一種鑒別豬偽狂犬母源抗體與野毒感染的檢測方法的建立

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，江蘇省農(nóng)科院動物疫病診斷檢測中心，江蘇 南京 210014)

案例分析

一種鑒別豬偽狂犬母源抗體與野毒感染的檢測方法的建立

孫華偉，張敬峰，趙永前，張曉曦

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，江蘇省農(nóng)科院動物疫病診斷檢測中心，江蘇 南京 210014)

為探索一種鑒別16周齡以內(nèi)仔豬偽狂犬野毒感染與母源抗體的ELISA檢測方法，本研究通過對江蘇省農(nóng)科院動物疫病診斷檢測中心臨床門診2016年5月份接診的11頭16周齡以內(nèi)仔豬同時進行PRV-gpl抗體檢測，PCR檢測和PRV-gb抗體的檢測，結(jié)果該11頭豬的PRV-gpl抗體陽性率為100%，PCR檢測陽性率為54.5%（6/11)，同時對上述11份血清進行1∶40稀釋后檢測PRV-gb抗體，結(jié)果PRV-gb抗體陽性率為54.5%（6/11)，且PRV-gb抗體陽性豬只與PCR檢測陽性豬只的符合率為100%。本檢測方法的最大發(fā)現(xiàn)在于相同PRV-gb抗體水平的PRV感染仔豬與來自于母源抗體仔豬的血清在經(jīng)相同倍數(shù)的稀釋后，PRV-gb抗體陽性率不同。隨著血清稀釋倍數(shù)的不斷增大，PRV野毒感染豬只血清PRV-gb抗體下降的速度明顯較來自于母源抗體豬只的下降速度慢。并最終確定將血清1∶40稀釋為鑒別診斷的最佳稀釋倍數(shù)。雖然本次檢測的樣本量只有11份，但是100%的符合率仍具有較高的參考價值，為江蘇省乃至全國偽狂犬病的診斷與防控提供了有效數(shù)據(jù)參考，具有推廣價值。

豬偽狂犬?。荒冈纯贵w；野毒感染；鑒別；檢測方法

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(PRV)感染引起的以發(fā)熱、腦脊髓炎為典型癥狀，且嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的一類傳染病[1]。據(jù)中國期刊網(wǎng)從1990年到2000年10年間收錄的文獻，該病的報道僅為166篇，2001年到2011年10年間該病的文獻報道為1 165篇，但2012年到2015年3年間該病的文獻報道就多達783篇；其涉及范圍包括了我國大部分省市，且大多數(shù)為該病的診斷與治療及流行病學(xué)方面的文獻，表明2012年后該病發(fā)病多、范圍廣、對養(yǎng)豬業(yè)危害十分巨大[2]。PRV-gpl抗體檢測試劑盒雖然能夠用來進行PR野毒抗體的檢測，但由于PR的母源抗體最長可以維持到16周[3]。因此對gpl檢測結(jié)果為陽性的16周齡以內(nèi)的仔豬尚不能確定其抗體是來自于母源抗體還是豬只自身感染了偽狂犬野毒。本實驗通過對臨床接診16周齡以內(nèi)仔豬同時進行PCR檢測，PRV-gpl抗體檢測和PRV-gb抗體的檢測，以探索其中的規(guī)律，具體報告如下：

1 材料與方法

1．1 材料

來自江蘇省農(nóng)科院動物疫病診斷檢測中心臨床門診2016年5月份現(xiàn)場剖殺的11頭16周齡以內(nèi)仔豬。上述檢測于2016年5月在江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所動物疫病診斷檢測中心實驗室進行。

1．2 主要試劑及儀器

PRV-gpl抗體檢測試劑盒和PRV-gb抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司；基因組提取及PCR試劑盒等購自上海Sangon公司；酶標儀型號為寶特ExL800，美國寶特公司生產(chǎn)；冷凍離心機型號為Centrifuge5424R，產(chǎn)自德國；各種規(guī)格移液器，購自德國Eppendorf公司；恒溫箱水浴鍋等。

1．3 方法

PRV-gpl抗體檢測，PRV-gb抗體檢測及PCR檢測嚴格按照試劑盒說明書進行相關(guān)操作[美國IDEXX公司生產(chǎn)的PRV-gpl抗體檢測試劑盒和PRV-gb抗體檢測試劑盒的說明書中規(guī)定：血清2倍稀釋（1∶2）]。結(jié)果判定: PRV-gpl抗體檢測試劑盒和PRV-gb抗體檢測試劑盒的判斷標準均為：被檢樣品 S/N＞0.70，樣品判為陰性；被檢樣品 S/N≤0.60，樣品判為陽性；0.60＜S/N≤0.70，樣品判為可疑。

2 結(jié)果與分析

2．1 血清PRV-gpl抗體檢測結(jié)果

11頭16周齡以內(nèi)仔豬血清的PRV-gpl抗體結(jié)果見表1。

表1 PRV-gpl抗體檢測結(jié)果

圖1 PRV-PCR陽性豬只血清不同稀釋倍數(shù)的PRV-gb抗體

圖2 PRV-PCR陰性豬只血清不同稀釋倍數(shù)的PRV-gb抗體

由表1可知：11頭現(xiàn)場剖殺的16周齡以內(nèi)仔豬的PRV-gpl抗體結(jié)果均為陽性，但由于16周齡以內(nèi)仔豬尚存在母源抗體，因此不能確定是仔豬自身感染了偽狂犬野毒還是來自于母源抗體。碰巧本次檢測的11份樣品均為PRV-gpl抗體陽性，如果檢測結(jié)果為PRV-gpl抗體陰性，說明檢測豬只未感染偽狂犬野毒，可以直接進行診斷。

2．2 病料PRV PCR檢測結(jié)果

11頭16周齡以內(nèi)仔豬的腦組織PCR檢測結(jié)果見表2。

表2 病料PRV PCR檢測結(jié)果

由表2可知：上述11頭仔豬有6頭PCR檢測結(jié)果為陽性，陽性率為54.5%（6/11），即超過一半的臨床門診接診豬只存在PRV野毒感染。

2．3 血清40倍稀釋PRV-gb抗體檢測結(jié)果

11頭16周齡以內(nèi)仔豬的血清按1∶40稀釋后的PRV-gb抗體檢測結(jié)果見表3。

表3 血清1∶40稀釋PRV-gb抗體檢測結(jié)果

由表3可知：現(xiàn)場剖殺的11頭16周齡以內(nèi)仔豬的血清按1∶40稀釋后的PRV-gb抗體陽性率為54.5%（6/11），且該檢測結(jié)果與PCR檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%。

2．3 血清不同稀釋倍數(shù)的PRV-gb抗體檢測結(jié)果

11頭16周齡以內(nèi)仔豬的血清按不同倍數(shù)稀釋后的PRV-gb抗體檢測結(jié)果見表4、圖1和圖2。

表4 血清不同倍數(shù)稀釋PRV-gb抗體檢測結(jié)果

由表4、圖1和圖2可知：所有檢測豬只的血清隨著稀釋倍數(shù)的不斷增大，PRV-gb抗體水平都逐漸降低，但PRV-PCR陽性豬只血清PRV-gb抗體下降的速度明顯較PRV-PCR陰性豬只慢。當(dāng)將血清1∶2和1∶10稀釋時，所有檢測豬只均為PRV-gb抗體陽性，當(dāng)將血清1∶20稀釋時，PRV-PCR陰性豬有60%為PRV-gb抗體陽性，PRV-PCR陽性豬均為PRV-gb抗體陽性，當(dāng)將血清1∶40稀釋時PRV-PCR陰性豬均為PRV-gb抗體陰性，PRV-PCR陽性豬均為PRV-gb抗體陽性，與該11頭豬腦組織的PCR檢測結(jié)果完全一致，符合率為100%。當(dāng)將血清1∶80稀釋時PRV-PCR陰性豬均為PRV-gb抗體陰性，PRV-PCR陽性豬有40%為PRV-gb抗體陽性。通過對檢測豬只血清進行不同倍數(shù)稀釋后的PRV-gb抗體陽性率可以看出，當(dāng)將血清1∶40稀釋時，與檢測豬只的PRV-PCR的檢測結(jié)果完全符合。

雖然本次檢測的樣本量只有11份，但是6份PRV-PCR陽性豬只和5份PRV-PCR陰性豬只與對應(yīng)PRV-gb抗體陰陽性的符合率均為100%，仍具有較高的參考價值。當(dāng)然隨著樣本量的不斷擴大，符合率會有所下降，但在豬場實際生產(chǎn)中檢測抗體比檢測病原容易，所以可以只進行相應(yīng)的抗體檢測，就可較為準確地鑒別16周齡以內(nèi)仔豬是否感染了偽狂犬野毒。

3 討論

本檢測方法的最大發(fā)現(xiàn)在于相同PRV-gb抗體水平的PRV感染仔豬與來自于母源抗體仔豬的血清在經(jīng)相同倍數(shù)的稀釋后，PRV-gb抗體陽性率不同。隨著血清稀釋倍數(shù)的不斷增大，PRV野毒感染豬只血清PRV-gb抗體下降的速度明顯較來自于母源抗體豬只的下降速度慢。同時，PRV病原檢測困難，PRV感染豬幾乎不形成病毒血癥，因此在血液中檢出PRV的概率很低，同時PRV基因組GC含量達70%以上，設(shè)計檢測病毒的PRV引物難度較大[4]。因此，如果能夠?qū)ΤＲ?guī)的ELISA檢測方法進行摸索、創(chuàng)新和改進，將會是對目前檢測方法非常有益的補充。

[1] 斯勞特．豬病學(xué)：第10版[M]．趙德明，張仲秋，沈建忠，譯．8版．北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000.

[2] 孫華偉，趙永前，張敬峰，等．豬偽狂犬病的凈化策略[J]．豬業(yè)科學(xué)，2016，33（1）：59-61．

[3] Yu XIU LING，ZHOU ZHI，HU DONG MEI，et al．Pathogenic Pseudorabies Virus，China，2012[J]．Emerg Infect Dis，2014，20：l02-104．

[4] 陳弟詩．豬乙型腦炎病毒-細小病毒-偽狂犬病毒活載體疫苗的研究[D]．雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

2016-07-06)

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金 【編號：CX(13)3075】

孫華偉（1981- ），男，江蘇南京人，碩士，助理研究員，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，主要從事豬病的臨床診斷及重大疾病流行規(guī)律、診斷、監(jiān)測和控制技術(shù)研究。E-mail：sunhuawei66@163.com