給藥后10 h，除正常對(duì)照組外，其他各組小鼠腹腔注射0．1%CCl4大豆油溶液10 mL/kg，同時(shí)禁食，自由飲水．16 h后眼球取血，分離血清，另取肝臟備檢［9－10］．

1．4 指標(biāo)測(cè)定［11－12］采用試劑盒測(cè)定血清GPT、

GOT和AKP．取肝臟稱重，計(jì)算肝指數(shù):肝指數(shù)= (肝臟重量/體重)×100%．取肝右葉用生理鹽水沖洗后制備成10%的肝勻漿，測(cè)定POD、SOD、MDA．另取肝左葉，置10%中性緩沖甲醛溶液中，經(jīng)脫水→透明→石蠟包埋→切片→脫蠟→HE染色后，在400倍光鏡下觀察肝細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)變化，由烏蘭察布中心醫(yī)院病理檢驗(yàn)室完成．

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各項(xiàng)數(shù)據(jù)均以x±SD表示，采用SPSS 19．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，兩組間均數(shù)差異采用單因素方差分析，P＜0．05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果與分析

2．1 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠模型肝、脾臟器的影響藥典記載，沙棘果具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀等功效，沙棘果的主要成分含異鼠李素、異鼠李素－3－β－D－葡萄糖甙、異鼠李素－3－β－蕓香糖甙、槲皮素及山奈酚的低糖甙等黃酮類物質(zhì)［6］．沙棘葉總黃酮是否也有此作用，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)做了脾指數(shù)的測(cè)定，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，沙棘葉黃酮對(duì)脾臟損傷有抑制作用，但不存在顯著差異，表明沙棘葉總黃酮與果總黃酮成分相近者很少或完全不同．

由表1可知，與正常對(duì)照組相比，CCl4模型組肝指數(shù)明顯提高(P＜0．01)，表明CCl4可致小鼠肝臟腫大;與CCl4模型組比較，沙棘葉黃酮各劑量組及聯(lián)苯雙酯組均有降低肝指數(shù)的作用(P＜0．01)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明沙棘葉黃酮能抑制CCl4所致的小鼠肝臟腫大，并且與聯(lián)苯雙酯組的治療作用不存在差異(P＞0．05)．

表1 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠肝指數(shù)、脾指數(shù)的影響(x±SD，n=10)Table 1 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on the liver index and spleen index in mice

2．2 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠模型血清GPT、GOT和 AKP的影響 血清中GPT、GOT、AKP活性反映肝細(xì)胞變性、壞死程度，也是檢查肝功能損害最常用、最敏感的指標(biāo)，本項(xiàng)研究測(cè)定了沙棘葉黃酮對(duì)模型小鼠血清GPT、GOT、AKP活性的影響，結(jié)果如表2所示．

由表2結(jié)果顯示，CCl4模型組的 GPT、GOT、AKP活性均極顯著高于正常對(duì)照組(P＜0．01)，說明肝受損，造模成功．與CCl4模型組比較，沙棘葉黃酮各劑量組及聯(lián)苯雙酯組的AKP、GPT、GOT活性均極顯著低于模型組(P＜0．01)．沙棘葉黃酮各劑量組之間比較，中劑量更接近正常值，說明中劑量組治療效果較好，與聯(lián)苯雙酯組比較不存在顯著差異(P＞0．05)．

2．3 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠模型肝組織POD、SOD和MDA的影響 POD、SOD是體肝內(nèi)主要的清除自由基及抗氧化酶類．MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其生成量體現(xiàn)了生物膜的受損程度，損傷程度越重，MDA含量越高．他們都和自由基的含量高低密切相關(guān)，沙棘葉黃酮對(duì)肝組織POD、SOD和MDA的影響，結(jié)果如表3所示．

表3結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，CCl4模型組的 POD和 SOD顯著低于正常對(duì)照組(P＜0．01)，MDA高于正常對(duì)照組(P＜0．05)，說明肝受損明顯，肝內(nèi)抗氧化酶活力下降，氧化產(chǎn)物增多．與CCl4模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、沙棘葉黃酮各劑量組的POD和SOD都高于模型組，MDA都低于模型組，說明沙棘葉黃酮具有提高肝內(nèi)抗氧化活力(POD和SOD)，降低氧化產(chǎn)物(MDA)的作用．其中，沙棘葉黃酮中劑量組的POD、SOD與模型組比較，有極顯著差異(P＜0．01)，MDA有顯著差異(P＜0．05)，且治療效果與聯(lián)苯雙酯組比較，不存在顯著差異(P＞0．05)．說明一定劑量(100 mg/kg)的沙棘葉黃酮可達(dá)到與聯(lián)苯雙酯組同樣的治療效果．

2．4 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠模型肝臟病理變化的影響參照文獻(xiàn)［13］的方法判斷肝損傷程度，按肝細(xì)胞水腫量分級(jí)如下:1)0級(jí):肝細(xì)胞正常;2)Ⅰ級(jí):肝細(xì)胞水腫程度小于整個(gè)肝組織切片的25%;3)Ⅱ級(jí):肝細(xì)胞水腫量占整個(gè)肝組織切片的25% ～50%;4)Ⅲ級(jí):肝細(xì)胞水腫量大于整個(gè)肝組織切片的50%．

表2 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠血清GPT、GOT和AKP的影響(x±SD，n=10)Table 2 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on serum GPT，GOT and AKP in mice

表3 沙棘葉黃酮對(duì)小鼠肝組織POD、SOD和MDA的影響(x±SD，n=10)Table 3 Effect of flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．on the liver tissue of POD，SOD and MDA in mice

病理學(xué)檢查顯示:正常對(duì)照組鏡下可見肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞形態(tài)正常，全部屬于0級(jí)，顯微結(jié)構(gòu)見圖1A．CCl4模型組鏡下見肝細(xì)胞呈大片氣球樣變，肝損傷嚴(yán)重，全部屬于Ⅲ級(jí)，顯微結(jié)構(gòu)見圖1B．聯(lián)苯雙酯組鏡下可見肝細(xì)胞大部分形態(tài)較正常，只有極個(gè)別細(xì)胞異常，90%屬于0級(jí)，顯微結(jié)構(gòu)見圖1C．沙棘葉黃酮高劑量組肝細(xì)胞病變較模型組較輕，肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，60%屬于Ⅱ級(jí)，顯微結(jié)構(gòu)見圖1D．中劑量組肝細(xì)胞有個(gè)別壞死，大部分正常，與聯(lián)苯雙酯藥物組幾乎差不多，70%屬于Ⅰ級(jí)，顯微結(jié)構(gòu)見圖1E．低劑量組肝細(xì)胞病變較模型組略輕，90%屬于Ⅲ級(jí)壞死，結(jié)構(gòu)見圖1F．

3 討論與結(jié)論

研究保肝作用常用的動(dòng)物模型是CCl4急性肝損傷模型．CCl4對(duì)肝損傷的毒性作用是通過脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行的．CCl4進(jìn)入肝細(xì)胞后，經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P－450酶激活后生成·CCl3，·CCl3可進(jìn)一步與氧結(jié)合，形成具有更強(qiáng)反應(yīng)活性的CCl3O－基團(tuán)，這些自由基可攻擊肝細(xì)胞膜不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化，損傷肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使膜通透性升高，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死［14］．由于CCl4產(chǎn)生的大量自由基損害了肝臟，使肝指數(shù)升高．模型組的肝指數(shù)顯著高于正常對(duì)照組，說明肝臟受損水腫．沙棘葉黃酮高、中、低劑量組可以明顯降低肝指數(shù)，表明沙棘葉黃酮可以有效抑制肝臟腫大，降低肝臟的受損程度，從而保護(hù)肝臟．

酶學(xué)實(shí)驗(yàn)在肝實(shí)質(zhì)損害的診斷中占重要地位，其中應(yīng)用最廣泛的是轉(zhuǎn)氨酶(GPT、GOT)，肝內(nèi)富含這2種酶，據(jù)測(cè)定整個(gè)肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶量約為血清中含量的100倍．當(dāng)組織發(fā)生炎癥或損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶泄漏于血中．因此血清中酶活力升高常與肝組織損傷程度呈平行關(guān)系，血清轉(zhuǎn)氨酶活性是肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)．AKP主要存在于小腸粘膜、腎臟、骨骼和肝臟等組織的細(xì)胞膜上，血液中的AKP主要來自于肝臟，因此，測(cè)定血清中的AKP也可以判斷肝臟的受損情況［15］．結(jié)果顯示，模型組GPT、GOT、AKP都極顯著高于正常對(duì)照組(P＜0．001)，說明肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷;沙棘葉黃酮中劑量組的值低于CCl4模型組而接近于正常對(duì)照組的值，可以抑制血清GPT、GOT、AKP的異常升高，從而保護(hù)肝臟．POD和SOD是肝內(nèi)的抗氧化酶，能夠清除自由基，并可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)．脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA也可以破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死，其含量可反映機(jī)體過氧化損傷程度和細(xì)胞受損程度．由于肝臟受損，CCl4模型組的酶活力遠(yuǎn)低于正常對(duì)照組，MDA的含量顯著高于正常對(duì)照組，而沙棘葉黃酮組的酶活力顯著高于CCl4模型組．這說明了沙棘葉黃酮可以通過提高POD、SOD酶活性清除自由基，降低MDA的含量，減輕肝受損程度，從而起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的完整作用．

從病理切片可知，CCl4模型組鏡下見肝細(xì)胞呈大片氣球樣變，肝損傷嚴(yán)重，從形態(tài)學(xué)上說明造模成功．黃酮治療組中劑量組效果較好，其效果與聯(lián)苯雙酯組相當(dāng)．從形態(tài)學(xué)上也說明沙棘葉黃酮具有保護(hù)肝臟損傷的作用．

根據(jù)鄭建仙［11］所著《功能性食品》記載:病理結(jié)果陽性，2個(gè)轉(zhuǎn)氨酶中任何一項(xiàng)陽性，可判定受試物具有對(duì)化學(xué)性肝損傷有保護(hù)作用．綜上所述，一定劑量的沙棘葉黃酮具有保肝作用，其作用機(jī)制可能是通過提高清除自由基酶的活性，減少自由基引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，維持了肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性，防止轉(zhuǎn)氨酶外泄來實(shí)現(xiàn)的．沙棘葉黃酮對(duì)小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用的研究，對(duì)有效篩選抗肝損傷的植物源活性成分有著重要的意義，并且沙棘葉來源廣泛，價(jià)格低廉，對(duì)沙棘的綜合利用具有更廣闊的前景．

［1］盧雪暉，劉叢海，葉丹．保肝藥物臨床應(yīng)用情況調(diào)查［J］．天津藥學(xué)，2014，26(1):35－36．

［2］張葉飄，賽娜瓦爾，謝修強(qiáng)，等．藥物性肝損害88例回顧性分析［J］．藥物流行病學(xué)雜志，2015，24(3):155－157．

［3］周鴻堂，陳潔．2012－2013年我院肝病藥物應(yīng)用情況分析［J］．中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2015(7):122－124．

［4］MARTIN G S，MANNINO D，EATON S，et al．The epidemiology of sepsis in the United States from 1979 through 2000［J］．N Engl J Med，2003，348(16):1546－1554．

［5］FUKAZAWA A，YOKOI Y，KURACHI K，et al．Implication of B lymphocytes in endotoxin－induced hepatic injury after partial hepatectomy in rats［J］．Surg Res，2007，137(1):21－29．

［6］國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典(2010版)［M］．北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010．

［7］宋春梅，杜鵑，葛紅娟．沙棘果對(duì)高脂飼料大鼠血脂和肝臟的保護(hù)作用［J］．衛(wèi)生研究，2015，44(4):628－631．

［8］景小楠，鐘菡，張宏，等．黑骨藤中總黃酮含量的測(cè)定［J］．四川師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2010，33(1):89－91．

［9］孫敬方．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2001．

［10］趙效國(guó)．新編醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法［M］．北京:科學(xué)衛(wèi)生出版社，2009．

［11］鄭建仙．功能性食品［M］．北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2002．

［12］SHIOJI K，MATSUURA Y，IWASE T，et al．Successful immunoglobulin treatment for fulminant myocarditis andserial analysis of serum thioredoxin，acase report［J］．Cir J，2002，66:977－980．

［13］項(xiàng)偉，夏延斌，余望貽，等．金葛露及其改良產(chǎn)品的解酒保肝作用研究［J］．釀酒，2006，33(3):54－56．

［14］朱淑云．連翹葉茶提取物抗氧化活性的研究［D］．西安:陜西師范大學(xué)，2003．

［15］劉旭．溪黃草黃酮對(duì)肝纖維化及急性肝損傷治療作用的實(shí)驗(yàn)研究［D］．廣州:南方醫(yī)科大學(xué)，2014．

Research of Flavonoids Leaves of Hippophe rhamnoids L．on Acute Liver Injury Protection Effects in Mice

LI Shuzhen1，WU Fei2，YANG Ning1，CHEN Yuelin1

(1．Wulanchabu Medical College，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia; 2．Wulanchabu Central Hospital，Wulanchabu 012000，Inner Mongolia)

Today drugs used to treat liver diseases often bring many negative effects to the patients．It is important to look for a new security active substances from the natural plants to protect liver．Flavonoids of Hippophe rhamnoids L．maybe protect the acute liver injury in mice，and it perhaps provide experimental basis for protective liver medicine．We prepare acute liver injury model in mice with CCl4by gavage，use colorimetric method to measure serum GPT，GOT，AKP activity and liver POD，SOD，MDA content，calculate the liver index and observe liver in pathology slice．Flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．(100 mg/kg)can reduce serum AKP，GPT，GOT content and liver MDA content obviously，improve liver POD and SOD activity in the injury mice．The certain dosage flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．can protect liver in acute liver injury model mice．Its mechanism may be related to flavonoids anti-lipid peroxidation．

flavonoids leaves of Hippophe rhamnoids L．;liver injury;mice model;protect liver function

Q949．95;R965．1

A

1001－8395(2016)05－0765－05

10．3969/j．issn．1001－8395．2016．05．026

(編輯 李德華)

2015－09－22

內(nèi)蒙古自治區(qū)教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(NJZC14407)

李淑珍(1974—)，女，副教授，主要從事天然產(chǎn)物研究與開發(fā)的研究，E－mail:448609108@qq．com