花生iso-ARah3基因克隆及多克隆抗體制備

姜煥煥，郝翠翠，遲曉元，王 冕，陳 娜， 陳明娜，潘麗娟，祁佩時，王 通，禹山林

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150001； 3.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

?

花生iso-ARah3基因克隆及多克隆抗體制備

姜煥煥1,2，郝翠翠3，遲曉元1，王 冕1，陳 娜1， 陳明娜1，潘麗娟1，祁佩時2，王 通1*，禹山林*

(1.山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)市政環(huán)境工程學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150001； 3.青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266042)

類花生致敏原3(iso-ARah3)是花生致敏原3的同系物，其表達活性與干旱及黃曲霉侵染相關(guān)。本研究通過RT-PCR技術(shù)從花生種子cDNA文庫中克隆獲得iso-ARah3的開放閱讀框(ORF)，全長1533bp，編碼510個氨基酸，N端預(yù)測有20個氨基酸的信號肽序列。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，該克隆序列有1處缺失突變，其N端210個氨基酸序列與胰蛋白酶抑制因子的同源性較高，達83.60%。通過構(gòu)建原核表達載體pET28a-isoARah3，轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，利用SDS-PAGE檢測表明，融合蛋白His-isoARah3獲得高效表達，分子量約54kD。His-isoARah3經(jīng)純化和富集，對新西蘭兔進行4次免疫，純化獲得的iso-ARah3多克隆抗血清，通過間接ELISA檢測，表明獲得了效價比(1∶512000)很好的抗體。通過對融合蛋白的誘導(dǎo)前和純化后樣品進行Western Blot分析，結(jié)果顯示僅在純化樣品相應(yīng)位置(54kD)有明顯信號，表明所制備的抗體具有很高靈敏度和特異性。本研究結(jié)果為深入研究花生iso-ARah3基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

花生；黃曲霉毒素；序列分析；原核表達；多克隆抗體

黃曲霉毒素是由真菌類的黃曲霉和寄生曲霉代謝產(chǎn)生的一類真菌毒素，普遍存在于土壤、作物種子及其各種制品中，花生是受黃曲霉侵染和危害最嚴重的作物之一，已成為全球花生產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因素之一[1-3]。目前，國內(nèi)外學(xué)者普遍認為解決花生黃曲霉毒素污染問題經(jīng)濟有效的可行途徑是通過基因工程手段培育抗性品種[4]。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，挖掘抗性相關(guān)基因和標(biāo)記蛋白，進而研究花生抗黃曲霉機制，成為培育抗黃曲霉品種的關(guān)鍵。各國學(xué)者通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定出了植物種子內(nèi)含高豐度的貯藏蛋白，其中許多被鑒定為與抗黃曲霉毒素相關(guān)，這些蛋白含量的多少與抗性品種的抗性大小相關(guān)[5-7]?；ㄉ旅粼?(ARah3)是一個分子量為60kD，具有IgE結(jié)合功能的蛋白質(zhì)，具有致敏原性[8]。類花生致敏原3(iso-ARah3)是ARah3的同系物，屬于11S 球蛋白家族，均屬于花生貯藏蛋白質(zhì)家族[9]。其首次發(fā)現(xiàn)是Liang等[10]通過雙向電泳技術(shù)從不同花生品種中分離、鑒定出來的，并推測其可能在花生種子抗黃曲霉侵染中起到一定作用。2010年Wang等[11]人通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)比較干旱及黃曲霉脅迫下抗—感黃曲霉花生品種種子蛋白質(zhì)表達差異，也同樣發(fā)現(xiàn)類花生致敏原3(iso-ARah3)在蛋白質(zhì)及mRNA水平的表達受干旱和黃曲霉脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)。這說明抗性品種中iso-ARah3基因響應(yīng)黃曲霉脅迫，具有一定的抗黃曲霉功能。2011年王通[12]對正常生長、干旱脅迫和干旱及黃曲霉共同脅迫下抗性品種YJ-1和感黃曲霉品種粵油7號種子進行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定出12個差異表達蛋白質(zhì)點，其中包括貯藏蛋白iso-ARah3，其在蛋白質(zhì)表達和mRNA轉(zhuǎn)錄水平均受干旱和黃曲霉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達，另外通過高密度基因芯片技術(shù)進一步驗證了該基因的表達受黃曲霉菌侵染誘導(dǎo)。這進一步可以推測iso-ARah3基因表達活性與干旱及黃曲霉侵染相關(guān)。通過基因工程培育抗性品種前提是要對蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性進行了解，目前只在基因芯片和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)角度鑒定出iso-ARah3基因與花生抗黃曲霉毒素相關(guān)，有關(guān)該基因的功能研究也僅限于其致敏性，其與抗黃曲霉毒素相關(guān)的結(jié)構(gòu)和功能還未有相關(guān)報道，因此本研究對iso-ARah3基因進行序列分析，體外原核表達及抗體的制備，為深入研究其與黃曲霉毒素相關(guān)性的機制，培育抗性品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

花生(ArachishypogaeaL.)材料為本實驗室保存的品種花育23。大腸桿菌DH5a、BL21、氨芐青霉素、卡那霉素等購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

rTaq DNA聚合酶，BamHⅠ、NotⅠ內(nèi)切酶，pMD18-T Vector購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自O(shè)MEGA公司；其余常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 總RNA的提取及cDNA的合成

取100 mg花生種子于預(yù)冷的研缽中加液氮迅速研磨成粉末狀，參照TaKaRa公司RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA，最后用50μL DEPC水溶解RNA。以總RNA為模板，利用PrimeScriptTMRT reagent試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，-80℃保存，備用。

1.3iso-ARah3基因的克隆

根據(jù)已有的iso-ARah3基因序列，通過軟件Primer5設(shè)計用于擴增的引物，命名為iso-F(iso-F：GGATCCATGGCCAAGCTTCTTGCGCTT)酶切位點為BamH I和iso-R(iso-R：GCGGCCGCAGCCACCTCCCTCATAGACTGA)酶切位點為NotI。PCR擴增iso-ARah3基因的全長ORF片段。PCR程序為94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 1min40s，32個循環(huán)；72℃ 10 min。參考pMD18-T克隆試劑盒(TaKaRa)中的連接反應(yīng)步驟將iso-ARah3基因PCR膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中。經(jīng)過藍白斑篩選和菌液PCR進行陽性克隆篩選，并送往上海生物有限工程公司進行測序。

1.4iso-ARah3基因序列生物信息學(xué)分析

將測序結(jié)果利用軟件DNAMAN比對。通過在線軟件(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)，對iso-ARah3的氨基酸成分和含量，以及蛋白質(zhì)的理論分子量等基本生物學(xué)性質(zhì)進行預(yù)測。軟件DNAMAN、SignalP和iPSORT預(yù)測花生iso-ARah3基因N端信號肽序列。NCBI鏈接的CDD[13]對其蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)及功能區(qū)域進行預(yù)測。在線網(wǎng)絡(luò)工具NCBI分析其氨基酸序列同源性，軟件MEG5構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析其進化關(guān)系。

1.5iso-ARah3基因原核表達載體的構(gòu)建

將iso-ARah3基因克隆到大腸桿菌克隆載體pET28a(+)中。分別將凝膠電泳驗證提取成功的pMD18-isoARah3質(zhì)粒和大腸桿菌pET28a(+)質(zhì)粒以BamH I和NotI進行雙酶切，對目的片段進行切膠、回收，4℃連接過夜，42℃熱擊轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中。以擴增引物進行菌液PCR，BamH I和NotI進行雙酶切，驗證篩選的陽性克隆。

1.6 iso-ARah3重組蛋白的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE檢測

以濃度為0.4mmol/L異丙基硫代半乳糖(IPTG)為誘導(dǎo)劑，條件為37℃，120 r/min，誘導(dǎo)12 h后離心收集菌體，用裂解液(含50 mmol/L(pH 8.0)Tris Base，2 mmol EDTA，100 mmol NaCl)重懸菌體，進行超聲波破碎，超聲條件為功率200 W，超聲3 s后，暫停5 s，此為一個循環(huán)。每200mL培養(yǎng)基超聲循環(huán)次數(shù)為99次，超聲完畢后，8000 r/min、4℃、離心15 min，分別收集上清和菌體沉淀。蛋白樣品與上樣緩沖液以2:1比例混勻后經(jīng)SDS-PAGE電泳。電泳條件為5%濃縮膠，80 V，15 min；10%分離膠，150V，60min?？捡R斯亮藍G-250染色1 h左右，用雙蒸水清洗兩次，然后用脫色液(5%甲醇、7.5%乙酸)進行脫色。在膠片觀察燈下觀察目的條帶出現(xiàn)的位置，判斷iso-ARah3融合蛋白是否可溶。

1.7 iso-ARah3重組蛋白的純化及SDS-PAGE檢測

將獲得的Iso-ARah3融合蛋白用Ni-NTA 親和層析柱純化，純化過程:(1)用10倍柱床體積的Binding buffer(PBS，8 mol/L尿素，15mmol/L咪唑，300 mmol/L NaCl，0.5%Triton X-100，pH8.0)清洗平衡柱子，流速60mL/h；(2)樣品(溶解液上清)上柱，流速45mL/h，收集穿透液；(3)10倍柱床體積的Binding buffer清洗柱子，流速60mL/h；(4)Elute Buffer洗脫(PBS，8mol/L尿素，500mmol/L咪唑，pH8.0)，流速45mL/h，收集洗脫液；(5)將純化后的蛋白置于透析袋中，在PBS緩沖液(pH=8.0)中緩慢透析3次，每次2 h。收集透析后的樣品進行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE電泳條件同1.6。

1.8 多克隆抗體的制備及檢測

選取實驗室飼養(yǎng)4個月大的健康新西蘭大白兔2只，初次免疫的抗原為弗氏完全佐劑和蛋白抗原的混合物，免疫劑量為0.5mg每只。21 d后進行第二次免疫，分別在第35 d和第49 d進行第三、四次免疫，免疫所用抗原和劑量與第二次免疫相同。分別對第三次和第四次免疫生長7 d后的兔子進行耳靜脈采血，利用ELISA試劑盒進行抗血清效價的檢測，酶標(biāo)儀測定效價值。最終抗血清效價符合抗體制備要求，頸動脈采全血，利用ELISA試劑盒對抗體的效價進行檢測，Western Blot驗證抗體的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1iso-ARah3基因的克隆

以花生種子的cDNA為模板，PCR擴增iso-ARah3基因，連接T載體后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DHa5中。陽性克隆篩選結(jié)果(圖1)顯示，在1500 bp處出現(xiàn)特異性目的條帶，表明成功克隆了該基因。

2.2iso-ARah3基因序列及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

生物信息學(xué)分析表明，測序所得的序列為完整的開放讀碼框，大小為1533bp，編碼510個氨基酸。蛋白質(zhì)理論分子量約58399.4，為酸性氨基酸。帶有負電荷氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)71個，帶有正電荷氨基酸(賴氨酸+亮氨酸)56個。該蛋白質(zhì)富含谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸，含量分別達9.2%、8.8%、8.6%；其次絲氨酸和蘇氨酸含量高達7.1%和3.1%。編碼的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)包含有8個α-螺旋和22個β-折疊(圖2)，含有2個Cpuin-1的相對保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域，屬于Cupin蛋白超家族(圖3)。在N端有20個氨基酸的信號肽，其序列為MAKLLALSLCFCVLVLGASS。

圖1 iso-ARah3基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.1 Electrophoresis profile of iso-ARah3 gene by PCR

圖2 iso-ARah3蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Predicted protein secondary knot of iso-ARah3

圖3 iso-ARah3蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Predicted domain sites of iso-ARah3

通過DNAMAN對該基因的堿基序列與GeneBank上公布的iso-ARah3基因序列(登錄號為ABI17154.1)對比(圖4)，發(fā)現(xiàn)克隆到的目的序列有1處缺失突變。其N端210個氨基酸序列與胰蛋白酶抑制因子(登錄號為AF487543)的同源性較高，達到83.60%，表明該基因很可能具有胰蛋白酶抑制因子的活性。根據(jù)推測的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，結(jié)果表明，Iso-ARah3與花生中其他致敏蛋白質(zhì)相似性很高，其中與ARah3(登錄號AF93541)及ARah4(登錄號AF086821)的同源性分別高達96%和72%。

2.3 重組蛋白表達載體的驗證

利用PCR檢測pET28a-ARah3重組質(zhì)粒，電泳結(jié)果(圖6a)顯示在1533 bp處出現(xiàn)了目的條帶。利用內(nèi)切酶BamH I和NotI雙酶切重組質(zhì)粒，在同樣的位置處出現(xiàn)了目的條帶(圖6b)。重組質(zhì)粒再次測序，序列與所克隆序列經(jīng)比對完全吻合，進一步說明iso-ARah3基因的原核表達載體構(gòu)建成功。

2.4 SDS-PAGE分析

IPTG誘導(dǎo)含pET28a-iso-ARah3重組質(zhì)粒的大腸桿菌12h，超聲破碎、離心后，分別收集上清和菌體沉淀，對樣品上清和沉淀進行SDS-PAGE分析，以不含iso-ARah3基因的大腸桿菌pET-28a(+)作為對照菌株。電泳結(jié)果顯示在54kD出現(xiàn)明顯的新生條帶(圖7a)，大小與分子生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果基本相符，表明融合蛋白在誘導(dǎo)12h后成功得到了表達，并且蛋白主要存在于沉淀中，超聲后的上清中含量很少，表明蛋白主要為包涵體形式。融合蛋白經(jīng)過鎳瓊脂糖親和層析法進行純化后，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在相應(yīng)位置(54kD)出現(xiàn)了明顯單一條帶，表明融合蛋白成功得到了純化(圖7b)。為下一步蛋白功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖4 iso-ARah3基因的氨基酸序列比對分析Fig.4 Alignment and analysis of amino acid sequences of iso-ARah3

圖5 iso-ARah3與花生其他種子貯藏蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Multiple alignment of the iso-ARah3 amino acid sequences and other storage protein

圖6 pET28a-isoARah3原核表達載體菌液PCR及質(zhì)粒酶切鑒定Fig.6 PCR and plasmid enzyme identification of pET28a-isoARah3 prokaryotic expression vector注：(a)pET28a-isoARah3菌液PCR，M：DL2000Marker，1～6：菌液PCR；(b)pET28a-isoARah3雙酶切鑒定，M：DL2000 DNA marker，1：pET28a-isoARah3質(zhì)粒雙酶切(BamH I/Not I)，2：pET28a-isoARah3質(zhì)粒。Note:(a)Liquid PCR of PET28-isoARah3,M:DL2000 Marker; 1～10:Liquid PCR; (b):Double enzyme digestion identification of pET28a-isoARah3,M:DL2000 DNA marker,1:Double digestion of pET28a-isoARah3 plasmid by BamH I and Not I,2:pET28a-isoARah3 plasmid.

圖7 Iso-ARah3融合蛋白表達定位與純化的SDS-PAGE分析Fig.7 SDS-PAGE analysis of the expressed location and purification product of recombinant Iso-ARah3注：(a)Iso-ARah3原核誘導(dǎo)表達SDS-PAGE電泳圖，1：未經(jīng)誘導(dǎo)的pET28a-isoARah3，2：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)12h后的樣品，3：超聲波破碎后的上清液，4：超聲波破碎后的沉淀，M：蛋白marker；(b)純化后pET28a-isoARah3的SDS-PAGE電泳圖，M：蛋白Marker，1：純化后的融合蛋白。Note:(a) SDS-PAGE electrophoresis of Iso-ARah3 prokaryotic induced expression,1:Recombinant protein without inducing,2:Recombinant protein induction by IPTG after12 h,3:The supernatant after ultrasonic disruption,4:The precipitation after ultrasonic disruption,M:Protein marker; (b) SDS-PAGE electrophoresis of the recombinant Iso-ARah3,M:Protein marker,1:The purified fusion protein.

2.5 多克隆抗體的制備及檢測

對新西蘭兔進行4次免疫并分別對四次的血清進行間接ELISA檢測及酶標(biāo)儀檢測。結(jié)果顯示，三免后抗血清效價：A:16K，B:16K；四免后抗血清效價：A:512K，B:512K；終放后抗血清在稀釋了512千倍時，抗體還可以產(chǎn)生可觀察到的免疫反應(yīng)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測其效價：A:512K，B:512K(圖8)。證明血清里抗體濃度高，特異性強，可以用于后續(xù)的蛋白印跡實驗。

分別對誘導(dǎo)前和純化后的融合蛋白進行Western Blot分析，結(jié)果顯示誘導(dǎo)前樣品在相應(yīng)位置(54kD)無信號，純化后樣品在相應(yīng)位置(54kD)有明顯信號，所獲免疫血清與誘導(dǎo)表達后的目的蛋白專一結(jié)合顯色(圖9)。證明所獲抗體確實是含iso-ARah3基因的抗體。

通過ChemiDocTM XRS+ system軟件進行灰度分析(圖10)。結(jié)果表明融合蛋白的純度為84.5%，證明符合制備抗體的純度。

圖8 血清ELISA效價檢測及酶標(biāo)儀測得數(shù)據(jù)圖Fig.8 The detection of antibody by ELISA and enzyme standard instrument注：a:三免血清ELISA及酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，b:四免血清ELISA及酶標(biāo)儀檢測結(jié)果，c:終放血后血清ELISA及酶標(biāo)儀檢測結(jié)果。Note:a:ELISA and enzyme standard instrument results of the third rabbit serum; b:ELISA and enzyme standard instrument results of the fourth rabbit serum; c:ELISA and enzyme standard instrument results of the final rabbit serum.

圖9 pET28a-isoARah3融合蛋白的Western Blot檢測Fig.9 Western Blot analysis of recombinant iso-ARah3注：1：純化后樣品，2：誘導(dǎo)前樣品。Note:1:Samples after purified，2:Samples before induction.

圖10 抗體灰度分析Fig.10 Gray analysis of antibody

3 討 論

國內(nèi)外學(xué)者普遍認為解決花生黃曲霉毒素污染的有效途徑是通過基因工程手段培育抗性品種。因此從復(fù)雜的抗性相關(guān)基因中篩選出重要基因就成了關(guān)鍵問題。類花生致敏原3(iso-ARah3)是花生主要致敏蛋白質(zhì)III(ARh3)的一個亞型，通過基因組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方法鑒定其表達活性與干旱及黃曲霉侵染相關(guān)。目前，有關(guān)該基因的結(jié)構(gòu)及功能研究都是與其致敏性相關(guān)。Kang等[14]克隆的iso-ARah3基因由510個氨基酸組成，具有低致敏性。鐘海峰等[15]采用Touchdown PCR技術(shù)從花生cDNA文庫中克隆了兩個片段長度為512bp的iso-ARah3同源基因，也鑒定出其具有低致敏性。本研究首次從該基因與花生抗黃曲霉角度出發(fā)，成功克隆了由510個氨基酸組成的iso-ARah3基因，與GenBank公布的序列比對，有1處堿基缺失，這處堿基是ARah3序列上的一個IgE結(jié)合位點，而IgE結(jié)合位點的多少決定了過敏原性的高低，因此推測iso-ARah3基因的過敏原性比ARah3低，這與Kang等的研究結(jié)果一致[14]。序列分析表明，絲氨酸和蘇氨酸比例高達7.1%和3.1%，推測其可能與蛋白質(zhì)磷酸化修飾有關(guān)，對維持蛋白質(zhì)活性具有重要作用。信號肽與蛋白質(zhì)的折疊和定位有一定關(guān)系，通過多種軟件預(yù)測該基因的信號肽，發(fā)現(xiàn)iso-ARah3基因N端具有20個氨基酸的信號肽，且發(fā)生剪切性很小，這為后期引物設(shè)計和蛋白純化提供了理論依據(jù)。該基因編碼的蛋白質(zhì)有8個α-螺旋和22個β-折疊及2個Cpuin-1的相對保守結(jié)構(gòu)域組成，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與其功能相關(guān)，因此功能區(qū)域的預(yù)測對了解其功能及作用機制具有重要意義。

花生是主要的食物過敏源之一，已經(jīng)報道的花生致敏蛋白有20多種，其中ARah1，ARah2和ARah3是主要的致敏蛋白，可以被50%以上的過敏者識別[16]。大多數(shù)花生致敏蛋白屬于花生貯藏蛋白質(zhì)家族，不僅具有致敏性，還與花生的抗性相關(guān)[17]。iso-ARah3是ARah3的一個亞型，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個致敏原因子。本研究克隆的iso-ARah3基因N端210個氨基酸序列與胰蛋白酶抑制因子(登錄號為AF487543)的同源性較高，達到83.60%，這表明該基因很可能具有胰蛋白酶抑制因子的活性。而且該基因編碼的蛋白質(zhì)與花生中其他貯藏蛋白具有同源性，與ARah3和ARah4的同源性分別達到96%和72%。前人研究表明，花生中的致敏蛋白ARah2、ARah3及ARah4具有胰蛋白酶抑制劑的活性[18-19]，進一步說明，作為同源致敏蛋白的iso-ARah3也具有胰蛋白酶抑制劑的活性。胰蛋白酶抑制劑是一類參與植物防御機制的貯藏蛋白，主要存在于植物的種子中[20]。目前，在許多作物中都成功克隆了胰蛋白酶抑制因子基因，并鑒定其具有抑制黃曲霉的功能[21-23]。梁炫強等[24]通過對花生粗體蛋白的研究，表明胰蛋白酶抑制劑具有體外抑制黃曲霉孢子生成的功能。Chen等[25]通過對玉米的研究，鑒定出14kD的胰蛋白酶抑制劑(TI)，通過對純化的TI蛋白和黃曲霉菌及其他真菌共同培養(yǎng)，證明其具有抑制黃曲霉真菌生長的功能。因此進一步推測iso-ARah3基因與花生抗黃曲霉毒素侵染相關(guān)。但要了解該基因的功能，還需要在蛋白質(zhì)水平上進行深入研究。

通過原核表達載體的構(gòu)建進行蛋白體外表達，具有操作簡便、蛋白表達量高、節(jié)省時間等優(yōu)點。因此本實驗選用具有6個組氨酸標(biāo)簽的pET28a(+)為載體，將iso-ARah3基因進行體外融合蛋白的表達，成功獲得了54kD純化蛋白，這比生物信息學(xué)預(yù)測的結(jié)果(58kD)小，可能是由于在表達前通過引物的設(shè)計已經(jīng)把基因N端信號肽序列切除，而預(yù)測蛋白分子量大小是以完整的氨基酸序列進行的，所以其表達的蛋白最終會比預(yù)測的略小。純化的蛋白免疫新西蘭兔，得到了效價高、靈敏度和特異性好的多克隆抗體，該抗體可以識別iso-ARah3融合蛋白，且具有較高的純度。多克隆抗體的成功制備為進一步研究花生iso-ARah3基因的內(nèi)源表達和蛋白功能奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究成功克隆了花生iso-ARah3基因。序列分析表明其具有510個氨基酸， N端210個氨基酸序列與胰蛋白酶抑制因子的同源性較高，達83.60%。iso-ARah3蛋白與花生其他種子貯藏蛋白質(zhì)具有同源性。成功獲得并純化了該基因的重組蛋白。經(jīng)過免疫新西蘭兔，獲得了效價高達1∶512000的多克隆抗體，Western Blot顯示所制備的抗體具有特異性，純度為84.5%。這為今后iso-ARah3基因的內(nèi)源表達調(diào)控和功能的研究搭建了一個很好的平臺。

[1] 羅自生,秦雨,徐艷群,等.黃曲霉毒素的生物合成、代謝和毒性研究進展[J].食品科學(xué),2015,36(3):250-257.

[2] Payne G A,Brown M P.Genetics and physiology of aflatoxin biosynthesis [J].Annual Review of Phytopathology,1998,36(4):329-62.

[3] 胡東青,龐國興,張治宇,等.出口花生黃曲霉毒素污染的預(yù)防與控制[J].花生學(xué)報,2011,40(1):36-38.

[4] Eapen S,George L.Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer in peanut (ArachishypogaeaL.) [J].Plant cell reports,1994,13(10):582-586.

[5] Chen Z Y,Brown R L,Rajasekaran K,et al.Identification of a maize kernel pathogenesis-related protein and evidence for its involvement in resistance toAspergillusflavusinfection and aflatoxin production [J].Phytopathology,2006,96(1):87-95.

[6] Baker R L,Brown R L,Chen Z Y,et al.A maize lectin-like protein with antifungal activity againstAspergillusflavus[J].Journal of Food Protection,2009,72(1):120-127.

[7] Oberschall A,Deak M,Torok K,et al.A novel aldose/aldehyde reductase protects transgenic plants against lipid peroxidation under chemical and drought stresses [J].The Plant Journal,2000,24(4):437-446.

[8] Rabjohn P,Helm E M,Stanley J S,et al.Molecular cloning and epitope analysis of the peanut allergen Arah3 [J].The Journal of clinical investigation,1999,103(4):535-542.

[9] 王通,梁炫強,李玲.花生致敏原的研究進展[J].中國油料作物學(xué)報,2007,29(3):353-358.

[10] Liang X Q,Luo M,Holbrook C C,et al.Storage protein profiles in Spanish and Runner market type peanuts and potential markers [J].Bmc Plant Biology,2006,6(5):1-9.

[11] Wang T,Zhang E H,Chen X P,et al.Identification of seed proteins associated with resistance to pre-harvested aflatoxin contamination in peanut (ArachishypogaeaL.) [J].Bmc Plant Biology,2010,10(1):1-11.

[12] 王通.花生抗黃曲霉相關(guān)基因的表達分析及AhGLP家庭基因的功能研究[D].華南師范大學(xué),2011.

[13] Marchlerbauer A,Lu S,Anderson J B,et al.CDD:a Conserved Domain Database for the functional annotation of proteins [J].Nucleic Acids Research,2011,39 (Database issue):D225-D229.

[14] Kang I H,Gallo M.Cloning and characterization of a novel peanut allergen Arah3 isoform displaying potentially decreased allergenicity [J].Plant science,2007,172(2):345-353.

[15] 鐘海峰,馬三梅,王永飛,等.花生過敏原iso-Arah3的克隆、表達和免疫學(xué)鑒定[J].植物生理學(xué)報,2009(10):958-962.

[16] Koppelman S J,Vlooswijk R A A,Knippels L M J,et al.Quantification of major peanut allergens Arah1 and Arah2 in the peanut varieties Runner,Spanish,Virginia,and Valencia,bred in different parts of the world [J].Allergy,2001,56(2):132-137.

[17] Breiteneder H,Ebner C.Molecular and biochemical classification of plant-derived food allergens [J].Journal of Allergy and Clinical Immunology,2000,106(1):27-36.

[18] Maleki S J,Viquez O,Jacks T,et al.The major peanut allergen,Arah2,functions as a trypsin inhibitor,and roasting enhances this function [J].Journal of Allergy and Clinical Immunology,2003,112(1):190-195.

[19] Dodo H W,Viquez O M,Maleki S J,et al.cDNA clone of a putative peanut (ArachishypogaeaL.) trypsin inhibitor has homology with peanut allergens Arah3 and Arah4[J].Journal of agricultural and food chemistry,2004,52(5):1404-1409.

[20] Liao H,Ren W,Kang Z,et al.A trypsin inhibitor fromCassiaobtusifoliaseeds:isolation,characterization and activity againstPierisrapae[J].Biotechnology letters,2007,29(4):653-658.

[21] Tripathi V R,Kumar S,Garg S K.A study on trypsin,AspergillusflavusandBacillussp.protease inhibitory activity inCassiatora(L.)synSennatora(L.) Roxb.seed extract[J].Bmc Complementary & Alternative Medicine,2011,11(1):1-8.

[22] Benjakul S,Visessanguan W,Thummaratwasik P.Isolation and characterization of trypsin inhibitors from some Thai legume seeds[J].Journal of Food Biochemistry,2000,24(2):107-127.

[23] Yeh K W,Chen J C,Lin M I,et al.Functional activity of sporamin from sweet potato (IpomoeabatatasLam.):a tuber storage protein with trypsin inhibitory activity[J].Plant molecular biology,1997,33(3):565-570.

[24] 梁炫強,潘瑞熾.花生種子胰蛋白酶抑制劑與抗黃曲霉侵染的關(guān)系[J].作物學(xué)報,2003,29(2):295-299.

[25] Chen Z Y,Brown R L,Lax A R,et al.Resistance toAspergillusflavusin corn kernels is associated with a 14-kDa protein[J].Phytopathology,1998,88(4):276-281.

Gene Cloning of Peanutiso-ARah3 and Preparation of Its Polyclonal Antibody

JIANG Huan-huan1,2,HAO Cui-cui3,CHI Xiao-yuan1,WANG Mian1,CHEN Na1, CHEN Ming-na1,PAN Li-juan1,QI Pei-shi2,WANG Tong1,YU Shan-lin1

(1.ShandongPeanutResearchInstitute,Qingdao266100,China; 2.SchoolofMunicipalandEnvironmentalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150001,China;3.CollegeofChemicalEngineering,QingdaoUniv.ofScienceandTechnology,Qingdao266042,China)

Iso-ARah3 is a homologue of the peanut Allergen III (ARah3).And its expression in peanut seeds was induced significantly by the invasion ofAspergillusflavus.In this study,the full-length sequence ofiso-ARah3 gene was cloned through RT-PCR technology from cDNA library of peanut seeds.And the open reading frame (ORF) ofiso-ARah3 with 1533bp encoded 510 amino acids.The N-terminal of this protein had a signal peptide sequence (MAKLLALSLCFCVLVLGASS).And alignment analysis showed that the cloned sequence with a deletion mutation was highly homologous as 83.6% to the trypsin inhibitor of peanut.The recombinant plasmid pET28a-isoARah3 was constructed,and the fusion protein His-isoARah3 was super-expressed inE.coliBL21 under induction of IPTG.SDS-PAGE analysis showed that the fusion protein was approximately 54kD.Then the fusion protein was purified and used as antigen to inject rabbits for four times.The prepared polyclonal antiserum was obtained and purified.And indirect ELISA analysis showed that the anti-isoARah3 polyclonal antibodies have good sensitivity and high specificity with a titer of 1:512000.Furthermore,the polyclonal antibody was used to test the expression of fusion protein inE.coliBL21 through Western Blot,and detected a specific band at 54kD.It suggested that anti-isoARah3 polyclonal antibodies have high specificity and sensitivity.Our results are useful for further functional studies of peanutiso-ARah3.

peanut;Aspergillusflavus; sequence analysis; prokaryotic expression; polyclonal antibody

10.14001/j.issn.1002-4093.2016.04.002

2016-09-06

2014年國家“萬人計劃”青年拔尖人才；國家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-14)；山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2014YL011；ZR2014YL012)；國家自然科學(xué)基金項目(31200211)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項目(2016YQN14)

姜煥煥(1989-)，女，黑龍江肇源人，在讀博士，主要從事花生遺傳育種及PGPR與植物互作關(guān)系研究。

*通訊作者：王通，博士，主要從事花生抗黃曲霉機制及遺傳育種研究。E-mail:wtwtp@126.com

S565.2; Q785

A

禹山林，研究員，主要從事花生遺傳育種研究。E-mail:yshanlin1956@163.com