正常生理和1型糖尿病病理下慢性生長(zhǎng)激素刺激對(duì)肝臟胰島素信號(hào)的影響

信思易，葉火旺，胡先福，蘇沛珠，林建華，何濟(jì)滿，3

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科暨廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州市臨床醫(yī)學(xué)研究與轉(zhuǎn)化中心，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科； 3.美國(guó)布朗大學(xué)

正常生理和1型糖尿病病理下慢性生長(zhǎng)激素刺激對(duì)肝臟胰島素信號(hào)的影響

信思易1，葉火旺1，胡先福1，蘇沛珠1，林建華2，何濟(jì)滿1，3

1.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科暨廣東省胃腸疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣州市臨床醫(yī)學(xué)研究與轉(zhuǎn)化中心，廣東 廣州 510515；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院肝膽外科； 3.美國(guó)布朗大學(xué)

目的 研究1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)狀態(tài)下長(zhǎng)期生長(zhǎng)激素(growth hormone,GH)治療對(duì)肝臟胰島素信號(hào)的影響及其可能機(jī)制。方法 用慢性GH注射健康小鼠與鏈尿佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的T1DM小鼠，Western blotting檢測(cè)Akt和PTEN等。結(jié)果 在健康Balb/c小鼠，GH慢性刺激可抑制肝內(nèi)胰島素信號(hào)通路分子Akt磷酸化(P<0.05)，而該信號(hào)通途的負(fù)調(diào)控分子PTEN表達(dá)則顯著增加(P<0.05)；在T1DM C57BL/6小鼠，慢性GH刺激同樣抑制肝內(nèi)Akt磷酸化(P<0.05)，而PTEN表達(dá)水平則無顯著改變(P>0.05)。同時(shí)檢測(cè)胰島素信號(hào)的另一個(gè)負(fù)調(diào)節(jié)因子p85調(diào)節(jié)亞基，當(dāng)經(jīng)慢性GH刺激后，其表達(dá)水平在兩種小鼠中均沒有變化(P>0.05)。結(jié)論 長(zhǎng)期使用GH治療可以抑制肝臟胰島素信號(hào)，其機(jī)制涉及PTEN表達(dá)的升高，但其病理狀態(tài)下的機(jī)制則不同。

生長(zhǎng)激素；胰島素抵抗；PTEN；PI3K通路；1型糖尿病

生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)在臨床上應(yīng)用廣泛[1-4]，如用于治療GH缺乏癥、矮小癥、宮內(nèi)生長(zhǎng)遲緩、先天性卵巢發(fā)育不全綜合征、嚴(yán)重?zé)齻?、膿毒癥、急性重癥胰腺炎、炎癥性腸病、慢性腎臟病等。然而，長(zhǎng)期應(yīng)用GH治療可以引起各種副作用，如腫瘤、胰島素抵抗(insulin resistance，IR)等，其機(jī)制尚不明確。所謂IR，即IR個(gè)體血液中同樣濃度的胰島素所產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)(即對(duì)代謝的影響)比正常者降低。這是慢性GH治療的一個(gè)主要副作用。1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)，又名胰島素依賴型糖尿病，是指胰島素分泌不足，因而伴隨其他系列的病理癥狀。本文通過建立T1DM小鼠模型，研究慢性GH在胰島素缺乏病理狀態(tài)下的副作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料雄性6～8周齡Balb/c小鼠30只和雄性6～8周齡C57BL/6小鼠50只由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心購入，在南方醫(yī)院動(dòng)物房按SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。重組生長(zhǎng)激素購自Fizgerald公司，戊巴比妥鈉購自美國(guó)Merk公司，小鼠血漿胰島素購自ELISA試劑盒Cusmo Bio公司，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑(ECL)試劑盒購自中國(guó)碧云天公司，鏈脲佐菌素(STZ)購自美國(guó)Sigma公司，p-Akt購自Santa Cruz公司，PTEN購自ENZO公司，P85購自CST公司，β-actin和GAPDH購自中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥：健康小鼠：將30只Balb/c小鼠隨機(jī)分成對(duì)照1組和慢性GH刺激組，每組15只。每天下午3:00～5:00，慢性GH刺激組經(jīng)腹腔注射rhGH或rbGH(1 μg/g)，對(duì)照1組則腹腔注射等體積的無菌生理鹽水，持續(xù)3周。

T1DM小鼠模型：將50只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照2組(n=20)和STZ組(n=30)，STZ組連續(xù)3 d腹腔注射STZ(120 g/kg)，對(duì)照2組腹腔注射等體積檸檬酸鈉。3 d后測(cè)量空腹血糖、體質(zhì)量，空腹血糖≥11.1 mmol/L即認(rèn)為T1DM造模成功，并納入下一步實(shí)驗(yàn)。將造模成功的T1DM小鼠隨機(jī)分成模型組(n=15)和糖尿病GH組(n=15)，每天下午3:00～5:00，糖尿病GH組經(jīng)腹腔注射rhGH(1 μg/g)，模型組則腹腔注射等體積的無菌生理鹽水，持續(xù)3周。

1.2.2 標(biāo)本采集與處理：完成3周慢性GH刺激后，臨處死前一天晚上11：00饑餓小鼠，并保證飲水充足。處死當(dāng)天凌晨5：30，先測(cè)量小鼠空腹體質(zhì)量，并在臨處死前10 min予腹腔注射重組人胰島素(2 IU/kg)或等量生理鹽水。處死前予腹腔注射戊巴比妥鈉，待小鼠麻醉充分后取肝、處死。

1.2.3 Western blotting蛋白印跡分析：研磨各組肝臟綠豆大小組織，提取蛋白行Western blotting檢測(cè)Akt磷酸化水平、PTEN及p85的表達(dá)水平。提取肝組織蛋白，8%聚丙烯酞胺SDS-PAGE恒壓電泳(濃縮膠60 V電泳20 min后，分離膠100 V電泳60 min)；恒定電流100 mA轉(zhuǎn)膜150 min；5%脫脂奶室溫封閉30 min，將PVDF膜置于雜交袋中室溫下孵育一抗1～2 h或4 ℃孵育4～6 h；按1∶3 000～1∶5 000稀釋二抗，PVDF膜與二抗在室溫下孵育30 min；PBS-T洗3～6次，每次10～15 min；顯影、發(fā)光。將膠片進(jìn)行掃描，依據(jù)目的條帶的分子量用Image J軟件分析各組目標(biāo)條帶的灰度值，以β-actin或GAPDH作為內(nèi)參，p-Akt以總Akt作為參照，以相應(yīng)蛋白條帶與β-actin或GAPDH或Akt的比值計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 慢性GH對(duì)健康小鼠和T1DM小鼠體質(zhì)量變化的影響健康小鼠：經(jīng)過3周慢性GH刺激后，對(duì)照1組和慢性GH刺激組小鼠的體質(zhì)量均較前明顯增加；但慢性GH刺激組的體質(zhì)量增加幅度顯著高于對(duì)照1組(P=0.008，見圖1A)。T1DM小鼠：經(jīng)過3周慢性GH刺激后，模型組和糖尿病GH組小鼠的體質(zhì)量均有明顯下降，但糖尿病GH組的體質(zhì)量減輕幅度顯著低于模型組(P=0.017，見圖1B)。

圖1 慢性GH刺激后小鼠體質(zhì)量變化 A：健康小鼠；B：T1DM小鼠

2.2 胰島素信號(hào)p-Akt進(jìn)一步檢查胰島素信號(hào)狀態(tài)的標(biāo)志蛋白Akt的活性水平發(fā)現(xiàn)，慢性GH刺激后的健康小鼠比對(duì)照1組的Akt磷酸化水平顯著下降(P=0.018，見圖2A)。同樣，慢性GH刺激后的糖尿病GH組小鼠比模型組小鼠的Akt磷酸化水平也顯著下降(P=0.041，見圖2B)。

2.3 負(fù)調(diào)控分子PTEN的作用結(jié)果顯示，經(jīng)慢性GH刺激后，與對(duì)照1組相比，慢性GH刺激組小鼠的PTEN表達(dá)水平顯著增加(P=0.032，見圖3A)。然而，T1DM小鼠經(jīng)慢性GH刺激后(糖尿病GH組)的PTEN表達(dá)水平較模型組則無顯著改變(P=0.199，見圖3B)。

2.4 調(diào)節(jié)亞基p85表達(dá)水平Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，健康小鼠：與對(duì)照1組相比，經(jīng)慢性GH刺激后(慢性GH刺激組)，p85表達(dá)水平?jīng)]有顯著改變(P=0.680，見圖4A)。同樣，與模型組相比，T1DM小鼠在慢性GH刺激后(糖尿病GH組)，p85表達(dá)水平也沒有顯著改變(P=0.518，見圖4B)。

圖2 小鼠肝內(nèi)Akt磷酸化水平 A：健康小鼠；B： T1DM小鼠

圖3 小鼠肝臟組織PTEN表達(dá)水平 A：健康小鼠；B： T1DM小鼠

圖4 小鼠肝臟組織p85表達(dá)水平 A：健康小鼠；B：T1DM小鼠

3 討論

本研究中，GH刺激對(duì)健康小鼠和T1DM小鼠都有明顯的副作用，不但體質(zhì)量變化異常，而且胰島素信號(hào)受到明顯抑制。健康小鼠肝臟胰島素信號(hào)的抑制，可能與慢性GH導(dǎo)致該信號(hào)通路負(fù)調(diào)控因子PTEN表達(dá)增加有關(guān)，而T1DM小鼠的機(jī)制則不一樣。

STZ誘導(dǎo)小鼠生成T1DM后，體質(zhì)量出現(xiàn)降低。這可能是由于STZ誘導(dǎo)損傷后，短時(shí)間內(nèi)小鼠的不適應(yīng)造成。盡管這樣，慢性GH治療后，仍然對(duì)體質(zhì)量有正向調(diào)節(jié)作用，這也是為什么T1DM小鼠慢性GH刺激組比對(duì)照組小鼠體質(zhì)量減輕幅度小的原因。

有研究報(bào)道顯示，PTEN抑制Insulin/PI3K/Akt的激活后，可以增加胰島素β細(xì)胞的體積[7]。這說明PTEN可能參與該活性信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，但其具體機(jī)制尚不明確。而2型糖尿病T2DM小鼠中，胰島素的PTEN表達(dá)顯著上調(diào)[8]，這體現(xiàn)了PTEN的負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)。然而，在T1DM中，當(dāng)我們用慢性GH刺激后，PTEN沒有表現(xiàn)出明顯的調(diào)節(jié)機(jī)制。該結(jié)果可能說明了PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)的多態(tài)性。

STZ廣泛地用于誘導(dǎo)糖尿病生成動(dòng)物模型，通過誘導(dǎo)胰島素β細(xì)胞死亡導(dǎo)致小鼠體內(nèi)胰島素分泌減少，進(jìn)而導(dǎo)致高血糖、糖尿病的發(fā)生[9]。我們?cè)谛∈骉1DM模型中對(duì)GH慢性刺激負(fù)作用的研究結(jié)果是否反應(yīng)臨床人體病理狀態(tài)的結(jié)果，目前還不清楚。這也影響到本研究進(jìn)一步試驗(yàn)的計(jì)劃。

最后，作為活性信號(hào)PI3K/Akt信號(hào)通路的兩個(gè)主要負(fù)調(diào)控分子，PTEN和p85調(diào)節(jié)亞基，在信號(hào)調(diào)節(jié)中表現(xiàn)出了不同步性。在健康小鼠中，慢性GH刺激后，PTEN的表達(dá)顯著升高，但p85沒有變化。這可能說明，這兩個(gè)蛋白，只要一個(gè)表現(xiàn)出抑制，足以對(duì)整個(gè)信號(hào)通路產(chǎn)生抑制。

[1]Mo D, Hardin DS, Erfurth EM, et al. Adult mortality or morbidity is not increased in childhood-onset growth hormone deficient patients who received pediatric GH treatment: an analysis of the Hypopituitary Control and Complications Study (HypoCCS) [J]. Pituitary, 2014, 17(5): 477-485.

[2]Kaspers S, Ranke MB, Han D, et al. Implications of a data-driven approach to treatment with growth hormone in children with growth hormone deficiency and Turner syndrome [J]. Appl Health Econ Health Policy, 2013, 11(3): 237-249.

[3]Wiezel D, Assadi MH, Landau D, et al. Impaired renal growth hormone JAK/STAT5 signaling in chronic kidney disease [J]. Nephrol Dial Transplant, 2014, 29(4): 791-799.

[4]Wang F, Qiu L. Advancement in the research of growth hormone in treating pediatric burn patients [J]. Chin J Burns, 2013, 29(1): 18-21. 王飛, 邱林. 生長(zhǎng)激素治療兒童燒傷的研究進(jìn)展[J]. 中華燒傷雜志, 2013, 29(1): 18-21.

[5] Nicholson KM, Anderson NG. The protein kinase B/Akt signalling pathway in human malignancy [J]. Cell Signal, 2002, 14(5): 381-395.

[6]Zhong QA, Qiu XQ, Jiang JJ, et al. Association between diabetes mellitus and hepatocellular carcinoma: a Meta-analysis of cohort study [J]. Cancer Research on Prevention and Treatment, 2005, 12(13): 755-757. 鐘秋安, 仇小強(qiáng), 蔣俊俊, 等. 糖尿病與原發(fā)性肝癌關(guān)系隊(duì)列研究的Meta分析[J]. 腫瘤防治研究, 2005, 12(13): 755-757.

[7]Stiles BL, Kuralwalla-Martinez C, Guo W, et al. Selective deletion of Pten in pancreatic beta cells leads to increased islet mass and resistance to STZ-induced diabetes [J]. Mol Cell Biol, 2006, 26(7): 2772-2781.

[8]Wang L, Liu Y, Yan Lu S, et al. Deletion of Pten in pancreatic β-cells protects against deficient β-cell mass and function in mouse models of type 2 diabetes [J]. Diabetes, 2010, 59(12): 3117-3126.

[9]Bennett RA, Pegg AE. Alkylation of DNA in rat tissues following administration of streptozotocin [J]. Cancer Res, 1981, 41(7): 2786-2790.

(責(zé)任編輯：王全楚)

The influence of chronic growth hormone stimulation on hepatic insulin signal under normal physiological and T1DM condition

XIN Siyi1, YE Huowang1, HU Xianfu1, SU Peizhu1, LIN Jianhua2, HE Jiman1,3

1.Department of Gastroenterology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515; 2.Department of Hepatobiliary Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University; 3.Brown University, America

Objective To research the influence and possible mechanism of chronic growth hormone (GH) on hepatic insulin signal under type 1 diabetes mellitus (T1DM) condition.Methods Chronic GH induced insulin resistance in mice with T1DM which induced by Streptozocin (STZ). Then hepatic Akt phosphorylation and PTEN were detected by Western blotting.Results In healthy mice, chronic GH treatment inhibited hepatic p-Akt. PTEN expression was increased (P<0.05). In T1DM mice, chronic GH caused similar inhibition of p-Akt (P<0.05), but PTEN expression did not change (P>0.05). The p85 expression did not change in both health and T1DM mice after chronic GH treatment (P>0.05).Conclusion Long-term use of chronic GH treatment can inhibite hepatic insulin signaling and the mechanism involves the increasing PTEN expression, but the underlying mechanism is different in pathological status.

Growth hormone; Insulin resistance; PTEN; PI3K; Type 1 diabetes mellitus

國(guó)家自然科學(xué)基金(81170743)

信思易，碩士，研究方向：胃腸道疾病。E-mail：xinsiyi_122744763@163.com

何濟(jì)滿，博士，教授，研究方向：胰島素抵抗與疾病。E-mail：jimanhe@smu.edu.cn

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.022

R575

A

1006-5709(2016)01-0080-04

2015-05-27