SN50聯(lián)合5-氟尿嘧啶通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制人胃癌裸鼠移植瘤生長的研究

劉 靜， 劉 婷， 徐睿玲， 王新紅， 劉冰熔

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086

論著·胃癌

SN50聯(lián)合5-氟尿嘧啶通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路抑制人胃癌裸鼠移植瘤生長的研究

劉 靜， 劉 婷， 徐睿玲， 王新紅， 劉冰熔

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150086

目的 探討NF-κB通路抑制劑SN50聯(lián)合5-氟尿嘧啶(5-FU)對人胃癌裸鼠移植瘤生長的影響及機(jī)制。方法 建立熒光素酶標(biāo)記的人胃癌細(xì)胞株SGC7901，常規(guī)傳代培養(yǎng)，采用對數(shù)生長期細(xì)胞建立人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型。14 d后隨機(jī)分為4組：對照組、5-FU干預(yù)組、SN50干預(yù)組、5-FU+SN50干預(yù)組。每組8只動物，共給藥4周。觀察并記錄各組裸鼠皮下移植瘤的生長情況，游標(biāo)卡尺測量瘤體長短徑，于停藥次日處死裸鼠，稱取瘤重，計算腫瘤體積、腫瘤生長抑制率、繪制腫瘤生長曲線。通過體內(nèi)可見光成像技術(shù)分別于第1、7、14、21、28天對裸鼠進(jìn)行活體成像，記錄移植瘤光子數(shù)，繪制皮下移植瘤光子數(shù)曲線圖。免疫組化方法檢測移植瘤中NF-κBp65表達(dá)情況。結(jié)果 與其他三組相比，5-FU+SN50干預(yù)組腫瘤體積、抑瘤率及光子數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組及SN50干預(yù)組比較，5-FU干預(yù)組腫瘤體積和光子數(shù)明顯減少(P<0.05)，抑瘤率明顯增加(P<0.05)；SN50干預(yù)組與對照組相比，腫瘤體積、抑瘤率及光子數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。NF-κBp65陽性率依次為對照組47.4%、5-FU組57.1%、SN50組11.8%、5-FU+SN50組25.0%。結(jié)論 5-FU單藥及5-FU+SN50均能抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生長，而聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯；SN50可通過抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，顯著增強(qiáng)5-FU對裸鼠胃癌皮下移植瘤的抑制作用。

核轉(zhuǎn)錄因子-κB；胃癌；SN50；5-氟尿嘧啶

對于進(jìn)展期胃癌患者來說，全身的化學(xué)治療是主要的治療手段之一，然而大部分腫瘤對化療藥物具有不同程度的抗藥性，這常常是治療失敗的主要原因。如何提高胃癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，是進(jìn)展期胃癌治療的關(guān)鍵。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞存亡的重要因子，其活化可調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)[1]，使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，是目前已知的影響化療效果最重要的機(jī)制之一。SN50是一種活性多肽，它的結(jié)構(gòu)與P50相似，可以競爭性抑制P50與細(xì)胞核內(nèi)DNA的結(jié)合，從而阻斷NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化[2-3]。近年，在胃癌的化學(xué)治療上取得了很大進(jìn)步，如對5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)的認(rèn)識更加深刻，故將常規(guī)化療藥物與NF-κB通路抑制劑聯(lián)合應(yīng)用是一種切實(shí)可行的腫瘤治療方法。本研究聯(lián)合應(yīng)用NF-κB通路抑制劑SN50與5-FU，以期待更有效的抑制胃癌裸鼠移植瘤的生長，為胃癌的臨床化療與靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料胃癌細(xì)胞株SGC7901購自中科院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫。BABL/c雄性裸小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動物合格證編號：2007000527363。5-FU購自天津金耀氨基酸有限公司。SN50購自美國Sigma公司。含高糖的DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司。胎牛血清購自美國HyClone公司。水合氯醛購自揚(yáng)州市奧鑫助劑廠。D-熒光素鉀購自北京中科匯文遺傳技術(shù)發(fā)展中心。鼠抗人NF-κBp65多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。免疫組化化學(xué)染色SP試劑盒及DAB染色試劑盒購自福建邁新公司。

1.2 方法

1.2.1 建立熒光素酶標(biāo)記的胃癌細(xì)胞株SGC7901：實(shí)驗(yàn)委托上海英為信科技有限公司完成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)：人胃癌細(xì)胞株SGC7901于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，生長于含有10%滅活胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 mg/ml)的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞每2～3 d傳代一次，所有實(shí)驗(yàn)采用對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.3 建立裸鼠皮下移植瘤模型：選取BABL/c雄性裸小鼠32只，鼠齡4周，體質(zhì)量18～20 g。將對數(shù)期生長的人胃癌細(xì)胞株SGC7901制備成5×107/ml的懸液，用1 ml注射器抽取單細(xì)胞懸液0.2 ml，于裸鼠背側(cè)近右后臀部接種，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘。14 d后所有裸鼠皮下均出現(xiàn)約5 mm的皮下結(jié)節(jié)，裸鼠皮下移植瘤均建立成功。

1.2.4 分組及給藥：待腫瘤平均直徑約5 mm后，將裸鼠隨機(jī)分為對照組、5-FU干預(yù)組、SN50干預(yù)組及5-FU+SN50干預(yù)組，每組8只。對照組：0.2 ml/d無菌生理鹽水腹腔注射，3次/d；5-FU干預(yù)組：5-FU 25 mg·kg-1·d-1腹腔注射，3次/周；SN50干預(yù)組：SN50 400 μg/kg腹腔注射，3次/周；5-FU+SN50干預(yù)組：5-FU 25 mg·kg-1·d-1和SN50 400 μg/kg腹腔注射，3次/周。共給藥4周，停藥次日采用頸椎脫臼法處死裸鼠，測量腫瘤重量、計算抑瘤率。

觀測指標(biāo)：(1)腫瘤體積測量：注藥后每7 d用游標(biāo)卡尺測量移植瘤長徑(a)、短徑(b)，計算腫瘤體積：V=1/2a×b2；繪制BALB/c裸小鼠皮下移植瘤生長曲線；(2)抑瘤率：處死裸鼠后剝出瘤塊，用電子天平稱取瘤重(W)，抑瘤率(%)=(對照組平均瘤重-用藥組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.2.5 體內(nèi)可見光成像技術(shù)：通過IVIS成像系統(tǒng)分別在給藥的第1、7、14、21、28天對裸鼠進(jìn)行活體成像。每組隨機(jī)選取裸鼠4只，先腹腔注射熒光素酶底物200 μl，使裸鼠充分活動以至底物快速吸收入血，5 min后給予10%的水合氯醛50 μl，待裸鼠麻醉后，將其放入暗箱中合適位置，擺好體位，關(guān)好暗箱門，獲取圖像及光子數(shù)。

1.2.6 免疫組化法：所有組織標(biāo)本離體后采用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，免疫組化染色所用一抗NF-κBp65的工作濃度為1∶300。結(jié)果判斷：用PBS代替一抗作為陰性對照，用購買試劑公司所提供的已知NF-κBp65陽性切片作為陽性對照，以細(xì)胞染為黃色到棕黃色為陽性標(biāo)準(zhǔn)，按陽性細(xì)胞的數(shù)量及染色強(qiáng)度將陽性定為3級，400倍計數(shù)至少5個隨機(jī)視野，取平均值，陽性細(xì)胞數(shù)<10%計為陰性，陽性細(xì)胞數(shù)占10%～29%為+，30%～59%為++，>60%為+++，采用盲法計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤體積的變化對照組、SN50干預(yù)組、5-FU干預(yù)組、SN50+5-FU干預(yù)組在治療初期腫瘤體積均逐漸增大，但對照組和SN50干預(yù)組生長速度更快，二者移植瘤體積變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。從第14天開始5-FU干預(yù)組和5-FU+SN50干預(yù)組與對照組相比，移植瘤體積的變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；5-FU+SN50干預(yù)組對腫瘤生長的抑制作用顯著強(qiáng)于5-FU干預(yù)組(P<0.05，見表1)。

組別不同時段各組移植瘤體積第1天第7天第14天第21天第28天對照組132．7±17．43285．3±27．82419．6±21．16526．9±29．32712．4±37．2SN50干預(yù)組120．7±18．17264．2±26．13407．4±23．74537．3±31．23658．7±27．185?FU干預(yù)組143．6±20．54267．1±21．89 354．6±17．54☆# 417．8±27．56☆# 498．5±26．13☆#5?FU+SN50干預(yù)組127．4±21．54246．3±16．15 307．1±18．55☆#& 329．4±19．76☆#& 268．9±20．97☆#&

注：與對照組相比，☆P<0.05；與SN50干預(yù)組相比，#P<0.05；與5-FU干預(yù)組相比，&P<0.05。

2.2 抑瘤率的比較用藥后5-FU干預(yù)組及5-FU+SN50干預(yù)組腫瘤生長明顯減慢，瘤重顯著低于其他組，其抑瘤率分別為34.29%、56.24%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但SN50干預(yù)組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與其他三組相比，5-FU+SN50干預(yù)組抑瘤率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

表2 治療結(jié)束后各組移植瘤平均瘤重及抑瘤率的比較

Tab 2 Comparison of average tumor weight and inhibition rate after treatment

組別治療后瘤重(x±s，g)抑瘤率(%)對照組1．1282±0．16170SN50干預(yù)組1．0124±0．125610．255?FU干預(yù)組0．7617±0．1023☆34．29☆5?FU+SN50干預(yù)組 0．4937±0．0534☆#& 56．24☆#&

注：與對照組相比，☆P<0.05；與SN50干預(yù)組相比，#P<0.05；與5-FU干預(yù)組相比，&P<0.05。

2.3 生物發(fā)光檢測結(jié)果5-FU+SN50干預(yù)組移植瘤光子數(shù)治療前后無明顯變化，而對照組和SN50干預(yù)組移植瘤光子數(shù)顯著增加。與其他三組相比，5-FU+SN50干預(yù)組移植瘤光子數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。5-FU干預(yù)組與對照組相比，移植瘤光子數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而SN50干預(yù)組與對照組相比，移植瘤光子數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見圖1～2)。

圖1 各組移植瘤的光子數(shù)量比較

圖2 SN50和5-FU對人胃癌細(xì)胞株SGC7901裸鼠移植瘤的影響

2.4 免疫組化法檢測NF-κBp65的表達(dá)情況免疫組化結(jié)果顯示活化后的NF-κBp65定位胞核，免疫組化陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒狀，各組陽性率依次為：對照組47.4%、SN50組11.8%、5-FU組57.1%、SN50+5-FU組25.0%(見表3)?？梢?-FU可進(jìn)一步激活胃癌裸鼠皮下移植瘤組織中NF-κB通路的活化，而SN50干預(yù)后其活化程度下降。

表3 NF-κBp65在各組移植瘤中的表達(dá)

注：與對照組相比，☆P<0.05；與SN50干預(yù)組相比，#P<0.05；與5-FU干預(yù)組相比，&P<0.05。

3 討論

研究表明，在胃癌等許多惡性腫瘤組織、細(xì)胞株及動物模型中均能檢測到NF-κB的異?；罨痆4]。Li等[5]發(fā)現(xiàn)NF-κB在胃癌的4種細(xì)胞系A(chǔ)GC、MKN28、MKN45、SGC7901中均可被不同程度活化。也有研究表明，5-FU可進(jìn)一步激活胃癌細(xì)胞的NF-κB通路的活化，NF-κB通路活化后可調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生存、凋亡、血管生成[6-7]、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[8]等相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高腫瘤細(xì)胞的耐藥率，嚴(yán)重影響了腫瘤化學(xué)治療的效果。Camp等[9]研究發(fā)現(xiàn)5-FU和SN-38可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株AGC和NCI-N87中NF-κB的活化，用腺病毒IκBα超抑制物(Ad.IκBα-SR)預(yù)處理細(xì)胞后，可明顯提高化療藥物誘導(dǎo)的凋亡和生長抑制。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究NF-κB通路抑制劑SN50和化療藥物5-FU聯(lián)合應(yīng)用對胃癌裸鼠皮下移植瘤的作用。結(jié)果顯示與單用SN50和5-FU相比，5-FU+SN50干預(yù)組在腫瘤體積、抑瘤率及移植瘤光子數(shù)方面差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組化NF-κBp65表達(dá)情況，表明SN50可明顯抑制NF-κB通路活化，但無明顯抑制腫瘤生長效應(yīng)，可能因?yàn)槲赴┘?xì)胞可能通過激活其他通路如PI3K/AK1信號通路的活化[10]，調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞凋亡的相關(guān)因子的表達(dá)，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞逃避凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在對照組移植瘤組織中，NF-κB通路已被部分活化，而5-FU干預(yù)后該通路可被進(jìn)一步活化，SN50干預(yù)后該通路明顯被抑制。這也就提示5-FU+SN50干預(yù)組移植瘤體積及光子數(shù)明顯減少可能與NF-κB通路被抑制有關(guān)，因該通路被抑制后上調(diào)了促凋亡蛋白P53、Bax的表達(dá)[11]，而下調(diào)抑凋亡蛋白的表達(dá)，如腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子TRAF1和TRAF2、Bcl-2、細(xì)胞凋亡蛋白抑制物c-IAP和c-IAP2等的表達(dá)[12-15]，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本實(shí)驗(yàn)以熒光素酶標(biāo)記的人胃癌SGC7901細(xì)胞株裸鼠皮下移植瘤模型為研究對象，采用體內(nèi)可見光成像技術(shù)在不同的時間記錄藥物干預(yù)后裸鼠移植瘤的數(shù)據(jù)變化，初步探討了NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑SN50和5-FU聯(lián)用抑制胃癌細(xì)胞生長的效應(yīng)。結(jié)果提示，SN50與5-FU聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)對胃癌細(xì)胞株SGC7901裸鼠皮下移植瘤的抑制作用，為胃癌的臨床化療和靶向治療提供基礎(chǔ)理論支持并值得進(jìn)一步研究與探討。

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(責(zé)任編輯：馬 軍)

Study on growth inhibition of human gastric cancer xenografts in nude mice by SN50 combined with 5-fluorouracil regulating NF-κB signaling pathway

LIU Jing, LIU Ting, XU Ruiling, WANG Xinhong, LIU Bingrong

Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150086, China

Objective To investigate the growth inhibition of human gastric cancer xenografts in nude mice by SN50 combined with 5-fluorouracil (5-FU). Methods Human gastric cancer SGC7901 cell line was constructed to express firely luciferase, which was conventional serial subcultured. The models of human gastric cancer xenografts in nude mice were established, then randomly divided into 4 groups after 14 days as follows: control group, 5-FU group, SN50 group, 5-FU+SN50 group, the drugs mentioned above were administrated for 4 weeks. Bioluminescence imaging technique was applied at 1, 7, 14, 21, 28 days to nude mice. The xenograft tumor photon numbers were measured and subcutaneously transplanted tumor photon number curve was drawn. Nude mice were sacrificed the next day after drug withdrawal and the tumors were weighed. Treatment size of the xenografts were measured by vernier caliper. The tumor volume and tumor growth inhibiting rates were calculated and the curve tumor growth was drawn. The expression of NF-κBp65 was detected by immunohistochemistry in the xenografts. Results There were significant differences in average tumor volumes, inhibition rates and the photon number in the combined treatment group compared with the other groups (P<0.05). Compared with the control group and SN50 group, the average volumes and photon number of tumor were significantly lower in 5-FU group, while the growth inhibition rates of tumor were significantly higher (P<0.05). No statistical significances were found in average tumor volumes, inhibition rates and the photon number between SN50 group and control group (P>0.05). The positive rate of NF-κBp65 in each group as follows: control group 47.4%, 5-FU group 57.1%, SN50 group 11.8%, 5-FU+SN50 group 25.0%. Conclusion 5-FU only or combined with SN50 can inhibit gastric cancer tumor growth, and drug combination is more effective; SN50 can inhibit the activation of NF-κB signaling pathway to reduce expression of NF-κBp65 in tumor cells, significantly enhancing the growth inhibition of human gastric cancer xenografts in nude mice by 5-FU thereby.

Nuclear factor-kappa B; Gastric cancer; SN50; 5-fluorouracil

10.3969/j.issn.1006-5709.2016.01.002

國家自然科學(xué)基金(30871152)

劉靜，碩士研究生，研究方向：消化道腫瘤的基礎(chǔ)研究。E-mail：0liujing@163.com

劉冰熔，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)腫瘤的基礎(chǔ)研究。E-mail：liubingrong@medmail.com.cn

R735.2

A

1006-5709(2016)01-0005-04

2015-05-18